李 杰 杭柏林董萌萌 寧春妹 司素錦 胡建和
(1河南省新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質量監(jiān)測檢驗中心,河南新鄉(xiāng) 453003;2河南科技學院動物科技學院,河南新鄉(xiāng) 453003)
大腸桿菌是革蘭氏陰性細菌的典型代表,是人與動物及環(huán)境中的常見細菌[1-2]。某些致病性大腸桿菌菌株可導致宿主的疾病[3]。某些血清型的大腸桿菌可致仔豬的黃痢、白痢和水腫病[4-5]。使用抗生素是治療和預防豬大腸桿菌病的常用措施。而在實際生產(chǎn)中,抗生素的濫用或不正確使用常常導致大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性或超級細菌[6-8]。耐藥菌的出現(xiàn)給大腸桿菌病的治療和預防帶來了極大挑戰(zhàn)。因此,必須及時關注豬體內大腸桿菌的耐藥性情況,以期為豬大腸桿菌病的治療和預防提供參考。本試驗從腹瀉豬體內分離、鑒定到一株耐21種抗生素的大腸桿菌,為豬大腸桿菌病的預防和治療奠定了基礎,也提出了挑戰(zhàn)。
2017年,5份糞便樣本采集自河南省南陽市某豬場腹瀉豬的十二指腸,4℃保存。
普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、伊紅美蘭(EMB)瓊脂、麥康凱(Maconkey)瓊脂購自北京奧博星生物技術有限責任公司,胰酶解酪蛋白大豆肉湯(TSB)購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。綿羊血和革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司??咕幬锼幟艏埰凹毦⒘可磻芫徸院贾菸⑸镌噭┯邢薰?。HBI腸桿菌科細菌生化鑒定條購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。2×Taq PCR Master Mix、DNA分子量標準、細菌基因組DNA提取試劑盒以及DNA純化回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。瓊脂糖購自上海藍季科技發(fā)展有限公司。pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司,大腸桿菌DH5a為本實驗室自行保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
恒溫培養(yǎng)箱(型號為DHP-9082),購自上海一恒科學儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌器(型號為LDFF-75KB),購自上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(型號為SW-CJ-2F),購自蘇州凈化設備有限公司;PCR儀(型號為T-Gradient Thermoblock),購自德國Sartocon公司;電泳儀(型號為DYY-6C),購自北京市六一生物科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(型號為Universal Hood II),購自美國BIO-RAD公司;高速離心機(型號為D-37620),購自美國熱電公司;光學顯微鏡(型號為BA310Digital),購自麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。
用滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2)將糞便樣品稀釋100倍。將50 μL稀釋液加入含有普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,并用“L”型玻璃推棒涂布均勻。將接種后的培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約18~24 h。挑取可疑菌落在新培養(yǎng)基上進行劃線接種。如此操作,分離和傳代,革蘭氏染色后判定細菌純度。將分離的細菌與EMB瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和胰酶解酪蛋白大豆肉湯(TSB)一起培養(yǎng),觀察其生長特征。
用革蘭氏染色法和美蘭染色法[5]對分離的細菌進行染色,用光學顯微鏡(BA310Digital,Motic)觀察分離細菌形態(tài),并拍照。
按照生化發(fā)酵管和HBI生化鑒定條的說明書進行細菌生理生化試驗。細菌在TSB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)18~24 h,再在TSB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3 h。將新鮮培養(yǎng)的細菌接種入生化發(fā)酵管和生化鑒定條中,置于37℃培養(yǎng)24~48 h,觀察實驗結果。
按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株的DNA,作為PCR擴增的模板。采用通用引物擴增分離菌株的16S rRNA基因。引物的序列為:8f:5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 和 1492r:5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’,預期片段大小為1 492bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增體系 (50 μL):Rnase-free H2O 21 μL,2×Taq PCR Master Mix 25 μL,上下游引物各 1 μL,DNA模板2 μL。PCR反應參數(shù):95℃預變性2 min,95℃變性20 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,35個循環(huán),最后72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,并使用DNA純化回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收并連接pMD19-T載體,轉化入大腸桿菌DH5a中,將重組菌液送上海生工有限公司測序。
將測序所得基因序列與GenBank公布的各株大腸桿菌16S rRNA基因序列進行BLAST比對,利用DNAStar軟件中Jotun Hein方法構建系統(tǒng)進化樹。
