聰耳通竅劑干預(yù)豚鼠慶大霉素耳毒性聾作用的機制探討

李羴唐俊波韋瑀龍陳壯宣毅陳思仲宣偉軍，2*

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科（南寧530023）

2廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科（南寧530011）

3廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院制藥廠（南寧530011）

4 School of engineering,Tufts university,USA（Medford MA02155）

最近研究表明[1-3]，中藥復(fù)方健耳劑具有顯著對抗C57BL/6J小鼠老年性耳蝸毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡及保護聽力的作用，中藥聰耳通竅劑系中藥復(fù)方健耳劑側(cè)重健脾補腎藥的同方同量但不同比例姐妹方，為了解其干預(yù)慶大霉素(gentamycin，GM)耳毒性聾影響作用與藥效機制，我們以豚鼠GM耳、腎毒性損害作為模型，通過觀察耳蝸毛細胞、聽性腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response,ABR）測聽、腎組織切片、血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）濃度、耳蝸超氧化物歧化酶1（Superoxide dismutase-1，SOD1）以及腎組織的細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激 酶 -1（apoptosis signal regulating kinase-1，ASK-1）、硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）、caspase-3表達等變化情況，了解該中藥對GM耳、腎毒性的防護作用，探討抑制活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)分子作用途徑，以及通過護腎，達到護耳的作用機制，同時揭示以中醫(yī)健脾補腎理論為主指導(dǎo)防聾治聾的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 動物

選擇健康無中耳疾患，耳廓反射靈敏，體重平均300g，2月齡雜色豚鼠60只，雌雄不拘，由昆明市艾尼莫實驗動物養(yǎng)殖中心提供，清潔級別一級，通過動物實驗倫理審核，動物合格證號：SCXK（滇）K2012-0002。

1.2 藥物

聰耳通竅劑主要由黃芪、葛根、骨碎補、女貞子等組成。按照中成藥膠囊藥物提取技術(shù)和方法，經(jīng)過水煮、濃縮、烘干、反復(fù)粉碎和過篩等流程，制成每克藥粉相當(dāng)于6.63克生藥材制劑。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》（4）實驗動物用量換算法得出單倍劑量0.9985g/kg·d，經(jīng)初步研究對比最終設(shè)定該藥的豚鼠實驗用量為3.994/kg·d。硫酸慶大霉素注射液80mg/支，由貴州天地藥業(yè)有限公司提供（批號：15062403B）。烏拉坦1000g/瓶，由都萊生物科技有限公司提供（批號：20160701）。戊巴比妥鈉0.5g/瓶，由德國Merck提供（批號：20161201）。

1.3 試劑及儀器

琥珀酸鈉25g/瓶，由天津科密歐化學(xué)試劑有限公司提供（批號：20150110）。氯化硝基四氮唑藍250mg/瓶，由amresco提供（批號：20151112gl）。尿素氮、肌酐試劑盒購自南京建成生物工程研究所；分光光度計由上海奧析科學(xué)儀器有限公司提供（型號：UV-1901PC）。mRNA合成單鏈擴增逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；熒光定量PCR引物設(shè)計在NCBI數(shù)據(jù)庫查找相關(guān)序列，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；Gold-View I型核酸染色劑購于上海索萊寶生物科技有限公司；總RNA抽提試劑盒由美國Axygen公司提供；中強度RIPA裂解液(產(chǎn)品號：FD008)、蛋白酶抑制劑混合物(產(chǎn)品號：FD1001)、100 mM PMSF（產(chǎn)品號：FD100）、蛋白磷酸酶抑制劑混合物（產(chǎn)品號：FD1002）、BCA蛋白定量試劑盒（產(chǎn)品號：FD2001）均由弗德生物公司提供；5*蛋白上樣緩沖液（產(chǎn)品號：AR1112）由博士德公司提供；Tris-base（產(chǎn)品號：V900483）由Vetec公司提供；甘氨酸（產(chǎn)品號：G800880）、過硫酸銨（產(chǎn)品號：A801035）、N.N-甲叉雙丙烯酰胺（產(chǎn)品號：N813086-100g）均由Macklin公司提供；PDVF膜（產(chǎn)品號：IPVH00010）由Millipore公司提供；預(yù)染蛋白標(biāo)志物（產(chǎn)品號：26616）由Fermentas公司提供；SDS（產(chǎn)品號：0227）由Amresco公司提供；一抗Anti-ASK1Antibody（產(chǎn)品號：ab45178）、Anti-TRX antibody（產(chǎn)品號：ab109385）、Anti-Caspase-3 antibody（產(chǎn)品號：ab13847）均由Abcam公司提供；二抗Hrp-Goat Anti-Rabbit IgG（產(chǎn)品號：111-035-003）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（產(chǎn)品號：111-035-003）均由Jackson公司提供。采用美國Bio-Rad實時定量PCR檢測系統(tǒng)-MyiQ5 Real Time PCR Detection System；聽性腦干反應(yīng)測試儀采用美國TDT公司的TDT-III型聽覺生理檢測系統(tǒng)及BioSigRP軟件；電磁屏蔽箱由上海電子器械廠提供；多功能酶標(biāo)儀（型號：DG5033A）由南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司提供；電泳儀（型號：DYY-7C）由北京六一儀器廠提供。

