上海地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性現(xiàn)狀研究

陳 秀，張頌函，張正煒，黃蘭淇，何翠娟

(上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心/上海市農(nóng)藥檢定所，上海 201103)

灰霉病是一種世界性的重要病害，也是上海地區(qū)草莓生產(chǎn)上的一種重要病害，主要由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起，嚴(yán)重影響草莓的品質(zhì)和產(chǎn)量[1]。目前，化學(xué)防治仍是控制該病害的重要手段?；颐共【蟹敝晨?、遺傳變異大和適合度高等特點(diǎn)，連續(xù)使用同一藥劑極易產(chǎn)生抗藥性[2～3]。

啶酰菌胺是由德國(guó)巴斯夫公司1992年開發(fā)、2004年登記的煙酰胺類殺菌劑，2006年在歐美等國(guó)家已廣泛應(yīng)用[4]。作為防治蔬菜瓜果灰霉病效果優(yōu)良的一種較新的殺菌劑，啶酰菌胺已連續(xù)5年作為“上海市農(nóng)藥重點(diǎn)推薦品種”推薦農(nóng)戶使用。啶酰菌胺屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑類(succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)殺菌劑，能與呼吸鏈上的蛋白質(zhì)復(fù)合物Ⅱ的輔酶Q位點(diǎn)特異結(jié)合，抑制病原菌琥珀酸脫氫酶活性，從而干擾其呼吸作用[4]。SDHIs已廣泛用于防治蔬菜、果樹等作物的灰霉病，但由于其作用位點(diǎn)單一，長(zhǎng)期廣泛的使用容易產(chǎn)生田間抗性菌株，國(guó)際殺菌劑抗性委員會(huì)已將其歸為中度抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑[5]。啶酰菌胺是此類殺菌劑中的重要品種，故其抗性風(fēng)險(xiǎn)備受關(guān)注。

目前，灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性菌株在國(guó)外已有多例報(bào)道[6]，國(guó)內(nèi)也有檢測(cè)出抗性菌株的報(bào)道[7]，但上海地區(qū)灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性現(xiàn)狀尚無系統(tǒng)研究及報(bào)道。啶酰菌胺作為上海的重點(diǎn)推薦農(nóng)藥品種，開展灰霉病菌對(duì)其的抗性現(xiàn)狀研究對(duì)進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、指導(dǎo)科學(xué)合理用藥和提出抗性管理措施具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集與分離 2016年3～5月，在上海地區(qū)19個(gè)草莓種植點(diǎn)采集了草莓灰霉病樣。病樣采集采用經(jīng)無菌水浸濕的消毒棉簽輕輕蘸取病果表面灰霉菌霉層后直接放入自封袋中，每個(gè)病果只蘸取1次。每種植點(diǎn)采集5個(gè)大棚，同一個(gè)大棚中采集病果2～3個(gè)，每種植點(diǎn)共采集病果10～15個(gè)。

用鑷子從棉簽上挑取少量粘附菌體的棉絮，接種在含硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基平板上。置于25℃培養(yǎng)4～5d(直到產(chǎn)生孢子為止)，用滅菌的挑針挑取孢子，移到新的培養(yǎng)基平板上，獲得115株純分離物。將115株純分離物編號(hào)后保存在凍存管斜面上，置于4℃保存，供試草莓灰霉病菌菌株(表1)。

表1 供試草莓灰霉病菌菌株及其來源

續(xù)表

1.2 供試藥劑與培養(yǎng)基 啶酰菌胺原藥(98.0%)由上海悅聯(lián)化工有限公司提供。

培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。稱取37g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)粉，加入1 000mL蒸餾水，加熱煮沸溶解，121℃高壓滅菌20min，配制PDA培養(yǎng)基。草莓灰霉菌株分離純化制作培養(yǎng)基平板前加入硫酸鏈霉素，調(diào)整終濃度為100mg/L。測(cè)定草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺敏感性數(shù)據(jù)時(shí)，將啶酰菌胺母液按一定比例加入配制好的PDA培養(yǎng)基(滅菌后，冷卻至50℃左右加入)，配制成系列濃度的含藥培養(yǎng)基。

1.3 草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺敏感性的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[8]，將分離得到的115株灰霉菌株在含藥平板上進(jìn)行對(duì)啶酰菌胺敏感性的測(cè)定。將已純化的灰霉菌株接種于PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)至近全皿時(shí)，用直徑5mm的打孔器在菌落邊緣打取菌塊，表面朝下接種于系列含藥的PDA平板上，以無藥的PDA平板作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。將接上菌塊的培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0進(jìn)行處理，求出毒力回歸方程和EC50值。

灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感基線參照張傳清等2007年報(bào)道的采用菌落直徑法建立的灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感基線1.07±0.11mg/L[9]。抗性指數(shù)(RF)=測(cè)定菌株的EC50/敏感基線的EC50[10]；敏感菌株(S)：RF≤5，低抗菌株(LR)：5100[11]。

1.4 啶酰菌胺對(duì)草莓灰霉病田間藥效試驗(yàn) 2017～2018年，在4個(gè)草莓種植點(diǎn)開展了50%啶酰菌胺水分散粒劑防治草莓灰霉病的田間藥效試驗(yàn)(每年2點(diǎn))。試驗(yàn)劑量設(shè)為50%啶酰菌胺水分散粒劑防治草莓灰霉病登記的最高制劑用量45g/667m2，間隔7d施藥1次，共施藥3次，考察啶酰菌胺防治草莓灰霉病的實(shí)際防效。試驗(yàn)中以生產(chǎn)上種植戶常用來防治草莓灰霉病的嘧霉胺常用劑量作為對(duì)照。具體試驗(yàn)方法參照農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(二)第120部分[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海地區(qū)草莓灰霉菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性 采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)分離獲得的115株灰霉菌株進(jìn)行測(cè)定，獲得上海地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的EC50值。各區(qū)灰霉菌株的EC50值分布范圍和平均EC50值(表2)。由表2可看出，所有灰霉菌株EC50值在0.028～186.435mg/L之間，不同菌株之間EC50值有較大的差異，表明上海地區(qū)草莓灰霉菌株對(duì)啶酰菌胺的敏感性已產(chǎn)生了一定程度的分化。

參考張傳清等2007年報(bào)道的灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感基線1.07±0.11mg/L，可以得出抗性菌株共檢測(cè)到16株，其中低抗菌株2株、中抗菌株12株、高抗菌株2株。上海地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性頻率為13.9%，以中抗為主(10.4%)，低抗和高抗頻率均為1.74%。從各區(qū)的抗性菌株檢出情況來看(表3)，閔行、奉賢和崇明未檢測(cè)到抗性菌株，青浦抗性菌株檢出率最高、嘉定和浦東次之。測(cè)得的2株高抗菌株分別是青浦1株和浦東1株。

表2 上海9個(gè)區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性測(cè)定數(shù)據(jù)

表3 上海地區(qū)草莓灰霉病菌抗性菌株數(shù)量及比例

2.2 啶酰菌胺防治草莓灰霉病田間藥效試驗(yàn)數(shù)據(jù) 本文還研究了50%啶酰菌胺水分散粒劑在最高登記劑量(45g/667m2)防治草莓灰霉病的田間藥效，試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表4)。從2年的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)看，啶酰菌胺對(duì)草莓灰霉病的防效優(yōu)于嘧霉胺，防效尚可，在75.45%～83.72%之間。方差分析表明僅2018年第3次藥后二藥劑在試驗(yàn)劑量下對(duì)草莓灰霉病的防效差異顯著。從年度間進(jìn)行比較，2017、2018兩年間啶酰菌胺對(duì)草莓灰霉病的防效差異并不明顯。就田間實(shí)際防效來看，目前在上海地區(qū)使用啶酰菌胺防治草莓灰霉病是可行的。

表4 50%啶酰菌胺水分散粒劑防治草莓灰霉病田間藥效試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本文測(cè)定了上海地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的敏感性數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，上海地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺已經(jīng)產(chǎn)生了一定的抗性，總抗性頻率為13.9%，抗性菌株多為中抗菌株(10.4%)，但也檢測(cè)到2株高抗菌株(1.7%)，抗性狀況需引起一定的重視。啶酰菌胺防治草莓灰霉病三次藥后的田間防效在80%左右，防效尚可滿足生產(chǎn)需要，數(shù)據(jù)表明目前在上海地區(qū)使用啶酰菌胺防治草莓灰霉病仍舊是可行的。

結(jié)合兩方面的研究數(shù)據(jù)，筆者認(rèn)為，在實(shí)際生產(chǎn)中要加強(qiáng)對(duì)草莓種植戶的宣教，指導(dǎo)其科學(xué)合理用藥，輪換使用防治草莓灰霉病的殺菌劑，可加大使用生物制劑如枯草芽孢桿菌的使用次數(shù)，避免長(zhǎng)時(shí)間使用啶酰菌胺造成灰霉病菌對(duì)其抗性的急劇發(fā)展，延長(zhǎng)防效優(yōu)良的殺菌劑啶酰菌胺的使用壽命。