基于不同沉淀方法檢測(cè)小鼠心臟組織中S-棕櫚?；鞍?/h1>
2019-01-14 01:15:10占方玲李水明楊靜波
分析化學(xué) 2019年1期
程 煒 占方玲 李水明 楊靜波 王 勇* 劉 寧*
1(吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130041)2(深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳 518060)
1 引 言
蛋白質(zhì)的脂肪?；F(xiàn)象最早由Lee等[1]發(fā)現(xiàn)，并通過研究發(fā)現(xiàn)脂肪?；鞍棕S度最高的組織是腦白質(zhì)，其次是灰質(zhì)和心肌。Schmidt等[2]首次提出棕櫚?；母拍睿肹3H]棕櫚酸標(biāo)記的辛德畢斯病毒顆粒感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)脂肪酸鏈通過硫酯鍵與糖蛋白中的半胱氨酸殘基連接，同時(shí)，質(zhì)譜分析表明脂肪酸部分主要為棕櫚酸酯。與肉豆蔻?；冗^程不同，棕櫚酰化是唯一可逆的脂質(zhì)修飾，并且易被羥胺特異性切割[3]，動(dòng)態(tài)棕櫚?；?棕櫚?；?脫棕櫚?；?已經(jīng)成為調(diào)節(jié)許多重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要機(jī)制[4]。
隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀难芯恐?，如生物信息學(xué)預(yù)測(cè)法、放射性棕櫚酸鹽代謝標(biāo)記法、點(diǎn)擊化學(xué)法以及?；?生物素置換法(Acyl-biotinyl exchange，ABE)等。最經(jīng)典的方法是用放射性棕櫚酸鹽代謝標(biāo)記,通過放射自顯影檢測(cè)同位素標(biāo)記的程度,檢測(cè)棕櫚酰化修飾的蛋白質(zhì)。此外，將含疊氮或炔基的棕櫚酸類似物代謝進(jìn)入蛋白質(zhì),然后通過點(diǎn)擊化學(xué)方法,選擇性地將帶疊氮或炔基基團(tuán)的蛋白質(zhì)連接到生物素或熒光基團(tuán)上,從而富集和檢測(cè)棕櫚?；鞍踪|(zhì)。相比于代謝標(biāo)記等方法，在檢測(cè)組織中的棕櫚?；鞍讜r(shí)，尤其是在臨床樣本的檢測(cè)中，ABE法具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，ABE法還具有反應(yīng)速度快和高靈敏度的特點(diǎn)，因此得到廣泛應(yīng)用[5]。利用ABE方法，Wei等[6]對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出380種棕櫚酰化蛋白質(zhì)，其中200種以上是未知的棕櫚酰化蛋白質(zhì)[6]。Dowal等[7]從分離的血小板膜中鑒定出215種具有代表性的血小板棕櫚酰化蛋白，包括51種已知的棕櫚酰化蛋白質(zhì)、61種在其它棕櫚?；禺愋缘鞍踪|(zhì)組學(xué)研究中鑒定出的棕櫚?；鞍踪|(zhì)、103種新的棕櫚?；鞍踪|(zhì)。另外，蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥中具有較為廣泛應(yīng)用[8]。在人類額葉皮質(zhì)中鑒定出219種棕櫚酰化蛋白質(zhì)，并且在精神分裂癥中蛋白質(zhì)的棕櫚?；揎棾潭蕊@著降低[9]。在小鼠大腦中鑒定的300多種棕櫚?；鞍踪|(zhì)中有19種在亨廷頓氏病模型中存在錯(cuò)誤調(diào)節(jié)[10]。癌癥相關(guān)信號(hào)的通路中(如Hippo信號(hào)通路，Ras信號(hào)通路和EGFR信號(hào)通路等)都有棕櫚?；膮⑴c及調(diào)節(jié)[11]。Runkle等[12]利用ABE方法鑒定出EGFR的C-末端尾部的3種半胱氨酸殘基是棕櫚酰化修飾位點(diǎn)，棕櫚酰化修飾的缺失會(huì)使EGFR信號(hào)持續(xù)激活，并使細(xì)胞對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑敏感。此外，蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椷€涉及心臟相關(guān)疾病，但是總體研究較少。Pei等[12]研究表明，電壓門控鈉通道(Nav1.5)中4種半胱氨酸為棕櫚?；男揎椢稽c(diǎn)，棕櫚?；母淖兛梢哉{(diào)控Nav1.5的功能進(jìn)而影響心臟的興奮性，并且這種翻譯后修飾可能是獲得性和先天性心律失常的重要影響因素[13]。Zhou等[14]通過構(gòu)建?；D(zhuǎn)移酶Aph2(DHHC16)缺陷型小鼠，使受磷蛋白(Phospholamban，PLN)棕櫚?；揎椚笔Вl(fā)現(xiàn)Aph2-/-胚胎和幼崽出現(xiàn)明顯的心肌病表型，包括心功能減退、組織學(xué)異常及心動(dòng)過緩等，這表明蛋白質(zhì)棕櫚?；谛呐K發(fā)育中具有一定作用。
與其它方法相比，ABE方法具有快速、高靈敏度，以及可應(yīng)用于細(xì)胞、組織和體液等多種樣本的優(yōu)勢(shì)[15]，但也存在假陽性高、初始樣本量需求大等局限性。通過對(duì)與ABE方法有關(guān)的研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在去除雜質(zhì)的過程中，大多數(shù)研究均使用甲醇-氯仿沉淀法，少數(shù)研究使用丙酮沉淀法。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，沉淀過程對(duì)蛋白的影響較大。本研究通過比較ABE反應(yīng)過程中沉淀蛋白質(zhì)方法的不同，探究了蛋白質(zhì)沉淀方法對(duì)ABE反應(yīng)以及結(jié)果的影響。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
TripleTOF 5600質(zhì)譜儀(美國(guó) Applied Biosystems 公司)； 全自動(dòng)組織勻漿儀及組織裂解管(德國(guó) Roche 公司)； 低速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)； 恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； 四維旋轉(zhuǎn)混勻器(海門市其林貝尓儀器有限公司)； Mini-PROTEAN Tetra Cell 垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)； 脫色搖床(榮華儀器制造有限公司)； pH試紙(美國(guó)Micro Essential Laboratory公司)； Milli-Q純水儀、 聚偏氟乙烯(PVDF) 膜(美國(guó)Millipore 公司)； 微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)； PowerLook2100XL-USB with UTA & Magic Scan凝膠成像儀(美國(guó)UMAX公司)； 一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。
NaOH、Na2S2O3、EDTA、Na2CO3、KH2PO4、KCl、乙醇、三氯甲烷、乙酸、丙酮(北京化工廠)； DMF、DMSO(美國(guó)Alfa Aesar公司)； Triton X-100、Tris、Na2HPO4、NaCl、DTT(美國(guó)Vetec公司)； 鹽酸羥胺、NEM、PMSF、Biotin-maleimide(美國(guó)Sigma Aldrich公司)； Biotin-HPDP(美國(guó)ApexBio公司)； 鏈霉親和素修飾瓊脂糖樹脂(美國(guó)Thermo公司)； 測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶(美國(guó)Promega公司)； 鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(美國(guó) Invitrogen 公司)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1小鼠心臟組織取材首先稱量小鼠的體重，給小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(劑量15 μL/g)。麻醉后將其用針頭固定在泡沫板上，快速剪開小鼠胸腔，將注射針頭插入小鼠左心室，灌注預(yù)冷的PBS，充分灌洗心臟，使心臟中血液盡可能排盡。摘取心臟后置于預(yù)冷的PBS中再次灌洗。用眼科剪及鑷子剔除粘附在心臟上的結(jié)締組織后，用濾紙吸干心臟表面的水分，稱量心臟重量，保存于液氮中。
