米發(fā)糕的體外模擬胃腸消化特性研究

陳 晨 賈才華 趙思明 格桑卓瑪 張賓佳牛 猛 熊善柏 林親錄

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，武漢 430070)(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長(zhǎng)沙 410004)

食品中的多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)在人體內(nèi)不可被直接消化，然而經(jīng)體內(nèi)酶、pH等作用，可降解為小肽、游離氨基酸、單糖等易被消化吸收的物質(zhì)[1]。食物胃腸消化物的營(yíng)養(yǎng)成分可作為膳食營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)的重要手段。米發(fā)糕經(jīng)胃腸消化后，產(chǎn)生小分子活性肽、低聚糖等成分，易被腸道消化吸收而直接在機(jī)體內(nèi)起作用。經(jīng)不同菌種發(fā)酵后，由于微生物產(chǎn)生的酶對(duì)米發(fā)糕營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用位點(diǎn)不同，使得其營(yíng)養(yǎng)成分如肽和糖的組成和結(jié)構(gòu)有差異，導(dǎo)致其生物活性不同[2]。消化使米發(fā)糕蛋白質(zhì)得到充分的降解，在胃腸消化物中暴露出更多具有抗氧化作用的基團(tuán)[3]。組氨酸、某些酸性氨基酸側(cè)鏈和多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基[4]均可以與產(chǎn)生·OH等自由基所必需的金屬離子(如 Fe2+、Cu2+等)絡(luò)合，具有抗氧化作用；Trp和Tyr等具有供氫能力的氨基酸可將氫原子給予自由基，導(dǎo)致自由基鏈反應(yīng)減慢或終止，從而起到抗氧化的作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期研發(fā)的專用菌株，以不同組合的發(fā)酵劑，發(fā)酵制作米發(fā)糕，研究發(fā)酵劑對(duì)米發(fā)糕胃腸消化物及活性的影響，探索產(chǎn)生抗氧化活性的機(jī)理，確定具有高抗氧化活性的發(fā)酵劑。為傳統(tǒng)米發(fā)糕的營(yíng)養(yǎng)特性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大米粉(粉狀)，由崗優(yōu)118型秈米浸泡磨粉制成，收獲于2015年：黃岡東坡糧油集團(tuán)；羥丙基二淀粉(粉狀)：杭州普羅星變性淀粉有限公司；馬鈴薯預(yù)糊化淀粉(粉狀)：北京遠(yuǎn)大食品添加劑有限公司；白砂糖(顆粒狀)：市售；安琪耐高糖活性干酵母和甜酒曲(甜味型)：宜昌安琪酵母股份有限公司；ZSM-001卡斯特酒香酵母[6]、ZSM-002植物乳桿菌[7]、ZSM-003米根霉[8]，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，于2016年取出，菌株均為凍干菌粉，用前需在固體培養(yǎng)基中活化，并在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得菌泥作為米發(fā)糕發(fā)酵劑。

1.2 主要試劑

鹽酸，氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖、菲咯嗪、鄰二氮菲、乙醇：國(guó)產(chǎn)分析純；DPPH，胃蛋白酶，胰酶，抗壞血酸：sigma公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

TDL-5A型離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；HBSHP-150型生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722S 型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 米發(fā)糕的制作

以大米粉、發(fā)酵劑(分別為ZSM-001、ZSM-001與ZSM-002、ZSM-001與ZSM-003、安琪酵母與酒曲)、白砂糖、水等為原料，攪拌均勻，于35 ℃發(fā)酵12 h后，注模蒸制而成。

1.4.2 米發(fā)糕水解液的制備1.4.2.1 水提液制備

米發(fā)糕搗碎加入去離子水(1∶5)，37 ℃搖床4 h后置于沸水浴中10 min，快速冷卻。離心(4 000 r/min，20 min)，過(guò)濾，取上清液。

1.4.2.2 體外模擬胃消化過(guò)程

米發(fā)糕搗碎加入去離子水(1∶5)，用1.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，加入胃蛋白酶(米發(fā)糕蛋白質(zhì)量的4%)，37 ℃搖床恒溫消化2 h。2 h后取樣，pH值迅速調(diào)為7.0，置于沸水浴中10 min滅酶，快速冷卻。離心(4 000 r/min，20 min)，取上清液。

1.4.2.3 體外模擬胃腸消化過(guò)程

米發(fā)糕經(jīng)過(guò)胃消化道酶系消化2 h后，用1.0 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.5。然后加入胰酶(加量為米發(fā)糕蛋白質(zhì)量的4%)，在37 ℃搖床恒溫消化2 h。pH值迅速調(diào)為7.0，置于沸水浴中10 min 滅酶，快速冷卻，離心(4 000 r/min，20 min)，取上清液。