1.4 動物分組及給藥

將60只動物隨機分為正常對照組、慶大霉素對照組（GM對照組）、聰耳通竅劑+慶大霉素組（中藥+GM組）各20只，其中GM對照組按200mg/kg·d劑量，每天注射2次，兩側(cè)大腿及腹腔交替注射，連續(xù)9天，第11天終止飼養(yǎng)；GM+中藥組預(yù)先連續(xù)服用聰耳通竅劑10天，然后在繼續(xù)服用中藥同時開始注射GM，GM用量和方法同GM對照組，連續(xù)9天同時停藥，第11天終止飼養(yǎng)；正常對照組則按常規(guī)飼養(yǎng)至11天。中藥+GM組每天劑量的1/2用于人工灌服，1/2溶入自吸水瓶中，供豚鼠同時自動飲用，在沒有其它水源供應(yīng)的實驗條件下，實驗動物因生理需要而必須每天攝取足夠的飲水，因而也就保證了實驗豚鼠每天都能攝取到規(guī)定的藥物劑量。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

每組各取6只動物用于檢測ABR，觀察聽功能變化。第11天期滿后每組各取6只動物耳蝸應(yīng)用Real Time PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測SOD1表達；8只動物取耳蝸應(yīng)用耳蝸鋪片技術(shù)，琥珀酸脫氫酶染色方法，觀察毛細胞形態(tài)學(xué)變化；取心臟血應(yīng)用分光光度計檢測BUN、Cr，觀察腎功能變化；取右側(cè)腎臟用于腎組織切片，應(yīng)用HE染色，觀察腎組織病理變化，其中每組6只動物左側(cè)腎臟用于westernblot檢測腎組織ASK-1、Trx、caspase-3蛋白。

1.6 ABR檢測

戊巴比妥鈉用無菌生理鹽水配成1%濃度，按30mg/Kg對豚鼠進行腹腔注射，深度麻醉后移入測聽室內(nèi)的電磁屏蔽箱進行ABR檢測，其中豚鼠顱頂正中皮下插入?yún)⒖茧姌O，耳廓后緣皮下插入測試電極，接地電極橫向安放在鼻尖處，測試電極阻值小于1k歐，ER-10C耳機固定在受測豚鼠的外耳道口，然后進行短聲刺激，以21次/秒為重復(fù)率，強度范圍在10-110dBSPL，疊加1024次，在帶通濾波300-3000Hz，共掃描時間10ms，由BioSigRP軟件匯總記錄數(shù)據(jù)，計算III波反應(yīng)閾值。取正常對照組ABR閾值分別與GM對照組、中藥+GM組第5、7、9天的ABR閾值進行比較，觀察不同時間的聽力改變情況。