2.2.2?；?生物素置換反應(yīng)(ABE) 配制裂解緩沖液(pH 7.4，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA)。取兩顆小鼠心臟組織切碎，分兩份置于組織裂解管中，每管加入500 μL封閉緩沖液(含10 mmol/L NEM，2 mmol/L PMSF，1.7% Triton的裂解緩沖液)，用組織勻漿儀4000 r/min進(jìn)行組織勻漿，每次1 min，間歇5 min，置于冰上，重復(fù)4～6次后，用四維旋轉(zhuǎn)混勻器于4℃翻轉(zhuǎn)混勻1 h。在4℃以250 g離心5 min，去除不溶物，吸取上清液至同一管中，再均分為A、B兩組。A組進(jìn)行丙酮沉淀(5倍體積的冷凍丙酮，-20℃，3 h，4000 r/min離心5 min，收取沉淀)； B組進(jìn)行甲醇-氯仿沉淀(4倍體積的冷凍甲醇，1.5倍體積的冷凍氯仿，3倍水混勻，4000 r/min，離心20 min，去除上層相。再緩慢加入3倍體積的冷凍甲醇，輕輕混勻，4000 r/min離心10 min，收取沉淀)。兩組沉淀分別加入300 μL包含10 mmol/L NEM 的4SB(4% SDS，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA)，37℃，溶解蛋白10 min。再加入900 μL包含1 mmol/L NEM，1 mmol/L PMSF，0.2%Triton X-100的裂解緩沖液，4℃翻轉(zhuǎn)過夜后，A組再次進(jìn)行3次丙酮沉淀，B組再次進(jìn)行3次甲醇-氯仿沉淀，以除去多余未反應(yīng)的NEM。每次沉淀后加入300 μL 4SB，37℃，溶解蛋白10 min，再加入900 μL裂解緩沖液。最后一次加入500 μL 4SB溶解蛋白后，A、B兩組各取240 μL，加入960 μL含有HA 的緩沖液(+HA組，pH 7.4，0.7 mol/L HA，1 mmol/L HPDP-Biotin，0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)。另取一份240 μL加入960 μL無HA的緩沖液(-HA組，pH 7.4，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L HPDP-Biotin，0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)作為對(duì)照組，室溫翻轉(zhuǎn)1 h。A組+/-HA進(jìn)行一次丙酮沉淀，B組+/-HA進(jìn)行一次甲醇-氯仿沉淀，以除去多余的羥胺。240 μL 4SB 溶解沉淀，加入960 μL Low HPDP-Biotin 緩沖液(pH 7.4，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L HPDP-Biotin，0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)，室溫翻轉(zhuǎn)1 h。若使用生物素化試劑Biotin-maleimide進(jìn)行標(biāo)記，則終濃度為1 μmol/L。生物素標(biāo)記后的A組進(jìn)行3次丙酮沉淀，B組進(jìn)行3次甲醇-氯仿沉淀，以除去多余的HPDP-Biotin。每次沉淀后加入300 μL 4SB，37℃，溶解蛋白10min，再加入900 μL裂解緩沖液。最后一次沉淀后，每管樣品加入120 μL 2SB(2% SDS，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA)，37℃保持10 min，溶解蛋白[16]。
2.2.3S-棕櫚?；鞍赘患?5 μL鏈霉親和素瓊脂糖樹脂加入1 mL裂解緩沖液(0.1% SDS，0.2% Triton X-100)平衡，8200 g離心30 s后，去除上清液。用裂解緩沖液(0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)將120 μL 2SB溶解的蛋白稀釋20倍，室溫翻轉(zhuǎn)30 min，15000 g離心1 min，取上清液，加入平衡后的鏈霉親和素瓊脂糖樹脂，室溫翻轉(zhuǎn)1.5 h，8200 g離心30 s，去除上清液。1 mL裂解緩沖液(0.1% SDS，0.2% Triton X-100)洗滌4次，1 mL裂解緩沖液洗滌3次，50 mmol/L NH4HCO3洗滌3次。每次加入洗滌液后，翻轉(zhuǎn)5 min，8200 g離心30 s，小心吸除上清液。以 50 μL洗脫液(50 mmol/L NH4HCO3，50 mmol/L DTT)洗脫蛋白，37℃孵育30 min，15000 g離心1 min，取上清液，-20℃保存[16]。
2.2.4WesternBlot檢測(cè)ABE反應(yīng)取等量的+/-HA兩組樣品，加入5倍上樣緩沖液，沸水煮樣5 min后，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。將PVDF膜封閉過夜后，1∶3000稀釋的Streptavidin-HRP孵育1 h，洗滌后進(jìn)行顯影，對(duì)比+/-HA兩組條帶深淺的差別。
2.2.5銀染檢測(cè)樣品進(jìn)行電泳后，將聚丙烯酰胺凝膠用30%甲醇，10%乙酸，固定20 min； 20%甲醇，清洗20 min； 超純水清洗10 min； 0.02% (w/V)Na2S2O3致敏1 min； 超純水清洗兩次，每次1 min； 預(yù)冷的0.2% (w/V)AgNO3染色20 min； 超純水清洗兩次，每次1 min； 用2%(w/V)無水Na2CO3，0.04%甲醛進(jìn)行顯色； 待顯色至一定程度后，用5%乙酸終止。
2.2.6質(zhì)譜檢測(cè)S-棕櫚?；鞍自跇悠分屑尤脒m量的胰酶，37℃水解過夜。在肽段樣品中加入適量0.1%三氟乙酸(TFA)后上樣。色譜條件: 將毛細(xì)管C18色譜柱(ChromXP，Eksigent Technologies，150 mm×75 μm×3.0 μm)與納升級(jí)液相柱(Eksigent-nanoLC pump)結(jié)合； 流動(dòng)相A為2%乙腈-0.1%甲酸，B為98% 乙腈-0.1%甲酸； 梯度洗脫程序: 0～60 min，5%～30% B； 60～75 min，28%～42% B； 75～85 min，42%～85% B； 流速為: 300 nL/min。Nano-LC-MS/MS 分析條件: 多肽經(jīng)毛細(xì)管C18色譜柱洗脫后，用TripleTOF 5600質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。然后用信息依賴采集方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，離子質(zhì)荷比范圍為m/z350～1250，離子帶電數(shù)目選擇為2～5，將碰撞能量設(shè)定成滾動(dòng)方式。本研究采用MS-GF+數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體設(shè)置為: 胰蛋白酶特異性消化，允許兩次錯(cuò)誤切割，肽段允許誤差為20 ppm，碎片離子允許誤差為0.5 Da。在鑒定結(jié)果中，+HA組肽段峰強(qiáng)度大于-HA組肽段3倍以上的蛋白被認(rèn)為是具有S-棕櫚?；揎椀年栃越Y(jié)果。
3 結(jié)果與討論
3.1 酰基-生物素置換法標(biāo)記S-棕櫚?；鞍?/h3>
在一定條件下，經(jīng)羥胺處理，可將蛋白質(zhì)中的棕櫚酸與半胱氨酸巰基相連的硫酯鍵切斷，暴露出被棕櫚酸修飾的巰基，從而利用巰基反應(yīng)性生物素化試劑(HPDP-Biotin或Biotin-maleimide)對(duì)新產(chǎn)生的半胱氨酸巰基進(jìn)行生物素標(biāo)記。由于生物體系復(fù)雜，可能存在內(nèi)源性生物素化蛋白或者可與HPDP-Biotin或Biotin-maleimide反應(yīng)的基團(tuán)，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致假陽性。因此，通過設(shè)立-HA對(duì)照組減少假陽性結(jié)果的影響。在本研究前期工作中，通過Western Blot方法檢測(cè)每次沉淀后的樣品發(fā)現(xiàn)，隨著沉淀次數(shù)增加，沉淀過程對(duì)蛋白的影響越來越大(圖1)。在將小鼠心臟組織分別進(jìn)行+HA及-HA反應(yīng)后，經(jīng)Western Blot檢測(cè)(圖2)，+HA組部分蛋白條帶(以箭頭標(biāo)注)與-HA組同等位置蛋白條帶相比顏色較深，表明此蛋白為潛在的S-棕櫚?；揎椀鞍?，而+/-HA組均存在的蛋白默認(rèn)為存在假陽性結(jié)果(以短線標(biāo)注)。
圖1 Western Blot檢測(cè)不同沉淀方法對(duì)S-棕櫚?；揎椀鞍赘患挠绊?； 1、2和3泳道分別為有HA實(shí)驗(yàn)組經(jīng)第1、2和3次沉淀后的樣品； 4、5和6泳道分別為無HA對(duì)照組經(jīng)第1、2和3次沉淀后的樣品； 7、9、11和13分別為有HA實(shí)驗(yàn)組經(jīng)第4、5、6和7次沉淀后的樣品； 8、10、12和14分別為無HA對(duì)照組經(jīng)第4、5、6和7次沉淀后的樣品Fig.1 Western Blot detection of effect of precipitation on proteins; 1, 2 and 3 are samples of the experimental HA group after the first, second and third precipitation, respectively; 4, 5 and 6 are samples after the first, second and third precipitation of the HA-free control group; 7, 9, 11 and 13 are the samples after the 4th, 5th, 6th and 7th precipitation of the HA experimental group; 8, 10, 12 and 14 are the samples after the 4th, 5th, 6th and 7th precipitation in the HA-free control group, respectively
圖2 Western Blot檢測(cè)?；?生物素置換法標(biāo)記的S-棕櫚?；鞍?箭頭標(biāo)注為S-棕櫚酰化修飾蛋白，短線標(biāo)注為假陽性結(jié)果)Fig.2 Western Blot detection of S-palmitoylated protein labeled by acyl-biotin exchange (The arrow is labeled S-palmitoylated modified protein, and the short line is marked as a false positive result)
