華根霉的研究進(jìn)展及應(yīng)用

顏 麗，劉秀河*，李同樂(lè)

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

1 華根霉簡(jiǎn)介

華根霉（Rhizopus chinonsis）全名中華根霉，屬于接合菌亞門(mén)（Zygomyotina）、接合菌綱（Zygomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoaceae）、根霉屬（Rhizopus）[1]。近年來(lái)經(jīng)過(guò)不斷地研究，華根霉的應(yīng)用市場(chǎng)越來(lái)越廣泛。

華根霉的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是土豆瓊脂培養(yǎng)基，接種后24 h內(nèi)長(zhǎng)出白色菌絲，菌落疏松擴(kuò)散；48 h后菌絲變成褐色，假根不發(fā)達(dá)，短小，手指狀。華根霉主要靠孢子進(jìn)行無(wú)性繁殖，形成的孢子囊球形或近似球形，灰黑褐色至黑色，能產(chǎn)生球形、橢圓形或短柱形的厚垣孢子[2]。華根霉在15～45℃均可生長(zhǎng)，但是最適生長(zhǎng)溫度為30℃。華根霉能利用大多數(shù)的糖類，尤其是乳糖和麥芽糖，但糖的濃度太大反而會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，華根霉對(duì)有機(jī)氮源的利用大于無(wú)機(jī)氮源[3]。

2 華根霉的研究進(jìn)展

早在1999年，徐巖等[4]就改變了傳統(tǒng)的產(chǎn)脂肪酶的菌株篩選方法，以有機(jī)相中合成能力為指標(biāo)，得到了一株合成己酸乙酯較高的霉菌，命名為Rhizopus Y-92。2003年劉云秀等[2]通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)基的篩選，再進(jìn)行多次循環(huán)平板劃線分離和稀釋分離，從甜酒曲中分離出華根霉純種。隨著研究的深入，對(duì)于華根霉的認(rèn)識(shí)也在不斷加深，目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了華根霉的生理特性，華根霉在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生脂肪酶、淀粉酶、纖溶酶等。