1.7 耳蝸毛細胞形態(tài)學(xué)觀察

用無菌生理鹽水將烏拉坦配成20%，按1.5g/Kg經(jīng)腹腔注射麻醉，心臟抽吸血液用于腎功能指標(biāo)檢測，然后迅速斷頭，打開聽泡取耳蝸用于耳蝸鋪片或RT-PCR檢測，同時取腎臟用于腎組織切片。供RT-PCR用動物耳蝸浸泡于RNA保護液中，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩ＤI臟浸入10%中性福爾馬林固定，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。豚鼠耳蝸鋪片技術(shù)采用前期琥珀酸脫氫酶染色成功經(jīng)驗[1]，主要方法是將動物蝸尖鉆孔并摘除鐙骨同時打開園窗，向耳蝸內(nèi)灌入琥珀酸脫氫酶染色液，由0.2M琥珀酸鈉、0.2M磷酸鹽緩沖液、0.1%氯化硝基四氮唑藍配制而成，在37℃恒溫箱內(nèi)作用40分鐘到60分鐘，然后將耳蝸浸入10%中性福爾馬林固定液固定24小時，常規(guī)脫鈣后分離取出全耳蝸基底膜，移入載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固。在標(biāo)記單位長度為0.01 mm刻度的光學(xué)顯微鏡下，分別放大100、200、400倍鏡觀察各組實驗動物全耳蝸鋪片各回基底膜上毛細胞形態(tài)變化情況，然后分別截取每組每個樣本耳蝸各回同等部位三排外毛細胞，在同等單位距離內(nèi)計數(shù)，其中正常對照組、中藥+GM組選擇形態(tài)正常外毛細胞納入統(tǒng)計范圍，GM對照組凡能夠辨認出有形細胞體也納入統(tǒng)計范圍，最后應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

1.8 RT-PCR對耳蝸SOD1mRNA檢測

選擇PCR參考引物序列ACTB(5'-3')：上游GAAGAGCTATGAGCTGCCTGA；下游GCAGCAAAGTAGTAACAGTCCG；長度(bp)441。PCR目標(biāo)引物序列SOD1上游5’-AAGCACGGATTCCATGTCCA-3'；下 游 5'-TTGCCCAGGTCATCTGGTTT-3'；長度(bp)260。

將耳蝸移至預(yù)冷的研缽中，研磨成粉末。按照總RNA小量制備試劑盒步驟提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)合成cDNA。加入引物，在實時定量PCR儀檢測系統(tǒng)中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min,然后經(jīng)過95℃15s，60℃1min,共40個循環(huán)，60℃延伸1min，測出內(nèi)參基因ACTB和目的基因SOD1在不同樣本中擴增的Ct值，2-△△Ct法計算基因表達量差異倍數(shù)值。

1.9 分光光度計檢測BUN、Cr

血液離心，取上清液作為樣品。按照試劑盒說明書操作方法，配置標(biāo)準(zhǔn)加樣，分別做成標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測定管，其中BUN檢測條件，各管37h水浴10分鐘，640nm波長測定各管吸光度值。Cr檢測條件，各管37℃孵育5分鐘，546nm波長測定A1、A2各管吸光度值。最后按照公式計算出尿素氮、Cr終值，即：

1.10 腎組織切片染色

腎臟經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。取5μm切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色，鹽酸乙醇分色，最后伊紅染色。光學(xué)顯微鏡分別在100、200、400等放大倍數(shù)下觀察腎小球、腎小管及細胞等病理改變情況并作對比。