3.2 S-棕櫚酰化蛋白的富集與分離
酰基-生物素置換反應(yīng)后的蛋白質(zhì)樣品(+/-HA兩組)經(jīng)過丙酮沉淀或甲醇-氯仿沉淀處理后，除去未反應(yīng)的HPDP-Biotin，再利用鏈霉親和素瓊脂糖樹脂對(duì)已經(jīng)被Biotin標(biāo)記的蛋白進(jìn)行富集及純化。由圖3可見，小鼠心臟組織中的S-棕櫚?；揎椀鞍自诹u胺作用下可以發(fā)生酰基-生物素置換，從而能夠被鏈霉親和素瓊脂糖樹脂高效地富集純化； 而未經(jīng)過羥胺處理的對(duì)照樣品則不能進(jìn)行?；?生物素置換反應(yīng)，便不能被富集純化。Input條帶為ABE反應(yīng)后而未經(jīng)富集的總蛋白，可以看出+/-HA兩組總蛋白初始量相同。Pull down條帶是經(jīng)鏈霉親和素瓊脂糖樹脂富集后洗脫下來的蛋白，可以判斷+HA組洗脫出的蛋白為經(jīng)ABE反應(yīng)后被標(biāo)記的S-棕櫚酰化蛋白，而-HA組非常淺的蛋白條帶為鏈霉親和素樹脂非特異性吸附的蛋白。這說明本方法用于富集S-棕櫚酰化蛋白的特異性較高。
圖3 銀染檢測(cè)S-棕櫚酰化蛋白的富集及純化(A) 丙酮沉淀實(shí)驗(yàn)組； 1. ABE反應(yīng)后的(+HA)樣品； 2. ABE反應(yīng)后的(-HA)樣品； 3. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)樣品； 4. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)樣品； 5. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)上清液； 6. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)上清液； (B)甲醇-氯仿實(shí)驗(yàn)組； 1. ABE反應(yīng)后的(+HA)樣品； 2. ABE反應(yīng)后的(-HA)樣品; 3. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)的樣品； 4. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)樣品； 5. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)上清液； 6. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)上清液Fig.3 Enrichment and purification of S-palmitoylated protein indicated by silver staining(A) Acetone precipitation experimental group; 1. Sample(+HA) after ABE reaction; 2.Sample (-HA) after ABE reaction; 3. Sample (+HA) after streptavidin purification; 4.Sample (-HA) after purification of streptavidin; 5. Supernatant (+HA) purified by streptavidin; 6. Supernatant (-HA) purified by streptavidin; (B) Methanol-chloroform experimental group； 1. Sample(+HA) after ABE reaction; 2.Sample (-HA) after ABE reaction; 3. Sample (+HA) after streptavidin purification; 4. Sample (-HA) after purification of streptavidin; 5. Supernatant (+HA) purified by streptavidin; 6. Supernatant (-HA) purified by streptavidin
圖4 兩種沉淀方法中重復(fù)鑒定的S-棕櫚酰化蛋白Fig.4 Experimental overlap of S-palmitoylated protein by two precipitation methods
3.3 小鼠心臟組織中S-棕櫚?；鞍椎馁|(zhì)譜分析
采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到樣品中肽段的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù),經(jīng)MS-GF+數(shù)據(jù)處理軟件在蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索分析。本研究中的每種沉淀方法分別進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)，再將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的樣品分別進(jìn)行混合得到4種樣品(丙酮沉淀±HA； 甲醇-氯仿沉淀±HA)，然后利用質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)這4種樣品進(jìn)行分析，每種樣品進(jìn)行2次技術(shù)重復(fù)。本研究共鑒定出50種S-棕櫚?；鞍?圖4)，基于丙酮沉淀的ABE方法共鑒定出23種S-棕櫚?；鞍?表1)，甲醇-氯仿沉淀方法共鑒定出37種S-棕櫚?；鞍?表2)，序號(hào)1～10為兩種沉淀方法共同鑒定出的S-棕櫚?；鞍?。本研究中有14種棕櫚?；鞍孜丛谄渌貦磅；鞍踪|(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)。表2中，E值代表蛋白質(zhì)鑒定可信度，本研究中篩選條件為E<0.05。棕櫚?；鞍踪|(zhì)組一列表示此蛋白已在棕櫚?；鞍踪|(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)的次數(shù)(SwissPalm數(shù)據(jù)庫)。根據(jù)細(xì)胞區(qū)室劃分，所鑒定出的S-棕櫚酰化蛋白主要為胞內(nèi)蛋白，其次為細(xì)胞器組分(圖5)。此外，根據(jù)分子功能劃分可以發(fā)現(xiàn)具有催化活性的蛋白數(shù)量最多，占所鑒定總蛋白的50%(圖6)。同時(shí)，不同沉淀方法對(duì)-HA對(duì)照組也具有一定影響，在丙酮沉淀中-HA對(duì)照組有17種蛋白，而甲醇-氯仿中僅有4種蛋白。
圖5 按細(xì)胞組分對(duì)已鑒定出的S-棕櫚?；鞍走M(jìn)行的分類Fig.5 Cellular compartment of proteins identified as S-palmitoylated
圖6 按功能對(duì)已鑒定出的S-棕櫚?；鞍走M(jìn)行分類Fig.6 Functional classification of proteins identified as S-palmitoylated
表1 丙酮沉淀方法中質(zhì)譜鑒定出的S-棕櫚酰化蛋白
Table 1S-Palmitoylated protein identified by mass spectrometry using acetone precipitation method
序號(hào)No.序列號(hào)Accessions名稱NamesE值E valueS-棕櫚?；鞍踪|(zhì)組Found in palmitoyl-proteomes1Q8BMF4丙酮酸脫氫酶復(fù)合物,線粒體的二氫脂酰賴氨酸殘基乙酰轉(zhuǎn)移酶組分Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial1.26 × 10儊83/132O09044突觸體相關(guān)蛋白23Synaptosomal-associated protein 234.89× 10儊107/133Q9D2G22-羥基戊二酸脫氫酶復(fù)合物的二氫脂酰賴氨酸殘基琥珀酰轉(zhuǎn)移酶,線粒體Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxogl-utarate dehydrogenase complex, mitochondrial3.40× 10儊32/134Q8BWT13-酮脂酰輔酶A硫解酶,線粒體3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial2.89× 10儊119/135Q99KI0烏頭酸水合酶,線粒體 Aconitate hydratase, mitochondrial1.58× 10儊1010/136Q8QZT1乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶,線粒體 Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochon-drial2.22× 10儊97/137Q08857血小板糖蛋白4 Platelet glycoprotein 42.68× 10儊86/138P50462半胱氨酸和富含甘氨酸的蛋白質(zhì)3 Cysteine and glycine-rich protein 32.70× 10儊80/139P51174長(zhǎng)鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶,線粒體Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial1.24× 