按照藥敏紙片說明書進行分離細菌的藥敏試驗。取100 μL對數(shù)期的分離細菌(1×108CFU/mL)用“L”型推棒均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂上,用無菌鑷子貼藥敏紙片于瓊脂表面,37℃培養(yǎng)24 h,參照CLSI(2014)標準進行結果判定[9]。
經(jīng)多次分離、傳代,成功從5份豬糞樣本中分離、純化得到1株細菌。分離細菌,經(jīng)美蘭染色后,菌體呈藍色、桿狀(如圖1B),經(jīng)革蘭氏染色后,菌體呈紅色、桿狀(如圖1A)。這表明,成功從樣本中分離到1株革蘭氏陰性桿菌。
將分離的細菌在不同培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),結果如圖2所示。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,分離細菌長成圓形、白色的菌落(如圖2A);在伊紅美蘭瓊脂上,分離細菌長成圓形、黑色、帶金屬光澤的菌落(如圖2B);在綿羊血瓊脂上,分離細菌長成圓形、白色的菌落,沒有溶血現(xiàn)象(如圖2C);在SS瓊脂上,分離細菌長成圓形、紅色的菌落(如圖2D);在麥康凱培養(yǎng)基上,分離細菌長成圓形、紅色的菌落(如圖2E);在TSA液體培養(yǎng)基中,經(jīng)18 h左右的培養(yǎng),整個菌液呈均勻渾濁狀(如圖2F)。分離細菌的培養(yǎng)結果與大腸桿菌的基本特性相符合。
圖1 細菌的染色與形態(tài)觀察 (×1 000)
圖2 分離菌株在不同培養(yǎng)基上的生長特性
將分離細菌進行生化試驗,結果如表1所示。分離細菌能發(fā)酵甘露醇、麥芽糖、蕈糖、乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,半固體穿刺、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、吲哚、MR、山梨醇、蜜二糖、棉子糖、七葉苷、乳糖的試驗結果呈陽性,西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、VP、苯丙氨酸、肌醇、核糖醇、水楊素、尿素的試驗結果呈陰性。參照文獻[10],符合大腸桿菌的生化特性。
通過PCR擴增分離細菌的16S rRNA基因序列,結果符合預期1 506 bp的擴增片段長度(如圖3)。
圖3 分離細菌的PCR擴增結果
將測定的分離細菌的16S rRNA基因序列輸入GenBank中進行BLAST比對分析,結果與大腸桿菌豬肉源 (CP025318株)、犬源 (CP023359株、CP010134株)、人源(CP022407株、CP018948株、CP023349株)的同源性均高達99.8%。根據(jù)不同屬細菌16S rRNA基因同源性為70%~90%,而同一種內不同株間基因同源性>99%[11],結合上述分離細菌的染色特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征,可以認為分離細菌為大腸桿菌,暫命名為ZB17090404326。
表1 分離菌株的生化試驗結果
通過鄰近法構建分離菌株ZB17090404326的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹,結果如圖5所示。從圖5中可以看出,分離菌株ZB17090404326與豬大腸桿菌CP025753株的親緣關系最近,所有參與構建進化樹的大腸桿菌菌株形成2個主要分支,分離菌株ZB17090404326單獨形成1個分支。這表明,分離菌株ZB17090404326是一個獨特的大腸桿菌分離株。
圖4 分離菌株的16S rRNA基因序列同源性比較結果
將分離菌株ZB17090404326進行藥物敏感性測定,結果如表2所示。從表2中可以看出,在測定的26種藥物中,分離細菌對21種藥物耐藥,對4種藥物敏感。這表明分離菌株ZB17090404326為高耐藥性細菌。
圖5 分離菌株的16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹
細菌的分離是從細菌的混合物中獲得某種細菌的純化物。只有獲得純化細菌,方可進行細菌的系統(tǒng)性鑒定[12]。而細菌的鑒定是一項系統(tǒng)工作,常需要檢測許多項目,如形態(tài)觀察、染色特性、培養(yǎng)特性、生化與生態(tài)特性、血清型鑒定、細菌毒力測定、核酸檢測等。一般講,細菌鑒定至少需要同時驗證3種指標[12]。形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性和生化特性等的觀察是細菌鑒定過程中最常用的方法。但現(xiàn)在細菌鑒定過程中,還常借助細菌16S核糖體RNA(ribosome RNA,rRNA)的測定。因為細菌16S rRNA是細菌進化過程中最為保守的基因,是細菌鑒定時常用的PCR擴增序列[13-14]。細菌16S rRNA基因可變區(qū)因細菌不同而異,是細菌分類的分子基礎,而其保守區(qū)的序列在不同細菌間基本相同,可反映細菌間的親緣關系[15]。因此,通過細菌16S rRNA基因序列的分析,可對分離的細菌進行鑒定,同時了解其演化特征。本研究通過細菌形態(tài)與染色特性、培養(yǎng)特性和生化特性的觀察,并結合16S rRNA序列的比對分析,鑒定從腹瀉豬十二指腸中分離的細菌為大腸桿菌。
細菌的耐藥性有單耐藥和多重耐藥。多重耐藥性細菌對疾病的預防和治療提出了挑戰(zhàn)與考驗。目前,大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為多見。賀丹丹等[16]對2011—2012年從患病和健康食品動物中分離鑒定到的935株大腸桿菌的耐藥性進行調查,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對15種抗菌藥物中的大部分藥物的耐藥率超過70%,以耐6~10種抗菌藥物的菌株數(shù)量最多,并有1株大腸桿菌能耐15種抗菌藥物。而在本研究中,分離的大腸桿菌能耐21種抗菌藥物。細菌的耐藥性主要有固有耐藥和獲得性耐藥[17]。獲得性耐藥是細菌形成耐藥性的主要原因[18]。而大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生也與長期使用抗生素有關[19]。細菌在抗生素選擇壓力下,為了生存而與抗生素對抗,通過改變新陳代謝或獲得耐藥性元件,從而形成獲得性耐藥。Collignon等[20]認為減少抗生素的使用不足以控制耐藥性,而耐藥菌株和耐藥基因的傳播是耐藥性嚴重的主要因子。耐藥基因的獲得是細菌獲得新耐藥特性的重要因素。隨著時間推移,大腸桿菌的耐藥率越來越高,耐藥譜越來越寬,多重耐藥菌株越來越多[21]。大腸桿菌的耐藥性情況已經(jīng)越來越嚴峻,對人類與動物的健康造成了巨大威脅[6]。因此,加強大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生意義。
表2 細菌的藥敏試驗結果