1.11 Western blot檢測腎組織 ASK-1、Trx、caspase-3蛋白

取每組6個動物腎組織同部位等量小塊，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上徹底勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管，振蕩，冰浴30min，移液器反復(fù)吹打，致細胞完全裂解，離心，收集上清，即為總蛋白溶液。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品蛋白濃度，加入適當(dāng)體積的蛋白上樣緩沖液進行沸水浴，分灌分離膠、濃縮膠，加電泳液,上樣電泳（濃縮膠75V，分離膠120V），經(jīng)甲醇活化的PVDF膜轉(zhuǎn)膜(200mA，1h),室溫下脫色搖床上用0.5%TBST配制的5%的脫脂牛奶封閉1h,加入TBST溶解的5%脫脂牛奶（或TBST溶解的5%BSA）稀釋一抗，4℃過夜，在室溫下脫色搖床上TBST復(fù)洗，加入稀釋二抗，室溫下孵育30min后，在室溫下脫色搖床上TBST復(fù)洗。常規(guī)化學(xué)發(fā)光顯色法進行染色和顯色，最后顯影和定影，拍照，將膠片進行掃描存檔，Image J軟件處理系統(tǒng)計算和分析目標(biāo)帶的灰度值。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以xi s表示，兩兩比較用LSD-t檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

ABR檢測結(jié)果顯示（表1），第5天，GM對照組與正常對照組比較，ABR閾值差異具有顯著意義（P＜0.05）,與中藥+GM組比較尚無顯著性差異（P＞0.05），而中藥+GM組與正常對照組比較，則差異無顯著意義（P＞0.05）。第7天，GM對照組ABR閾值繼續(xù)增高，與中藥+GM組比較開始出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），第9天平均閾值已超過90dBSPL，聽力幾乎喪失，與其它兩組比較，短期差異繼續(xù)擴大（P＜0.01）。第9天中藥+GM組與前期聽力比較仍保持無顯著性差異（P＞0.05），但與正常對照組比較開始出現(xiàn)差異具有顯著性意義（P＜0.05）。

各組動物第11天全耳蝸鋪片結(jié)果顯示（圖1），正常對照組各回三排外毛細胞以及內(nèi)毛細胞形態(tài)正常，數(shù)量完整，排列有序，清晰可辨（圖1.A1-A3）。GM對照組三排外毛細胞損毀嚴(yán)重，絕大部分細胞出現(xiàn)嚴(yán)重崩解不全，或凋亡縮小，但內(nèi)毛細胞仍基本存在，清晰可辨（圖1.B1-B3）。中藥+GM組三排外毛細胞正常數(shù)量雖然不如正常對照組多，但除少量而且散在崩解不全外，大多仍存留可辨，形態(tài)如常，內(nèi)毛細胞仍保持完整，清晰可辨(圖3.C1-C3)。各組各回三排外毛細胞統(tǒng)計如表2所示，其中GM對照組第1回與第3回比較差異顯著（P＜0.01），與正常對照組、中藥+GM組對應(yīng)第1、2、3回之間比較，差別均有顯著性意義（P＜0.01）。中藥+GM組各回與正常對照組比較，差別也有顯著性意義（P＜0.01）。

圖1 耳蝸基底膜鋪片：A為正常對照組；B為GM對照組；C為中藥+GM組（注：1、2、3分別表示所在耳蝸第1、2、3回位置。琥珀酸脫氫酶染色。放大倍數(shù)：10X40）Fig.1 Stretched preparations of cochlear basement membrane：A as the normal control group,B as the GM control group,C as the CH+GM group(Note:1,2,3 respectively indicate to be located in the first turn,second turn and third turn in cochlea.Succinate dehydrogenase stain.Magnification：10X40)

表1 三組動物ABR閾值比較（dBSPL，xi SD）Table 1 Comparison ofABR thresholds in three groups of animals（dBSPL，x±SD）

各組動物耳蝸組織SOD1mRNA、血清BUN和Cr檢測結(jié)果顯示（表3），中藥+GM組無論耳蝸組織SOD1mRNA，或與正常對照組或GM對照組比較差異均具有顯著性或非常顯著性意義（P＜0.01，P＜0.05），即明顯高于其它兩組，而其血清BUN和Cr與GM對照組比較也具有非常顯著性差異（P＜0.01），即明顯低于GM對照組，但其Cr與正常對照組比較,兩組差異具顯著性意義（P＜0.05）。GM對照組血清BUN和Cr與正常對照組比較，差異均具有非常顯著性意義（P＜0.01），即明顯高于正常對照組。