10儊115/1310P62897細(xì)胞色素c,體細(xì)胞 Cytochrome c, somatic1.02× 10儊81/1311P08228超氧化物歧化酶[Cu-Zn] Superoxide dismutase [Cu-Zn]1.65× 10儊71/1312P29391鐵蛋白輕鏈1 Ferritin light chain 1)2.84× 10儊32/1313P09671超氧化物歧化酶[Mn],線粒體Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial5.46× 10儊102/1314P05201天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,細(xì)胞質(zhì) Aspartate aminotransferase, cytoplas-mic1.43× 10儊93/1315Q5I2A0絲氨酸蛋白酶抑制劑A3G Serine protease inhibitor A3G1.26× 10儊80/1316P04247肌紅蛋白 Myoglobin4.38× 10儊80/1317E9Q784鋅指含CCCH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)13 Zinc finger CCCH domain-contai-ning protein 137.63× 10儊80/1318Q3UR70轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體相關(guān)蛋白1Transforming growth factor-beta receptor-associated protein 18.25× 10儊80/1319Q9ERR7硒蛋白F Selenoprotein F8.83× 10儊80/1320Q91XL1富含亮氨酸的HEV糖蛋白 Leucine-rich HEV glycoprotein9.60× 10儊80/1321Q9CQA3琥珀酸脫氫酶[泛醌]鐵硫亞基,線粒體Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochon-drial9.61× 10儊84/1322P49945鐵蛋白輕鏈2 Ferritin light chain 21.14× 10儊71/1323P09528鐵蛋白重鏈 Ferritin heavy chain4.93× 10儊114/13
表2 甲醇-氯仿沉淀方法中質(zhì)譜鑒定出的S-棕櫚?；鞍?/p>
Table 2S-Palmitoylated protein identified by mass spectrometry by methanol-chloroform precipitation method
序號(hào)No.序列號(hào)Accessions名稱NamesE值E valueS-棕櫚?；鞍踪|(zhì)組Found in palmitoyl-proteomes1Q8BMF4丙酮酸脫氫酶復(fù)合物,線粒體的二氫脂酰賴氨酸殘基乙酰轉(zhuǎn)移酶組分Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial2.59×10儊93/132O09044突觸體相關(guān)蛋白23 Synaptosomal-associated protein 231.42×10儊107/133Q9D2G22-羥基戊二酸脫氫酶復(fù)合物的二氫脂酰賴氨酸殘基琥珀酰轉(zhuǎn)移酶組分,線粒體Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxogl-utarate dehydrogenase complex, mitochondrial3.78×10儊102/134Q8BWT13-酮脂酰輔酶A硫解酶,線粒體 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochon-drial3.89×10儊109/135Q99KI0烏頭酸水合酶,線粒體 Aconitate hydratase, mitochondrial1.83×10儊96/136Q8QZT1乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶,線粒體 Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochon-drial2.96×10儊87/137Q08857血小板糖蛋白4 Platelet glycoprotein 49.12×10儊86/138P50462半胱氨酸和富含甘氨酸的蛋白質(zhì)3 Cysteine and glycine-rich protein 38.69×10儊80/13
續(xù)表2(Continued to Table 2)
序號(hào)No.序列號(hào)Accessions名稱NamesE值E valueS-棕櫚?；鞍踪|(zhì)組Found in palmitoyl-proteomes9P51174長(zhǎng)鏈特異性?；o酶A脫氫酶,線粒體Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial1.24×10儊115/1310P62897細(xì)胞色素c,體細(xì)胞 Cytochrome c, somatic1.02×10儊81/1311P07724血清白蛋白 Serum albumin1.21×10儊83/1312Q9DCX2ATP合成酶亞基d,線粒體 ATP synthase subunit d, mitochondrial3.89×10儊104/1313P56480ATP合成酶亞基β,線粒體 ATP synthase subunit β, mitochondrial6.53×10儊102/1314P08249蘋果酸脫氫酶,線粒體 Malate dehydrogenase, mitochondrial1.11×10儊96/1315Q605972-氧代戊二酸脫氫酶,線粒體2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial1.79×10儊96/1316Q9DB20ATP合成酶亞基O,線粒體 ATP synthase subunit O, mitochondrial5.14×10儊96/1317Q9CZU6檸檬酸合成酶,線粒體 Citrate synthase, mitochondrial 5.60×10儊94/1318P05064果糖二磷酸醛縮酶A Fructose-bisphosphate aldolase A7.63×10儊95/1319Q9D6R2異檸檬酸脫氫酶[NAD]亞基α,線粒體Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial1.17×10儊86/1320P21550β -烯醇化酶 β -Enolase1.21×10儊80/1321Q9Z239Phospholemman1.21×10儊80/1322Q6P8J7肌酸激酶S型,線粒體 Creatine kinase S-type, mitochondrial1.32×10儊81/1323P45952中鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶,線粒體Medium-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial1.27×10儊81/1324P61089遍在蛋白綴合酶E2N Ubiquitin-conjugating enzyme E2N1.27×10儊81/1325Q7TQ48Sarcalumenin1.62×10儊80/1326P54071異檸檬酸脫氫酶[NADP],線粒體Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial3.40×10儊86/1327P21107原肌球蛋白α-3鏈 Tropomyosin α-3 chain3.68×10儊81/1328P48787肌鈣蛋白I,心肌 Troponin I, cardiac muscle3.61×10儊80/1329P11404脂肪酸結(jié)合蛋白,心臟 Fatty acid-binding protein, heart3.92×10儊80/1330P01942血紅蛋白亞基α Hemoglobin subunit α3.81×10儊81/1331P07310肌酸激酶M型 Creatine kinase M-type4.17×10儊81/1332Q8K3J1NADH脫氫酶[泛醌]鐵硫蛋白8,線粒體NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8, mitochon-drial4.60×10儊82/1333P82350α-肌聚糖 α-Sarcoglycan5.17×10儊80/1334Q32Q92?；o酶A硫酯酶6 Acyl-coenzyme A thioesterase 65.61×10儊80/1335Q9DCW4電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞基β Electron transfer flavoprotein subunit β6.39×10儊82/1336P60710肌動(dòng)蛋白,細(xì)胞質(zhì)1 Actin, cytoplasmic 11.20×10儊73/1337Q03265ATP合成酶亞基α,線粒體ATP synthase subunit α, mitochondria3.04×10儊67/13
4 結(jié) 論
利用ABE反應(yīng)和質(zhì)譜技術(shù)等對(duì)小鼠心臟組織中S-棕櫚?；鞍走M(jìn)行整體分析，發(fā)現(xiàn)基于不同蛋白沉淀方法的?；?生物素置換(ABE)反應(yīng)鑒定出的蛋白質(zhì)在數(shù)量及類型上均有一定差別，在后續(xù)的研究中可同時(shí)使用不同的沉淀方法進(jìn)行互補(bǔ)，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加完善，為大規(guī)模研究S-棕櫚酰化蛋白質(zhì)組提供了一種新的優(yōu)化方向。
