超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中的30種獸藥殘留

◎ 黃正華

（譜尼測試集團深圳有限公司，廣東 深圳 518000）

我國在水生物養(yǎng)殖、禽類飼養(yǎng)以及畜牧業(yè)生產(chǎn)等過程中會使用各種獸藥，其中包括喹諾酮和青霉素等，這些藥物的濫用會對人體產(chǎn)生一定的影響，當人體內(nèi)的藥物積累到一定程度后，就會出現(xiàn)耐藥性，甚至導致畸形、突變等嚴重后果[1]。目前在獸藥檢測領域中普遍使用的一種方法是超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 實驗方法

1.1 設備與試劑

使用的設備包括超高效液相色譜儀Agilent1290，三重四極桿質(zhì)譜儀6460，高速冷凍離心機、水浴式的氮吹儀、高純凈水儀、超聲波振蕩器等。試劑包括甲酸、正己烷、乙腈、甲醇、氯化鈉、三氯乙酸、C18吸附劑。實驗過程中所使用的水均是通過高純水凈化而來。此外，還包括19種喹諾酮標準品，恩諾沙星、司帕沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、萘啶酸、西諾沙星、洛美沙星、培氟沙星、吡哌酸、奧比沙星、依諾沙星、馬波沙星、達氟沙星、氟甲喹、惡喹酸、司帕沙星、沙拉沙星等，還有11種青霉素標準品，如苯氧乙基青霉素、雙氯青霉素、鄰氯青霉素、甲氧苯青霉素、苯咪青青霉素、苯氧甲基青霉素、芐青霉素、乙氧萘胺青霉素、雙氯青霉素、苯唑青霉素、鄰氯青霉素、氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、苯氧乙基青霉素等。

1.2 標準溶液的配制

先將喹諾酮標準品使用10毫升的甲酸進行溶解后用乙腈作為溶劑。而青霉素類標準品則以50%乙腈水溶液作為溶劑，然后將30種標準品配制成500 μg·mL-1濃度的單標儲備液，并避光冷藏保存。根據(jù)所需初始比例流動相進行稀釋，從而獲得濃度適當?shù)臉藴驶旌瞎ぷ魅芤?，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 預處理方法

稱取均質(zhì)樣品5.0 g，置于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入10%三氯乙酸溶液-乙腈（20∶80）的混合液10 mL，勻漿1 min，室溫超聲提取10 min，于室溫以8 000 r·min-1的速度離心5 min，將清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，剩余的殘留物加入1%甲酸乙腈溶液10 mL進行二次提取，合并清液，加入適量氯化鈉，同時添加C18吸附劑0.5 g，渦旋1 min，室溫以8 000 r·min-1的速度離心3 min。準確提取9 mL清液于15 mL離心管中，40 ℃水浴氮吹至干，用1 mL正己烷和1 mL初始比例流動相溶解殘余物，旋渦1 min，低溫離心3 min，取下清液過0.22 μm濾膜，準備上機檢測。

1.4 標準工作曲線的配制

稱取陰性樣品，根據(jù)預處理方法進行處理，濃縮盡干，并加1.2中稀釋好的不同濃度標準混合工作溶液1.0 mL，用1 mL正己烷和1 mL初始比例流動相溶解殘余物，旋渦1 min，低溫離心3 min，取下清液過0.22 μm濾膜，得到標準工作溶液。

1.5 儀器條件及定量

MS條件，30種待測的獸藥質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源，MS/MS分辨率設置成unit，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速10.0 L·min-1，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為11.0 L·min-1。定量的方法：用1.4中的不同濃度標準工作溶液上機機檢測，制作標準曲線，用曲線校正1.3得到的樣液，保留兩對特征離子與時間定性，用離子對峰面積進行定量，外標法計算樣品中30種待測的獸藥的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化質(zhì)譜條件

通過電噴霧離子源的正離子掃描模式，系統(tǒng)分析三十種獸藥，待測物質(zhì)都轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)分子離子峰，屬于一種[M+H]+的形式。通過單離子SIM的掃描方法對所有待測物質(zhì)的裂解電壓進行單獨優(yōu)化，找出母離子最佳裂解電壓，隨后通過SCAN掃描方法對碎片離子進行系統(tǒng)分析，找出最佳碰撞電壓，從而得到較好響應的離子對。同時在檢測多殘留的過程中，通過的多反應動態(tài)監(jiān)測手段來分析樣品提高檢測結(jié)果的準確性與靈敏度。通過多反應動態(tài)監(jiān)測這一手段，能夠結(jié)合被測組分不同的保留時間，進行分段的MRM掃描，從而提高所有檢測物質(zhì)的掃描時間，提升靈敏度。以下介紹了其中30種藥物的質(zhì)譜參數(shù)，具體見表1。