腎臟切片染色結(jié)果顯示（圖2），正常對照組腎皮質(zhì)、髓質(zhì)無改變，腎小管結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細血管網(wǎng)略充血，余無異常（圖A1-2）。GM對照組呈腎皮質(zhì)增厚，腎小球彌漫性增大，毛細血管網(wǎng)充血，腎小球內(nèi)細胞數(shù)目明顯增多，提示增生改變，部分球囊腔閉鎖，或腎球囊及毛細血管間質(zhì)內(nèi)可見纖維素及白細胞樣滲出物，近曲小管上皮細胞明顯濁腫（圖B1-2）。中藥+GM組腎皮質(zhì)、髓質(zhì)無明顯改變，僅極少數(shù)腎小球有所偏大，或輕度充血，其內(nèi)細胞數(shù)目稍增多，部分腎小管上皮細胞輕度濁腫，余也未見明顯改變(如圖C1-2)。

圖2 腎組織切片：A為正常對照組；B為GM對照組；C為中藥+GM組（注：1、2分別為放大倍數(shù)10x20,10x40。藍色箭頭示腎小球；綠色箭頭示腎小球囊腔；黑色箭頭示腎小管。HE染色）Fig.2 Slices of nephridial tissue:A as normal control group;B as GM control group;C as CH+GM group(Note:1,2 respectively indicate magnification of 10 X 20,10 X 40).The blue arrow indicates the glomerulus;the green arrow indicates the glomerular sac;and the black arrow indicates the renal tubule.HE stain)

Western blot檢測各組動物腎組織ASK-1、Trx、caspase-3蛋白統(tǒng)計結(jié)果顯示（表4），GM對照組與正常對照組比較，其中ASK-1、caspase-3高于正常對照組和中藥+GM組，Trx則低于正常對照組和中藥+GM組，它們的差異均具有顯著性意義（P＜0.05）。而中藥+GM組與正常對照組比較，除對Trx、ASK-1的表達兩者差別無顯著性意義外（P＞0.05），對caspase-3表達則高于正常對照組（P＜0.05）。

表2 三組動物耳蝸各回三排外毛細胞統(tǒng)計比較（個/0.05mm，xi SD）Statisticalcomparisonofthreerowsofouterhaircellsfromcochleareachturninthreegroupsofanimal（sNumber/0.05mm，x±SD）

表3 三組動物SOD1mRNA、BUN、Cr含量統(tǒng)計比較（xi SD）Table 3 Statistical comparison of SOD1 mRNA,BUN and Cr contents in three groups of animals（x±SD）

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為，耳屬清竅，脾主升清降濁，清陽出上竅，“脾為孤臟，…其不及則令九竅不通”（《素問·玉機真藏論》），而“陽明為諸脈之海，故胃中空則宗脈虛，宗脈虛則陽氣不升而下流，下流則上竭，輕則為鳴，重則為聾矣”（《類經(jīng)·十八卷·疾病類·口問十二邪之刺》）；“腎主耳,在竅為耳”（《素問·陰陽應(yīng)象大論》），“腎氣通于耳，腎和則能聞五音矣”（《靈樞·脈度篇》），腎主藏精，“精脫者耳聾”（《靈樞·決氣篇》）。故耳的生理功能有賴于脾、腎正常功能的維系，若脾、腎不足則易致耳竅失聰，耳與脾、腎生理和病理關(guān)系密切。古代中醫(yī)文獻記載的以健脾為主的“益氣聰明湯”（《證治準(zhǔn)繩》），以補腎為主的“耳聾左慈丸”（《重訂廣溫?zé)嵴摗罚┘词侵委煻@耳鳴的脾、腎理論代表方劑。聰耳通竅劑方組以黃芪、葛根、骨碎補、女貞子為主，則是取黃芪等健脾益氣，葛根等升清降濁，骨碎補、女貞子等補腎益精，互相配伍，相得益彰，寓脾腎兼施為主之意。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有廣泛的藥理影響作用，其中可提高紅細胞膜Na+,K+-ATP酶活性，可使紅細胞超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高，促進抗氧化作用，延長組織細胞壽命，促進核酸蛋白質(zhì)代謝；提高血清cAMP含量，抑制血小板功能，擴張外周血管，改善微循環(huán)，強心和抗心肌缺血，提高組織細胞耐缺氧能力。對腎衰大鼠，黃芪可改善腎組織病理變化，明顯降低血清BUN、Cr等。葛根具有顯著改善腦微循環(huán)障礙、抗氧化與清除自由基、抗缺氧、抗凝血和解痙等廣泛藥理作用。骨碎補則能提高組織中酸性磷酸酶活性，促進蛋白多糖合成；改善軟骨紅細胞的功能，推遲細胞推遲性變，尤其是對卡那霉素、鏈霉素所致耳毒副反應(yīng)也有一定的預(yù)防作用。女貞子同樣具有明顯提高機體SOD活性，增強清除自由基；調(diào)節(jié)機體免疫功能；抗應(yīng)激，提高組織細胞缺氧耐受力[5]。