1.4.3 米發(fā)糕水解物成分測(cè)定1.4.3.1 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取5 mL米發(fā)糕水解液，至50 mL離心管，加入少許蒸餾水，均質(zhì)后定容至40 mL，4 000 r/min 離心10 min，取上清液用Folin-酚試劑法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3.2 可溶性肽含量的測(cè)定

用雙縮脲比色法測(cè)定米發(fā)糕水解液的肽含量[9]。

1.4.3.3 游離氨基酸含量的測(cè)定

取液體樣品5～10 mL，加50 mL蒸餾水和5 g左右活性炭，加熱煮沸并過(guò)濾，用熱水洗滌活性炭，收集濾液于100 mL容量瓶中。吸取樣品溶液1～4 mL于50 mL比色管中，加pH 5.4乙酸和乙酸鈉緩沖液和2%茚三酮溶液各1 mL，加0.1 mL抗壞血酸，沸水浴15 min，室溫靜置15 min之后，在570 nm下檢測(cè)吸光值[10]。

1.4.3.4 總糖含量的測(cè)定

吸取一定量的樣品于100 mL錐形瓶中，加5.0 mL 50% HCl，混勻，于70 ℃水浴鍋中水解15 min，冷卻，調(diào)pH為7，定容100 mL。吸取樣品水解液1 mL于25 mL比色管中，按照3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量[11]。

總糖=(還原糖質(zhì)量×稀釋倍數(shù)×100)/樣品體積×100%

1.4.4 米發(fā)糕水解物的抗氧化活性的測(cè)定1.4.4.1 DPPH自由基清除能力

取1.5 mL樣品溶液，加入1.5 mL 99.5%的乙醇和0.675 mL的0.02%DPPH乙醇溶液混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30 min，然后在517 nm下檢測(cè)體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH·能力越強(qiáng)。空白即是將1.5 mL樣品溶液換成1.5 mL去離子水[12]。

清除DPPH·能力=[(空白吸光值-樣品吸光值 )/空白吸光值]×100%

1.4.4.2 OH自由基清除能力

取1.0 mL樣品溶液，加入1.0 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲和 2.0 mL pH 7.4 磷酸鹽緩沖液，加入1.0 mL 0.75 mmol/L FeSO4，混合均勻，加入 1.0 mL 0.12% H2O2，37 ℃水浴保溫 60 min，蒸餾水調(diào)零測(cè)定 536 nm處吸光值。

羥自由基清除率= (AS-AP)/AB×100%

式中： AS為樣品吸光值；AP為1.0 mL 蒸餾水代替樣品，其他反應(yīng)條件相同；AB為用 2.0 mL 蒸餾水代替樣品和 0.12% H2O2。

1.4.4.3 亞鐵離子螯合力的測(cè)定

取1 mL的樣品溶液，加入3.7 mL乙醇和0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液混合，再加入0.2 mL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。室溫靜置10 min后，在562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

亞鐵離子螯合能力=[(空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值]×100%

1.4.4.4 還原能力的測(cè)定

取多肽溶液1 mL，加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混和以后，在 50 ℃下，保溫 20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸。經(jīng)充分混合后以3 000r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入去離子水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL，混勻后，測(cè)定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel2013 與SAS9.2、SPSS22.0軟件進(jìn)行處理和分析。其中顯著性分析采用SPSS處理，P<0.05判定為變化顯著；相關(guān)性分析用SAS處理；所有圖表均由Excel處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 米發(fā)糕胃腸消化物的營(yíng)養(yǎng)成分

2.1.1 米發(fā)糕胃腸消化物中可溶性蛋白質(zhì)含量

米發(fā)糕水解液在不同消化階段的可溶性蛋白質(zhì)含量見(jiàn)圖1。其中，水提液的可溶性蛋白質(zhì)含量最低，其中JR的可溶性蛋白質(zhì)含量最高，其次為J、JG、AJ。這是由于乳酸菌對(duì)米發(fā)糕蛋白質(zhì)的降解作用強(qiáng)于酵母菌和根霉菌[13]。乳酸菌在短期內(nèi)迅速繁殖，所產(chǎn)蛋白酶和酸可促使部分蛋白分解和溶出，其所產(chǎn)乳酸是具有α-羥基結(jié)構(gòu)的羧酸，能與多肽鏈上的基團(tuán)形成氫鍵，也會(huì)促進(jìn)蛋白的溶出[14]。胃消化階段，在胃蛋白酶和酸的作用下，米發(fā)糕蛋白質(zhì)降解，水解為可溶性蛋白和小肽等，消化物中可溶性蛋白質(zhì)含量相比水提液均有顯著增長(zhǎng)，以JR蛋白質(zhì)含量最高。在胃腸消化后，J和JR的蛋白質(zhì)含量略有下降，而JG和AJ的蛋白含量增加。