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程 煒 占方玲 李水明 楊靜波 王 勇* 劉 寧*
1(吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130041)2(深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳 518060)
1 引 言
蛋白質(zhì)的脂肪?；F(xiàn)象最早由Lee等[1]發(fā)現(xiàn)，并通過研究發(fā)現(xiàn)脂肪?；鞍棕S度最高的組織是腦白質(zhì)，其次是灰質(zhì)和心肌。Schmidt等[2]首次提出棕櫚?；母拍睿肹3H]棕櫚酸標(biāo)記的辛德畢斯病毒顆粒感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)脂肪酸鏈通過硫酯鍵與糖蛋白中的半胱氨酸殘基連接，同時(shí)，質(zhì)譜分析表明脂肪酸部分主要為棕櫚酸酯。與肉豆蔻?；冗^程不同，棕櫚酰化是唯一可逆的脂質(zhì)修飾，并且易被羥胺特異性切割[3]，動(dòng)態(tài)棕櫚?；?棕櫚?；?脫棕櫚?；?已經(jīng)成為調(diào)節(jié)許多重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要機(jī)制[4]。
隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椀难芯恐?，如生物信息學(xué)預(yù)測(cè)法、放射性棕櫚酸鹽代謝標(biāo)記法、點(diǎn)擊化學(xué)法以及?；?生物素置換法(Acyl-biotinyl exchange，ABE)等。最經(jīng)典的方法是用放射性棕櫚酸鹽代謝標(biāo)記,通過放射自顯影檢測(cè)同位素標(biāo)記的程度,檢測(cè)棕櫚酰化修飾的蛋白質(zhì)。此外，將含疊氮或炔基的棕櫚酸類似物代謝進(jìn)入蛋白質(zhì),然后通過點(diǎn)擊化學(xué)方法,選擇性地將帶疊氮或炔基基團(tuán)的蛋白質(zhì)連接到生物素或熒光基團(tuán)上,從而富集和檢測(cè)棕櫚?；鞍踪|(zhì)。相比于代謝標(biāo)記等方法，在檢測(cè)組織中的棕櫚?；鞍讜r(shí)，尤其是在臨床樣本的檢測(cè)中，ABE法具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)，ABE法還具有反應(yīng)速度快和高靈敏度的特點(diǎn)，因此得到廣泛應(yīng)用[5]。利用ABE方法，Wei等[6]對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出380種棕櫚酰化蛋白質(zhì)，其中200種以上是未知的棕櫚酰化蛋白質(zhì)[6]。Dowal等[7]從分離的血小板膜中鑒定出215種具有代表性的血小板棕櫚酰化蛋白，包括51種已知的棕櫚酰化蛋白質(zhì)、61種在其它棕櫚?；禺愋缘鞍踪|(zhì)組學(xué)研究中鑒定出的棕櫚?；鞍踪|(zhì)、103種新的棕櫚?；鞍踪|(zhì)。另外，蛋白質(zhì)棕櫚酰化修飾在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥中具有較為廣泛應(yīng)用[8]。在人類額葉皮質(zhì)中鑒定出219種棕櫚酰化蛋白質(zhì)，并且在精神分裂癥中蛋白質(zhì)的棕櫚?；揎棾潭蕊@著降低[9]。在小鼠大腦中鑒定的300多種棕櫚?；鞍踪|(zhì)中有19種在亨廷頓氏病模型中存在錯(cuò)誤調(diào)節(jié)[10]。癌癥相關(guān)信號(hào)的通路中(如Hippo信號(hào)通路，Ras信號(hào)通路和EGFR信號(hào)通路等)都有棕櫚?；膮⑴c及調(diào)節(jié)[11]。Runkle等[12]利用ABE方法鑒定出EGFR的C-末端尾部的3種半胱氨酸殘基是棕櫚酰化修飾位點(diǎn)，棕櫚酰化修飾的缺失會(huì)使EGFR信號(hào)持續(xù)激活，并使細(xì)胞對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑敏感。此外，蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椷€涉及心臟相關(guān)疾病，但是總體研究較少。Pei等[12]研究表明，電壓門控鈉通道(Nav1.5)中4種半胱氨酸為棕櫚?；男揎椢稽c(diǎn)，棕櫚?；母淖兛梢哉{(diào)控Nav1.5的功能進(jìn)而影響心臟的興奮性，并且這種翻譯后修飾可能是獲得性和先天性心律失常的重要影響因素[13]。Zhou等[14]通過構(gòu)建?；D(zhuǎn)移酶Aph2(DHHC16)缺陷型小鼠，使受磷蛋白(Phospholamban，PLN)棕櫚?；揎椚笔Вl(fā)現(xiàn)Aph2-/-胚胎和幼崽出現(xiàn)明顯的心肌病表型，包括心功能減退、組織學(xué)異常及心動(dòng)過緩等，這表明蛋白質(zhì)棕櫚?；谛呐K發(fā)育中具有一定作用。
與其它方法相比，ABE方法具有快速、高靈敏度，以及可應(yīng)用于細(xì)胞、組織和體液等多種樣本的優(yōu)勢(shì)[15]，但也存在假陽性高、初始樣本量需求大等局限性。通過對(duì)與ABE方法有關(guān)的研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在去除雜質(zhì)的過程中，大多數(shù)研究均使用甲醇-氯仿沉淀法，少數(shù)研究使用丙酮沉淀法。本課題組早期研究發(fā)現(xiàn)，沉淀過程對(duì)蛋白的影響較大。本研究通過比較ABE反應(yīng)過程中沉淀蛋白質(zhì)方法的不同，探究了蛋白質(zhì)沉淀方法對(duì)ABE反應(yīng)以及結(jié)果的影響。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
TripleTOF 5600質(zhì)譜儀(美國(guó) Applied Biosystems 公司)； 全自動(dòng)組織勻漿儀及組織裂解管(德國(guó) Roche 公司)； 低速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)； 恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； 四維旋轉(zhuǎn)混勻器(海門市其林貝尓儀器有限公司)； Mini-PROTEAN Tetra Cell 垂直電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)； 脫色搖床(榮華儀器制造有限公司)； pH試紙(美國(guó)Micro Essential Laboratory公司)； Milli-Q純水儀、 聚偏氟乙烯(PVDF) 膜(美國(guó)Millipore 公司)； 微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)； PowerLook2100XL-USB with UTA & Magic Scan凝膠成像儀(美國(guó)UMAX公司)； 一體式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。
NaOH、Na2S2O3、EDTA、Na2CO3、KH2PO4、KCl、乙醇、三氯甲烷、乙酸、丙酮(北京化工廠)； DMF、DMSO(美國(guó)Alfa Aesar公司)； Triton X-100、Tris、Na2HPO4、NaCl、DTT(美國(guó)Vetec公司)； 鹽酸羥胺、NEM、PMSF、Biotin-maleimide(美國(guó)Sigma Aldrich公司)； Biotin-HPDP(美國(guó)ApexBio公司)； 鏈霉親和素修飾瓊脂糖樹脂(美國(guó)Thermo公司)； 測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶(美國(guó)Promega公司)； 鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(美國(guó) Invitrogen 公司)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1小鼠心臟組織取材首先稱量小鼠的體重，給小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(劑量15 μL/g)。麻醉后將其用針頭固定在泡沫板上，快速剪開小鼠胸腔，將注射針頭插入小鼠左心室，灌注預(yù)冷的PBS，充分灌洗心臟，使心臟中血液盡可能排盡。摘取心臟后置于預(yù)冷的PBS中再次灌洗。用眼科剪及鑷子剔除粘附在心臟上的結(jié)締組織后，用濾紙吸干心臟表面的水分，稱量心臟重量，保存于液氮中。