GM屬于臨床廣為使用的第一線氨基甙類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn），眾所周知，無論GM或其它AmAn，若誤用或濫用，由此產(chǎn)生耳毒性和腎毒性副作用也隨之增加。本次研究顯示，GM對照組聽力伴隨著GM日益累積而不斷下降，至第9天ABR平均閾值已超過90dBSPL，說明聽力幾乎喪失，與正常對照組和中藥+GM組比較，差別顯著，并且不斷擴大，說明短期內(nèi)聽力急劇下降，聽力破壞嚴(yán)重，而中藥+GM組前后ABR閾值則無統(tǒng)計學(xué)差別，說明聽力保護較好。第11天毛細胞形態(tài)學(xué)顯示，GM對照組耳蝸各回外毛細胞成片狀毀損嚴(yán)重，這與GM流經(jīng)單位面積同等濃度相關(guān)，而內(nèi)毛細胞基本不受影響，說明GM主要選擇性破壞外毛細胞。外毛細胞損害底回較頂回明顯，可能與GM流經(jīng)耳蝸途徑先后和儲蓄不同有關(guān)。同時，腎小管和腎小球也受到嚴(yán)重損害，血清BUN、Cr濃度明顯增加，與正常對照組比較，差別顯著，表明腎組織病理改變明顯，腎功能明顯障礙。中藥+GM組無論耳蝸外毛細胞和聽力，還是腎組織和腎功能則損害較輕，與GM對照組比較差別顯著，其外毛細胞損害呈散在性，可能與中藥對抗藥理作用不均有關(guān)，但與正常對照組比較，第9天ABR閾值與第11天耳蝸外毛細胞計數(shù)統(tǒng)計兩者結(jié)論相符，也有顯著性差別。由此表明，以健脾補腎為主的該中藥制劑具有較好保護GM耳、腎毒性作用，但未能達到完全保護效果。其護耳與護腎關(guān)鍵作用機制與其抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，干預(yù)ROS介導(dǎo)的細胞死亡徑路有關(guān)，而通過護腎，促進GM排泄，是其間接護耳的重要機制。