注：大寫字母表示同一消化階段不同種類米發(fā)糕間有差異，小寫字母表示同種米發(fā)糕不同消化階段間有差異(P<0.05)。J為酵母菌發(fā)酵制作的米發(fā)糕，JR為酵母菌和乳酸菌發(fā)酵制作的米發(fā)糕，JG為酵母菌和米根霉發(fā)酵制作的米發(fā)糕，AJ為安琪酵母和甜酒曲發(fā)酵制作的米發(fā)糕。余同。圖1 米發(fā)糕水解液中可溶性蛋白質(zhì)含量

2.1.2 米發(fā)糕胃腸消化物中可溶性肽含量

發(fā)酵過(guò)程微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶系和酸促使體系中蛋白質(zhì)降解，產(chǎn)生小分子多肽。由圖2知，米發(fā)糕水提液的肽含量與蛋白質(zhì)含量相比較高，以J的肽含量最高，經(jīng)過(guò)胃消化，胃蛋白酶和酸性條件使蛋白質(zhì)進(jìn)一步降解，JR、JG、AJ肽含量相比水提液顯著增加，以JR的肽含量最高。胃腸消化階段，胰酶中的胰蛋白酶繼續(xù)降解蛋白，J、JG、AJ米發(fā)糕肽含量與胃消化階段比顯著增加，而JR米發(fā)糕肽含量降低，可能是由于胰酶作用，小分子多肽繼續(xù)降解成氨基酸導(dǎo)致[15]。

圖2 米發(fā)糕水解液中可溶性肽含量

2.1.3 米發(fā)糕胃腸消化物中游離氨基酸含量

由圖3可以看出，J、JR、JG、AJ水提液的游離氨基酸含量較低，經(jīng)過(guò)胃消化，游離氨基酸含量均顯著增加，以JR的游離氨基酸含量最高，其次為AJ、JG、J。在胃腸消化階段，游離氨基酸含量大幅度增加，以AJ的氨基酸含量最高，其次為JR。米發(fā)糕水提液中的游離氨基酸主要來(lái)自于發(fā)酵過(guò)程中，微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)大分子蛋白和肽類物質(zhì)的降解[16]，含量較低。在胃部消化過(guò)程中游離氨基酸的釋放較少，而在腸道消化過(guò)程中釋放了大量游離氨基酸，說(shuō)明胰酶對(duì)多肽的降解作用較強(qiáng)。

圖3 米發(fā)糕水解液中游離氨基酸含量

2.1.4 米發(fā)糕胃腸消化物中可溶性總糖含量

由圖4可知，水提組和胃消化組的四種米發(fā)糕可溶性總糖含量差異不顯著，而在胃腸消化階段，J、JR、JG、AJ可溶性總糖含量均顯著升高且具有顯著性差異，其中AJ總糖含量最高，其次為JR、J、JG。由于胃蛋白酶和酸對(duì)淀粉降解作用不明顯，而胰酶中含有胰淀粉酶，對(duì)米發(fā)糕中的淀粉有酶解作用，使得從淀粉上脫落下的單糖、二糖等含量增多，使得水解液中可溶性總糖含量大幅度提高[17]。

圖4 米發(fā)糕水解液中可溶性總糖含量

2.2 米發(fā)糕胃腸消化物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除能力

不同濃度VC溶液以及四種米發(fā)糕水解液的DPPH·清除能力如圖5所示。米發(fā)糕水解液的DPPH·清除能力與0.006～0.01 mg/mL VC溶液相當(dāng)。J、JR、AJ在水提組、胃消化組、胃腸消化組的DPPH·清除能力變化規(guī)律相似，且差異不顯著。其中，AJ的DPPH·清除率清除最低。水提液組，JR的DPPH·清除率最高(42.7%)；胃、胃腸消化消化組中JG的清除能力均最高，表明酵母菌和根霉菌制作的米發(fā)糕能夠在胃腸消化液暴露出較多的供氫基團(tuán)，與自由基作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力[18]。