2.2.2?；?生物素置換反應(yīng)(ABE) 配制裂解緩沖液(pH 7.4，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA)。取兩顆小鼠心臟組織切碎，分兩份置于組織裂解管中，每管加入500 μL封閉緩沖液(含10 mmol/L NEM，2 mmol/L PMSF，1.7% Triton的裂解緩沖液)，用組織勻漿儀4000 r/min進(jìn)行組織勻漿，每次1 min，間歇5 min，置于冰上，重復(fù)4～6次后，用四維旋轉(zhuǎn)混勻器于4℃翻轉(zhuǎn)混勻1 h。在4℃以250 g離心5 min，去除不溶物，吸取上清液至同一管中，再均分為A、B兩組。A組進(jìn)行丙酮沉淀(5倍體積的冷凍丙酮，-20℃，3 h，4000 r/min離心5 min，收取沉淀)； B組進(jìn)行甲醇-氯仿沉淀(4倍體積的冷凍甲醇，1.5倍體積的冷凍氯仿，3倍水混勻，4000 r/min，離心20 min，去除上層相。再緩慢加入3倍體積的冷凍甲醇，輕輕混勻，4000 r/min離心10 min，收取沉淀)。兩組沉淀分別加入300 μL包含10 mmol/L NEM 的4SB(4% SDS，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA)，37℃，溶解蛋白10 min。再加入900 μL包含1 mmol/L NEM，1 mmol/L PMSF，0.2%Triton X-100的裂解緩沖液，4℃翻轉(zhuǎn)過夜后，A組再次進(jìn)行3次丙酮沉淀，B組再次進(jìn)行3次甲醇-氯仿沉淀，以除去多余未反應(yīng)的NEM。每次沉淀后加入300 μL 4SB，37℃，溶解蛋白10 min，再加入900 μL裂解緩沖液。最后一次加入500 μL 4SB溶解蛋白后，A、B兩組各取240 μL，加入960 μL含有HA 的緩沖液(+HA組，pH 7.4，0.7 mol/L HA，1 mmol/L HPDP-Biotin，0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)。另取一份240 μL加入960 μL無HA的緩沖液(-HA組，pH 7.4，50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L HPDP-Biotin，0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)作為對(duì)照組，室溫翻轉(zhuǎn)1 h。A組+/-HA進(jìn)行一次丙酮沉淀，B組+/-HA進(jìn)行一次甲醇-氯仿沉淀，以除去多余的羥胺。240 μL 4SB 溶解沉淀，加入960 μL Low HPDP-Biotin 緩沖液(pH 7.4，150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L HPDP-Biotin，0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)，室溫翻轉(zhuǎn)1 h。若使用生物素化試劑Biotin-maleimide進(jìn)行標(biāo)記，則終濃度為1 μmol/L。生物素標(biāo)記后的A組進(jìn)行3次丙酮沉淀，B組進(jìn)行3次甲醇-氯仿沉淀，以除去多余的HPDP-Biotin。每次沉淀后加入300 μL 4SB，37℃，溶解蛋白10min，再加入900 μL裂解緩沖液。最后一次沉淀后，每管樣品加入120 μL 2SB(2% SDS，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA)，37℃保持10 min，溶解蛋白[16]。
2.2.3S-棕櫚?；鞍赘患?5 μL鏈霉親和素瓊脂糖樹脂加入1 mL裂解緩沖液(0.1% SDS，0.2% Triton X-100)平衡，8200 g離心30 s后，去除上清液。用裂解緩沖液(0.2% Triton X-100，1 mmol/L PMSF)將120 μL 2SB溶解的蛋白稀釋20倍，室溫翻轉(zhuǎn)30 min，15000 g離心1 min，取上清液，加入平衡后的鏈霉親和素瓊脂糖樹脂，室溫翻轉(zhuǎn)1.5 h，8200 g離心30 s，去除上清液。1 mL裂解緩沖液(0.1% SDS，0.2% Triton X-100)洗滌4次，1 mL裂解緩沖液洗滌3次，50 mmol/L NH4HCO3洗滌3次。每次加入洗滌液后，翻轉(zhuǎn)5 min，8200 g離心30 s，小心吸除上清液。以 50 μL洗脫液(50 mmol/L NH4HCO3，50 mmol/L DTT)洗脫蛋白，37℃孵育30 min，15000 g離心1 min，取上清液，-20℃保存[16]。
2.2.4WesternBlot檢測(cè)ABE反應(yīng)取等量的+/-HA兩組樣品，加入5倍上樣緩沖液，沸水煮樣5 min后，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。將PVDF膜封閉過夜后，1∶3000稀釋的Streptavidin-HRP孵育1 h，洗滌后進(jìn)行顯影，對(duì)比+/-HA兩組條帶深淺的差別。
2.2.5銀染檢測(cè)樣品進(jìn)行電泳后，將聚丙烯酰胺凝膠用30%甲醇，10%乙酸，固定20 min； 20%甲醇，清洗20 min； 超純水清洗10 min； 0.02% (w/V)Na2S2O3致敏1 min； 超純水清洗兩次，每次1 min； 預(yù)冷的0.2% (w/V)AgNO3染色20 min； 超純水清洗兩次，每次1 min； 用2%(w/V)無水Na2CO3，0.04%甲醛進(jìn)行顯色； 待顯色至一定程度后，用5%乙酸終止。
2.2.6質(zhì)譜檢測(cè)S-棕櫚?；鞍自跇悠分屑尤脒m量的胰酶，37℃水解過夜。在肽段樣品中加入適量0.1%三氟乙酸(TFA)后上樣。色譜條件: 將毛細(xì)管C18色譜柱(ChromXP，Eksigent Technologies，150 mm×75 μm×3.0 μm)與納升級(jí)液相柱(Eksigent-nanoLC pump)結(jié)合； 流動(dòng)相A為2%乙腈-0.1%甲酸，B為98% 乙腈-0.1%甲酸； 梯度洗脫程序: 0～60 min，5%～30% B； 60～75 min，28%～42% B； 75～85 min，42%～85% B； 流速為: 300 nL/min。Nano-LC-MS/MS 分析條件: 多肽經(jīng)毛細(xì)管C18色譜柱洗脫后，用TripleTOF 5600質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。然后用信息依賴采集方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，離子質(zhì)荷比范圍為m/z350～1250，離子帶電數(shù)目選擇為2～5，將碰撞能量設(shè)定成滾動(dòng)方式。本研究采用MS-GF+數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體設(shè)置為: 胰蛋白酶特異性消化，允許兩次錯(cuò)誤切割，肽段允許誤差為20 ppm，碎片離子允許誤差為0.5 Da。在鑒定結(jié)果中，+HA組肽段峰強(qiáng)度大于-HA組肽段3倍以上的蛋白被認(rèn)為是具有S-棕櫚?；揎椀年栃越Y(jié)果。
3 結(jié)果與討論
3.1 酰基-生物素置換法標(biāo)記S-棕櫚?；鞍?/h3>
在一定條件下，經(jīng)羥胺處理，可將蛋白質(zhì)中的棕櫚酸與半胱氨酸巰基相連的硫酯鍵切斷，暴露出被棕櫚酸修飾的巰基，從而利用巰基反應(yīng)性生物素化試劑(HPDP-Biotin或Biotin-maleimide)對(duì)新產(chǎn)生的半胱氨酸巰基進(jìn)行生物素標(biāo)記。由于生物體系復(fù)雜，可能存在內(nèi)源性生物素化蛋白或者可與HPDP-Biotin或Biotin-maleimide反應(yīng)的基團(tuán)，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致假陽性。因此，通過設(shè)立-HA對(duì)照組減少假陽性結(jié)果的影響。在本研究前期工作中，通過Western Blot方法檢測(cè)每次沉淀后的樣品發(fā)現(xiàn)，隨著沉淀次數(shù)增加，沉淀過程對(duì)蛋白的影響越來越大(圖1)。在將小鼠心臟組織分別進(jìn)行+HA及-HA反應(yīng)后，經(jīng)Western Blot檢測(cè)(圖2)，+HA組部分蛋白條帶(以箭頭標(biāo)注)與-HA組同等位置蛋白條帶相比顏色較深，表明此蛋白為潛在的S-棕櫚?；揎椀鞍?，而+/-HA組均存在的蛋白默認(rèn)為存在假陽性結(jié)果(以短線標(biāo)注)。
圖1 Western Blot檢測(cè)不同沉淀方法對(duì)S-棕櫚?；揎椀鞍赘患挠绊?； 1、2和3泳道分別為有HA實(shí)驗(yàn)組經(jīng)第1、2和3次沉淀后的樣品； 4、5和6泳道分別為無HA對(duì)照組經(jīng)第1、2和3次沉淀后的樣品； 7、9、11和13分別為有HA實(shí)驗(yàn)組經(jīng)第4、5、6和7次沉淀后的樣品； 8、10、12和14分別為無HA對(duì)照組經(jīng)第4、5、6和7次沉淀后的樣品Fig.1 Western Blot detection of effect of precipitation on proteins; 1, 2 and 3 are samples of the experimental HA group after the first, second and third precipitation, respectively; 4, 5 and 6 are samples after the first, second and third precipitation of the HA-free control group; 7, 9, 11 and 13 are the samples after the 4th, 5th, 6th and 7th precipitation of the HA experimental group; 8, 10, 12 and 14 are the samples after the 4th, 5th, 6th and 7th precipitation in the HA-free control group, respectively
圖2 Western Blot檢測(cè)?；?生物素置換法標(biāo)記的S-棕櫚?；鞍?箭頭標(biāo)注為S-棕櫚酰化修飾蛋白，短線標(biāo)注為假陽性結(jié)果)Fig.2 Western Blot detection of S-palmitoylated protein labeled by acyl-biotin exchange (The arrow is labeled S-palmitoylated modified protein, and the short line is marked as a false positive result)