通過護腎，促進GM排泄途徑，間接保護耳蝸。AmAn體內(nèi)代謝動力學(xué)，幾乎是從腎臟排除到體外，對腎臟可構(gòu)成直接損害，可導(dǎo)致急性腎衰竭，而耳神經(jīng)毒性又是其主要并發(fā)癥，因此臨床應(yīng)用時認為監(jiān)測患者的腎功能狀況很重要[6]，換言之，腎功能不全或衰竭勢必影響GM的正常排泄，加劇耳蝸GM儲蓄，進而加重耳蝸外毛細胞的破壞。有臨床資料報道[7,8]，腎病患者，由于腎功能不全或衰竭，應(yīng)用AmAn導(dǎo)致耳毒性損害的危險性和發(fā)病率明顯增加。有學(xué)者應(yīng)用血清肌酐、腦干電位和耳蝸鋪片研究卡那霉素腎毒性與耳毒性的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)用藥期間，在出現(xiàn)耳毒作用之前首先出現(xiàn)腎毒作用，聽功能的改變出現(xiàn)較遲,因此認為腎功能的變化是耳中毒的先兆，提出應(yīng)用卡那霉素過程中，監(jiān)測腎功能的改變，在發(fā)現(xiàn)腎功能損害時及早停用抗生素，可以防止或減輕中毒性耳聾的發(fā)生的觀點[9]。本次研究表明，GM對照組腎組織受損嚴(yán)重，腎功能障礙指標(biāo)血清BUN和Cr的含量明顯增加，而聰耳通竅劑能夠顯著降低豚鼠GM腎毒性損害模型的血清BUN和Cr的含量，防護腎小管和腎小球等腎組織的病理改變，提示該中藥具有較好的保護腎組織和腎功能的作用，其護腎作用將有利于保障GM從腎臟排泄，減輕耳蝸GM儲蓄，進而緩解GM耳毒性損害。有關(guān)護腎機制，近來有報道證實[10]，通過GM導(dǎo)致大鼠腎毒性損害研究表明，與正常對照組比較，GM可顯著升高血清BUN和Cr、腎組織ROS和MDA水平，減少腎谷胱甘肽酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，而口服抗氧化劑水飛薊素和褪黑激素后，前述指標(biāo)結(jié)果則與GM對照組相反，說明GM腎毒性損害機制與ROS產(chǎn)生，觸發(fā)系列細胞凋亡密切相關(guān)，利用某些抗氧化劑可起到有效保護腎臟作用。本次研究表明，中藥+GM組耳蝸SOD1表達明顯高于正常對照組和GM對照組，先前研究顯示[2,3]，聰耳通竅劑同組合不同側(cè)重的姐妹方復(fù)方健耳劑具有顯著降低耳蝸氧自由基產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量與下調(diào)Caspase-3表達的藥效作用，本次針對腎組織研究還表明，中藥+GM組腎組織Caspase-3表達明顯低于GM對照組，提示該復(fù)方中藥通過降低GM導(dǎo)致的機體細胞ROS產(chǎn)生,從而有效對抗Caspase介導(dǎo)的細胞凋亡的發(fā)展進程，因此認為這是聰耳通竅劑護腎藥效關(guān)鍵分子作用機制之一。

表4 三組動物腎組織western blot測定蛋白結(jié)果統(tǒng)計比較（灰度值，xi SD）Table 4 Statistical comparison of renal tissues proteinic.Results measured by western blot in three groups of animals(gray value,x±SD)

通過SOD-ROS徑路，清除自由基，直接保護耳蝸。AmAn耳毒性機理復(fù)雜，其中氧化應(yīng)急反應(yīng)、自由基損傷學(xué)說則被認為是其重要原因[11，12]。AmAn通過誘導(dǎo)活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS），破壞細菌細胞內(nèi)線粒體DNA結(jié)構(gòu)，則是其間接抑制細菌蛋白質(zhì)合成或直接殺菌的重要機制之一[13，14]，但超細胞水平的過量ROS將導(dǎo)致機體蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、膜和細胞器廣泛損壞，或激活細胞死亡通路,導(dǎo)致細胞凋亡[15]。因此，AmAn所誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS既是其殺菌的有利機制方面，同時又成為可以損害細胞的不利機制因素。研究表明[12,16]，AmAn耳毒性毛細胞損害是屬于由ROS介導(dǎo)Caspase通路，或激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，啟動細胞死亡級聯(lián)程序，從而誘導(dǎo)的細胞凋亡。AmAn所產(chǎn)生和累積的ROS構(gòu)成了對宿主耳蝸毛細胞內(nèi)線粒體DNA的直接損害，引起伴隨著耳蝸毛細胞和神經(jīng)元的退化的永久性雙側(cè)重度高頻感音神經(jīng)性聽力損失和臨時性前庭功能低下，形成鐵-氨基甙類復(fù)合物，或線粒體鈣轉(zhuǎn)運代謝異常則被認為是促使ROS介導(dǎo)的耳蝸內(nèi)細胞損害病理過程的重要環(huán)節(jié)[17，18]。新近報道[19]，在大鼠耳蝸柯替氏器體外培養(yǎng)MG損害毛細胞模型中，加入一種產(chǎn)自日本的強抗氧化劑藥物Hangesha-shin-to(TJ-014)，通過毛細胞計數(shù)，免疫組化法檢測TJ-014對Caspase-3、8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8OHDG）的影響等方法，發(fā)現(xiàn)其具有保護耳蝸毛細胞的作用，并證實其作用機制與其阻止ROS觸發(fā)Caspase介導(dǎo)的細胞凋亡，保護線粒體膜有關(guān)。之前也有類似文獻報道[20]，利用一種由松果體分泌的、被認為具有強大直接和間接抗氧化劑特性的褪黑激素，在MG導(dǎo)致大鼠耳蝸橢圓囊毛細胞損害模型實驗中，發(fā)現(xiàn)其作為抗氧化劑同樣具有保護耳蝸毛細胞作用，并通過熒光探針法評估ROS、檢測Caspase-3，研究結(jié)果表明褪黑激素通過抑制ROS產(chǎn)生和Caspase-3活性達到對抗GM誘導(dǎo)的大鼠毛細胞損失的作用。因此，應(yīng)用抗氧化劑防治AmAn耳毒性已成為研究熱點之一。結(jié)合本次研究與既往研究[2,3]，聰耳通竅劑具有顯著提高耳蝸SOD1表達，其來源方復(fù)方健耳劑具有顯著降低耳蝸MDA含量與下調(diào)Caspase-3表達的藥效作用，提示該中藥制劑可能作為一種抗氧化劑，通過促進機體抗氧化酶活性，清除ROS，從而阻止ROS觸發(fā)的系列介導(dǎo)細胞凋亡途徑，最終減輕耳蝸細胞的損害，保護聽功能的作用。