表1 30種藥物的質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 改善色譜條件

通過分離效果以及時間等因素對3種色譜柱進行了對比分析，主要分析了SB-C18柱、SYMNETRYSHIELD RP18柱和ECLIPSEPLUSC18RRHD柱3種色譜柱。其中，RP18柱酸性流動相體中對于青霉素藥物的重現(xiàn)性和峰形并不是十分突出。SB-C18柱的整體分離結(jié)果會對DMRM參數(shù)的制定產(chǎn)生影響，結(jié)合各種因素，最后選擇C18RRHD柱，能都獲得預期結(jié)果。

結(jié)合相關文獻資料以及以往分析經(jīng)驗[2-3]，在酸性流動相下能夠促進被測物質(zhì)的離子化，有效提高靈敏度，此次研究中主要是通過組合乙酸銨溶液、甲酸水溶液、甲醇以及乙腈等溶液，并分析其靈敏度與分離效果，隨后挑選出最為適合的流動相體系，最終結(jié)果證明，將乙酸銨與甲酸添加到水相中都能促進靈敏度的有效提升。從系統(tǒng)平衡消耗時間以及便捷性等角度進行分析，在此次實驗中主要是水相加入甲酸，經(jīng)過不斷試驗后，選擇含量為0.2%甲酸溶液為流動相，能夠得到最佳效果。和甲醇比較起來，乙腈反相洗脫能力更好，同時基線噪音影響也比較小，增加了洗脫程序的靈活性，為此可以將乙腈選定為有機相，提高洗脫穩(wěn)定性。用0.2% 甲酸水溶液作為水相，0.2%甲酸乙腈溶液作為有機相，通過分析豬肉樣品，空白譜圖我們能夠發(fā)現(xiàn)，這一環(huán)境下沒有任何干擾物。

2.3 創(chuàng)新預處理方法

和乙酸乙酯、丙酮、甲醇等比較常見的提取劑相比，乙腈在提取高蛋白樣品過程中的沉淀效果比較突出，但是在濃縮最終階段依然會發(fā)生渾濁等問題，通過將一定量的三氯乙酸添加的提取液當中，能夠適當減少渾濁問題，結(jié)合青霉素這一類型藥物在酸性狀態(tài)中穩(wěn)定的特點，可以將乙腈和三氯乙酸充當提取溶劑，隨后通過1%甲酸乙腈進行二次提取。

2.4 考察基質(zhì)效應

因為超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法從原理層面分析，基質(zhì)不能全部消除，因為經(jīng)常會利用內(nèi)標法、標準添加法以及稀釋法等修正基質(zhì)效應中的誤差。此次研究過程中主要是利用優(yōu)化洗脫程序有效降低了基質(zhì)效應。

2.5 檢測實際樣品

根據(jù)相關實驗流程從市場流通商品中購買19份豬肝、26份魚肉以及61份豬肉進行檢測，從而對30種獸藥進行快速檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例恩諾沙星的陽性豬肉樣品，1例環(huán)丙沙星的陽性魚肉產(chǎn)品，隨后將陽性的魚肉產(chǎn)品與豬肉產(chǎn)品和國家下發(fā)的標準方法進行比較分析。結(jié)果顯示，這3種檢測方法的最終結(jié)果大致相同，見表2。證明此方法可以應用于殘留獸藥快速檢測工作。

表2 各種方法的樣品檢測結(jié)果表

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對11種青霉素類型以及19種喹諾酮類型在內(nèi)的30種殘留獸藥進行檢測。其中通過三氯乙酸乙腈溶液來提取樣本，再利用C18吸附劑和氯化鈉對提取液進行吸附和分層后進行濃縮，經(jīng)過正己烷脫脂后，采用多反應動態(tài)監(jiān)測掃描方式進行測試。和目前我國文獻報道以及國家標準的相比較，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度與準確性，同時簡化了其中比較復雜的預處理過程，更加便于操作，能夠滿足獸藥殘留檢測的實際需求，可為動物源性食物中各種獸藥殘留的定性和定量分析提供參考。