圖5 米發(fā)糕水解液的DPPH自由基清率

2.2.2 羥基自由基清除能力

不同濃度VC溶液以及四種米發(fā)糕水解液的·OH清除能力如圖6所示。米發(fā)糕水解液的·OH清除能力與0.01～0.04 mg/mL VC溶液相當(dāng)。水提液組，JR清除·OH的能力最強(qiáng)；經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化后，J、JR、JG、AJ的·OH清除率均顯著提高，分別提高到29.40%、32.19%、25.36%、31.47%；進(jìn)一步用胰酶消化后，JG和AJ清除·OH的能力仍在進(jìn)一步的提升，但J、JR的清除率有所下降，清除率最高的為JR。表明酵母菌和乳酸菌制作的米發(fā)糕水解物富含供氫體，可清除或抑制自由基[19]。

圖6 米發(fā)糕水解液的羥自由基清除率

2.2.3 亞鐵離子螯合能力

如圖7所示，米發(fā)糕水解液的Fe2+鰲合能力與0.001～0.006 mg/mL EDTA溶液相當(dāng)。水提組中，AJ的Fe2+鰲合能力最強(qiáng)，其次是JG、JR、J。胃消化后，F(xiàn)e2+鰲合能力均增強(qiáng)，其中最高的是JR，其次為JG。胃腸消化后，JR、JG、AJ鰲合Fe2+的能力升高，而J降低。其中，F(xiàn)e2+鰲合能力最強(qiáng)的是AJ，其次為JR。蛋白質(zhì)的酸性氨基酸側(cè)鏈羧基、多糖的酚羥基、組氨酸等可以與Fe2+形成螯合物，減少機(jī)體自由基的產(chǎn)生[20]。表明安琪酒曲和酵母粉、酵母菌和乳酸菌復(fù)合制作的米發(fā)糕的胃腸水解物中這些活性物質(zhì)較多。

圖7 四種米發(fā)糕水解液的Fe2+鰲合能力

2.2.4 還原能力

反應(yīng)體系在700 nm處吸光度越大，說(shuō)明樣液還原能力越強(qiáng)[21]。如圖8所示，米發(fā)糕水解液的還原能力接近于0.01～0.06 mg/mL VC溶液的還原能力。水提組中，JR還原能力最高，其次為JG；經(jīng)胃消化后，還原能力均顯著增加，其中JR還原能力最強(qiáng)，其次為JG、AJ；經(jīng)胃腸消化后，J、JR還原能力下降，而JG、AJ的還原能力略有升高。其中，JG還原能力最高。發(fā)酵時(shí)微生物所分泌的各種酶類物質(zhì)如蛋白酶、糖化酶，加上消化過(guò)程，胃蛋白酶和胰酶的作用，使樣品產(chǎn)生更多的還原糖、小肽和氨基酸等物質(zhì)，使樣品還原能力有不同程度的提高[22]。

圖8 四種米發(fā)糕水解液的還原能力

2.3 米發(fā)糕胃腸水解物成分和抗氧化活性的相關(guān)性

米發(fā)糕水提和胃腸消化過(guò)程中的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、總糖含量與抗氧化活性的相關(guān)性如表2所示，·OH清除能力與蛋白質(zhì)和肽含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與游離氨基酸含量有正相關(guān)性，與總糖相關(guān)性不大。Fe2+螯合能力與蛋白質(zhì)、游離氨基酸、總糖含量顯著正相關(guān)，與肽含量有正相關(guān)性。還原能力與蛋白質(zhì)含量極顯著相關(guān)，與肽含量正相關(guān)；DPPH·清除能力與蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、總糖含量相關(guān)性不大。結(jié)果表明，米發(fā)糕胃腸水解物中的可溶性蛋白質(zhì)和可溶性肽對(duì)清除·OH作用最強(qiáng)[23]，游離氨基酸和可溶性總糖對(duì)螯合Fe2作用最強(qiáng)，其對(duì)清除DPPH自由基作用均不顯著[24]。

表1 米發(fā)糕胃腸水解物成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

注：*表示有相關(guān)性0.05

3 結(jié)論

微生物發(fā)酵和胃腸道消化有利于大分子物質(zhì)降解，促進(jìn)易于人體吸收的小分子活性物質(zhì)產(chǎn)生。米發(fā)糕胃腸消化物中的水溶性蛋白、肽、游離氨基酸、可溶性糖對(duì)·OH清除能力、Fe2+螯合能力、還原能力有不同程度的提高，而對(duì)DPPH·的清除作用不大。胃腸水解物中，以水溶性蛋白含量較高時(shí)，·OH清除能力、還原能力作用最強(qiáng)，水溶性糖含量較高時(shí)，F(xiàn)e2+螯合能力最強(qiáng)。分子質(zhì)量較大的蛋白水解物的抗氧化作用較強(qiáng)。采用酵母菌和乳酸菌、酵母菌和米根霉作為發(fā)酵劑，可制得抗氧化活性較高的米發(fā)糕。