3.2 S-棕櫚酰化蛋白的富集與分離
酰基-生物素置換反應(yīng)后的蛋白質(zhì)樣品(+/-HA兩組)經(jīng)過丙酮沉淀或甲醇-氯仿沉淀處理后，除去未反應(yīng)的HPDP-Biotin，再利用鏈霉親和素瓊脂糖樹脂對(duì)已經(jīng)被Biotin標(biāo)記的蛋白進(jìn)行富集及純化。由圖3可見，小鼠心臟組織中的S-棕櫚?；揎椀鞍自诹u胺作用下可以發(fā)生酰基-生物素置換，從而能夠被鏈霉親和素瓊脂糖樹脂高效地富集純化； 而未經(jīng)過羥胺處理的對(duì)照樣品則不能進(jìn)行?；?生物素置換反應(yīng)，便不能被富集純化。Input條帶為ABE反應(yīng)后而未經(jīng)富集的總蛋白，可以看出+/-HA兩組總蛋白初始量相同。Pull down條帶是經(jīng)鏈霉親和素瓊脂糖樹脂富集后洗脫下來的蛋白，可以判斷+HA組洗脫出的蛋白為經(jīng)ABE反應(yīng)后被標(biāo)記的S-棕櫚酰化蛋白，而-HA組非常淺的蛋白條帶為鏈霉親和素樹脂非特異性吸附的蛋白。這說明本方法用于富集S-棕櫚酰化蛋白的特異性較高。
圖3 銀染檢測(cè)S-棕櫚酰化蛋白的富集及純化(A) 丙酮沉淀實(shí)驗(yàn)組； 1. ABE反應(yīng)后的(+HA)樣品； 2. ABE反應(yīng)后的(-HA)樣品； 3. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)樣品； 4. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)樣品； 5. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)上清液； 6. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)上清液； (B)甲醇-氯仿實(shí)驗(yàn)組； 1. ABE反應(yīng)后的(+HA)樣品； 2. ABE反應(yīng)后的(-HA)樣品; 3. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)的樣品； 4. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)樣品； 5. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(+HA)上清液； 6. 經(jīng)鏈霉親和素純化后的(-HA)上清液Fig.3 Enrichment and purification of S-palmitoylated protein indicated by silver staining(A) Acetone precipitation experimental group; 1. Sample(+HA) after ABE reaction; 2.Sample (-HA) after ABE reaction; 3. Sample (+HA) after streptavidin purification; 4.Sample (-HA) after purification of streptavidin; 5. Supernatant (+HA) purified by streptavidin; 6. Supernatant (-HA) purified by streptavidin; (B) Methanol-chloroform experimental group； 1. Sample(+HA) after ABE reaction; 2.Sample (-HA) after ABE reaction; 3. Sample (+HA) after streptavidin purification; 4. Sample (-HA) after purification of streptavidin; 5. Supernatant (+HA) purified by streptavidin; 6. Supernatant (-HA) purified by streptavidin
圖4 兩種沉淀方法中重復(fù)鑒定的S-棕櫚酰化蛋白Fig.4 Experimental overlap of S-palmitoylated protein by two precipitation methods
3.3 小鼠心臟組織中S-棕櫚?；鞍椎馁|(zhì)譜分析
采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到樣品中肽段的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù),經(jīng)MS-GF+數(shù)據(jù)處理軟件在蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索分析。本研究中的每種沉淀方法分別進(jìn)行了3次生物學(xué)重復(fù)，再將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的樣品分別進(jìn)行混合得到4種樣品(丙酮沉淀±HA； 甲醇-氯仿沉淀±HA)，然后利用質(zhì)譜技術(shù)分別對(duì)這4種樣品進(jìn)行分析，每種樣品進(jìn)行2次技術(shù)重復(fù)。本研究共鑒定出50種S-棕櫚?；鞍?圖4)，基于丙酮沉淀的ABE方法共鑒定出23種S-棕櫚?；鞍?表1)，甲醇-氯仿沉淀方法共鑒定出37種S-棕櫚?；鞍?表2)，序號(hào)1～10為兩種沉淀方法共同鑒定出的S-棕櫚?；鞍?。本研究中有14種棕櫚?；鞍孜丛谄渌貦磅；鞍踪|(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)。表2中，E值代表蛋白質(zhì)鑒定可信度，本研究中篩選條件為E<0.05。棕櫚?；鞍踪|(zhì)組一列表示此蛋白已在棕櫚?；鞍踪|(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)的次數(shù)(SwissPalm數(shù)據(jù)庫)。根據(jù)細(xì)胞區(qū)室劃分，所鑒定出的S-棕櫚酰化蛋白主要為胞內(nèi)蛋白，其次為細(xì)胞器組分(圖5)。此外，根據(jù)分子功能劃分可以發(fā)現(xiàn)具有催化活性的蛋白數(shù)量最多，占所鑒定總蛋白的50%(圖6)。同時(shí)，不同沉淀方法對(duì)-HA對(duì)照組也具有一定影響，在丙酮沉淀中-HA對(duì)照組有17種蛋白，而甲醇-氯仿中僅有4種蛋白。
圖5 按細(xì)胞組分對(duì)已鑒定出的S-棕櫚?；鞍走M(jìn)行的分類Fig.5 Cellular compartment of proteins identified as S-palmitoylated
圖6 按功能對(duì)已鑒定出的S-棕櫚?；鞍走M(jìn)行分類Fig.6 Functional classification of proteins identified as S-palmitoylated
表1 丙酮沉淀方法中質(zhì)譜鑒定出的S-棕櫚酰化蛋白
Table 1S-Palmitoylated protein identified by mass spectrometry using acetone precipitation method
序號(hào)No.序列號(hào)Accessions名稱NamesE值E valueS-棕櫚?；鞍踪|(zhì)組Found in palmitoyl-proteomes1Q8BMF4丙酮酸脫氫酶復(fù)合物,線粒體的二氫脂酰賴氨酸殘基乙酰轉(zhuǎn)移酶組分Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial1.26 × 10儊83/132O09044突觸體相關(guān)蛋白23Synaptosomal-associated protein 234.89× 10儊107/133Q9D2G22-羥基戊二酸脫氫酶復(fù)合物的二氫脂酰賴氨酸殘基琥珀酰轉(zhuǎn)移酶,線粒體Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxogl-utarate dehydrogenase complex, mitochondrial3.40× 10儊32/134Q8BWT13-酮脂酰輔酶A硫解酶,線粒體3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial2.89× 10儊119/135Q99KI0烏頭酸水合酶,線粒體 Aconitate hydratase, mitochondrial1.58× 10儊1010/136Q8QZT1乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶,線粒體 Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochon-drial2.22× 10儊97/137Q08857血小板糖蛋白4 Platelet glycoprotein 42.68× 10儊86/138P50462半胱氨酸和富含甘氨酸的蛋白質(zhì)3 Cysteine and glycine-rich protein 32.70× 10儊80/139P51174長(zhǎng)鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶,線粒體Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial1.24× 10儊115/1310P62897細(xì)胞色素c,體細(xì)胞 Cytochrome c, somatic1.02× 10儊81/1311P08228超氧化物歧化酶[Cu-Zn] Superoxide