通過Trx-ROS徑路，減輕氧化應(yīng)激損傷，直接保護耳蝸和腎臟。硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx）與硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ，NADPH)一起共同組成Trx系統(tǒng)，即TrxR在NADPH催化下，促使氧化型Trx變?yōu)檫€原型Trx，還原型Trx為核糖核苷酸還原酶、蛋白蛋氨酸硫氧還酶、Trx依賴性過氧化物酶、酪氨酸磷酸酶提供氫電子，將H2O2還原成H2O，進而發(fā)揮重要的抗氧化作用[21,22]。因此，他是清除ROS，維持細胞氧化還原平衡，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的體內(nèi)重要氧化還原系統(tǒng)。此外，Trx還可通過Cys-32、35的巰基與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK-1）的N-末端的管理域結(jié)合，抑制ASK1活性，從而阻止ASK1依賴的細胞凋亡[23,24]。近期應(yīng)用RT-PCR進行的聰耳通竅劑來源方復(fù)方健耳劑干預(yù)豚鼠GM耳毒性研究顯示[25]，該中藥能夠促進耳蝸Trx-1、Trx-2高表達，同時抑制ASK-1表達。本次利用western blot對聰耳通竅劑干預(yù)豚鼠GM腎毒性研究中進一步表明，腎組織中，中藥+GM組Trx表達明顯高于GM對照組，而對ASK-1、Caspase-3表達則明顯低于GM對照組，與耳蝸研究結(jié)論一致，由此提示，聰耳通竅劑防治豚鼠GM耳、腎毒性損害另外一個關(guān)鍵作用機制可能是通過調(diào)控Trx系統(tǒng)，維持細胞內(nèi)氧化還原平衡和抗氧化功能，促進H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，清除細胞內(nèi)ROS，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻止MAPK徑路中ASK-1激發(fā)引起Caspase家族介導(dǎo)的細胞程序性死亡。

聰耳通竅劑以中醫(yī)脾腎立論，選擇具有補腎健脾為主的中草藥組成，對GM耳毒性聾具有防護作用，無疑從一個側(cè)面揭示了數(shù)千年傳統(tǒng)中醫(yī)“腎主耳”，“腎開竅于耳”，“腎不及則耳聾”；“清陽出上竅”，“脾主升清”，“脾不及則耳聾”等相關(guān)理論的一定科學(xué)依據(jù)。