dismutase [Cu-Zn]1.65× 10儊71/1312P29391鐵蛋白輕鏈1 Ferritin light chain 1)2.84× 10儊32/1313P09671超氧化物歧化酶[Mn],線粒體Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial5.46× 10儊102/1314P05201天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,細(xì)胞質(zhì) Aspartate aminotransferase, cytoplas-mic1.43× 10儊93/1315Q5I2A0絲氨酸蛋白酶抑制劑A3G Serine protease inhibitor A3G1.26× 10儊80/1316P04247肌紅蛋白 Myoglobin4.38× 10儊80/1317E9Q784鋅指含CCCH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)13 Zinc finger CCCH domain-contai-ning protein 137.63× 10儊80/1318Q3UR70轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體相關(guān)蛋白1Transforming growth factor-beta receptor-associated protein 18.25× 10儊80/1319Q9ERR7硒蛋白F Selenoprotein F8.83× 10儊80/1320Q91XL1富含亮氨酸的HEV糖蛋白 Leucine-rich HEV glycoprotein9.60× 10儊80/1321Q9CQA3琥珀酸脫氫酶[泛醌]鐵硫亞基,線粒體Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochon-drial9.61× 10儊84/1322P49945鐵蛋白輕鏈2 Ferritin light chain 21.14× 10儊71/1323P09528鐵蛋白重鏈 Ferritin heavy chain4.93× 10儊114/13
表2 甲醇-氯仿沉淀方法中質(zhì)譜鑒定出的S-棕櫚?；鞍?/p>
Table 2S-Palmitoylated protein identified by mass spectrometry by methanol-chloroform precipitation method
序號(hào)No.序列號(hào)Accessions名稱NamesE值E valueS-棕櫚?；鞍踪|(zhì)組Found in palmitoyl-proteomes1Q8BMF4丙酮酸脫氫酶復(fù)合物,線粒體的二氫脂酰賴氨酸殘基乙酰轉(zhuǎn)移酶組分Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial2.59×10儊93/132O09044突觸體相關(guān)蛋白23 Synaptosomal-associated protein 231.42×10儊107/133Q9D2G22-羥基戊二酸脫氫酶復(fù)合物的二氫脂酰賴氨酸殘基琥珀酰轉(zhuǎn)移酶組分,線粒體Dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase component of 2-oxogl-utarate dehydrogenase complex, mitochondrial3.78×10儊102/134Q8BWT13-酮脂酰輔酶A硫解酶,線粒體 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochon-drial3.89×10儊109/135Q99KI0烏頭酸水合酶,線粒體 Aconitate hydratase, mitochondrial1.83×10儊96/136Q8QZT1乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶,線粒體 Acetyl-CoA acetyltransferase, mitochon-drial2.96×10儊87/137Q08857血小板糖蛋白4 Platelet glycoprotein 49.12×10儊86/138P50462半胱氨酸和富含甘氨酸的蛋白質(zhì)3 Cysteine and glycine-rich protein 38.69×10儊80/13
續(xù)表2(Continued to Table 2)
序號(hào)No.序列號(hào)Accessions名稱NamesE值E valueS-棕櫚?；鞍踪|(zhì)組Found in palmitoyl-proteomes9P51174長(zhǎng)鏈特異性?；o酶A脫氫酶,線粒體Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial1.24×10儊115/1310P62897細(xì)胞色素c,體細(xì)胞 Cytochrome c, somatic1.02×10儊81/1311P07724血清白蛋白 Serum albumin1.21×10儊83/1312Q9DCX2ATP合成酶亞基d,線粒體 ATP synthase subunit d, mitochondrial3.89×10儊104/1313P56480ATP合成酶亞基β,線粒體 ATP synthase subunit β, mitochondrial6.53×10儊102/1314P08249蘋果酸脫氫酶,線粒體 Malate dehydrogenase, mitochondrial1.11×10儊96/1315Q605972-氧代戊二酸脫氫酶,線粒體2-oxoglutarate dehydrogenase, mitochondrial1.79×10儊96/1316Q9DB20ATP合成酶亞基O,線粒體 ATP synthase subunit O, mitochondrial5.14×10儊96/1317Q9CZU6檸檬酸合成酶,線粒體 Citrate synthase, mitochondrial 5.60×10儊94/1318P05064果糖二磷酸醛縮酶A Fructose-bisphosphate aldolase A7.63×10儊95/1319Q9D6R2異檸檬酸脫氫酶[NAD]亞基α,線粒體Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit alpha, mitochondrial1.17×10儊86/1320P21550β -烯醇化酶 β -Enolase1.21×10儊80/1321Q9Z239Phospholemman1.21×10儊80/1322Q6P8J7肌酸激酶S型,線粒體 Creatine kinase S-type, mitochondrial1.32×10儊81/1323P45952中鏈特異性酰基輔酶A脫氫酶,線粒體Medium-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial1.27×10儊81/1324P61089遍在蛋白綴合酶E2N Ubiquitin-conjugating enzyme E2N1.27×10儊81/1325Q7TQ48Sarcalumenin1.62×10儊80/1326P54071異檸檬酸脫氫酶[NADP],線粒體Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial3.40×10儊86/1327P21107原肌球蛋白α-3鏈 Tropomyosin α-3 chain3.68×10儊81/1328P48787肌鈣蛋白I,心肌 Troponin I, cardiac muscle3.61×10儊80/1329P11404脂肪酸結(jié)合蛋白,心臟 Fatty acid-binding protein, heart3.92×10儊80/1330P01942血紅蛋白亞基α Hemoglobin subunit α3.81×10儊81/1331P07310肌酸激酶M型 Creatine kinase M-type4.17×10儊81/1332Q8K3J1NADH脫氫酶[泛醌]鐵硫蛋白8,線粒體NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8, mitochon-drial4.60×10儊82/1333P82350α-肌聚糖 α-Sarcoglycan5.17×10儊80/1334Q32Q92?；o酶A硫酯酶6 Acyl-coenzyme A thioesterase 65.61×10儊80/1335Q9DCW4電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞基β Electron transfer flavoprotein subunit β6.39×10儊82/1336P60710肌動(dòng)蛋白,細(xì)胞質(zhì)1 Actin, cytoplasmic 11.20×10儊73/1337Q03265ATP合成酶亞基α,線粒體ATP synthase subunit α, mitochondria3.04×10儊67/13
4 結(jié) 論
利用ABE反應(yīng)和質(zhì)譜技術(shù)等對(duì)小鼠心臟組織中S-棕櫚?；鞍走M(jìn)行整體分析，發(fā)現(xiàn)基于不同蛋白沉淀方法的?；?生物素置換(ABE)反應(yīng)鑒定出的蛋白質(zhì)在數(shù)量及類型上均有一定差別，在后續(xù)的研究中可同時(shí)使用不同的沉淀方法進(jìn)行互補(bǔ)，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加完善，為大規(guī)模研究S-棕櫚酰化蛋白質(zhì)組提供了一種新的優(yōu)化方向。
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