2.1 華根霉產(chǎn)脂肪酶

脂肪酶能將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，而脂肪酸廣泛的應(yīng)用于食品、藥品、皮革、日用化工等方面[5-6]，因此在工業(yè)生產(chǎn)中脂肪酶的需求量非常大，目前脂肪酶的生產(chǎn)渠道之一就是微生物生產(chǎn)。徐巖等[4]在釀酒大曲中分離到一株高產(chǎn)脂肪酶的華根霉菌株，通過(guò)條件優(yōu)化進(jìn)一步提高了酶活并將脂肪酶用于酯類物質(zhì)的合成。顏興和[7]對(duì)華根霉進(jìn)行鈷60誘變和亞硝基胍誘變，獲得誘變菌2113，其后對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定了華根霉2113合成酶活的培養(yǎng)基的最佳營(yíng)養(yǎng)成分為麥芽糖1%，蛋白胨4%，豆餅粉4%，橄欖油2%，七水合硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.2%，起始pH 5.5，又在此基礎(chǔ)上對(duì)華根霉的接種量、裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速進(jìn)行了正交試驗(yàn)，得出（2.2～4.3）×105CFU/30 m L接種量、30 mL裝液量、150 r/min或200 r/min搖瓶轉(zhuǎn)速的培養(yǎng)條件較有利于華根霉2113脂肪酶的生產(chǎn)，且與出發(fā)菌相比，合成酶活提高了534.01%。WANG D等[8]通過(guò)改變發(fā)酵罐內(nèi)的攪拌和曝氣來(lái)控制發(fā)酵液的流型，從而改善混合和傳質(zhì)，提高了脂肪酶的產(chǎn)量。此外周藝博等[9]在華根霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件方面做了相關(guān)方向研究，確定在裝液量為20 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，初始pH 5.5，接種量5×107CFU/mL的條件下，30℃發(fā)酵72 h，脂肪酶合成活性最高，可達(dá)1 080 U/g。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)于華根霉的研究進(jìn)入了基因時(shí)代，王樂(lè)樂(lè)等[10]通過(guò)3次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）程序克隆首次得到了華根霉CCTCCM201021脂肪酶全基因序列，然后將其導(dǎo)入了畢赤酵母（Pichia pastoris）中，最終得出其產(chǎn)的脂肪酶的酶活比野生型華根霉脂肪酶（Rhizopus chinensis lipase，RCL）的酶活高約43倍。李飛等[11]研究了基因拷貝數(shù)和和甲醇濃度對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)脂肪酶的影響，結(jié)果表明基因拷貝數(shù)為5的重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶能力最高，酶活可達(dá)到12 500 U/mL。張謙等[12]又將華根霉脂肪酶基因?qū)朐诤谇怪羞M(jìn)行了重組表達(dá)，最終得出所有重組的菌株都能夠進(jìn)行表達(dá)，其中最高的脂肪酶的活力可達(dá)到71 U/mL，ZHANG M等[13]分別將脂肪酶轉(zhuǎn)入大腸埃希菌和畢赤酵母中表達(dá)得出畢赤酵母的華根霉r27RCL脂肪酶比在大腸桿菌中產(chǎn)生的華根霉r27RCL脂肪酶活性高1.4倍。隨著研究的深入，趙林水等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NH4+離子會(huì)對(duì)重組的畢赤酵母產(chǎn)生一定的影響，YANGM等[15-16]經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了畢赤酵母在表達(dá)的華根霉r27RCLC脂肪酶不會(huì)發(fā)生糖基化現(xiàn)象但是在畢赤酵母中表達(dá)的RCL在14、48、60三個(gè)位點(diǎn)會(huì)發(fā)生N-糖基化。此外，陳剛等[17-18]進(jìn)一步研究了華根霉產(chǎn)脂肪酶時(shí)最高酶活時(shí)的壓力與溫度：在200 MPa、40℃條件下酶熱穩(wěn)定性最佳，壓力超350 MPa時(shí)酶熱穩(wěn)定性顯著降低，繼而又研究了鹽和壓力對(duì)RCL的耦合效應(yīng)，得出在適當(dāng)?shù)臈l件下，壓力和鹽可以提高RCL的催化性能和穩(wěn)定性，高壓對(duì)RCL的影響受鹽的影響，同時(shí)鹽不能防止高壓引起的RCL損傷等結(jié)論。為了進(jìn)一步提高酶的活性，王睿等[19]篩選華根霉r27RCL脂肪酶分子表面的7對(duì)二硫鍵突變位點(diǎn)，利用PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，并在畢赤酵母中表達(dá)獲得突變酶，最終得出最佳突變酶在60℃的半衰期提高了4.5倍，Tm值提高了4.2℃，而催化活性保持不變，蔣蕊等[20]還將華根霉CCTCCM201021脂肪酶基因的分子改造，將其氨基酸序列進(jìn)行了定點(diǎn)突變，從而使其的親和性和催化效率更高，pH適應(yīng)范圍也更廣。吳厚軍[21]也利用定點(diǎn)突變的方法，通過(guò)同源建模和序列比較，對(duì)華根霉脂肪酶基因proRCL進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了突變脂肪酶D190V，使其最適溫度提高了5℃，65℃半衰期提高了一倍。華根霉產(chǎn)脂肪酶的機(jī)理機(jī)制作為研究的重點(diǎn)，CHEN G等[22-24]研究了壓力誘導(dǎo)下根霉脂肪酶蓋子運(yùn)動(dòng)及催化行為的研究，得出在200 MPa和40℃條件下，高壓處理脂肪酶的水解能力經(jīng)歷了一個(gè)先提高后降低的過(guò)程，在中等壓力下，壓力處理降低了反應(yīng)物與過(guò)渡態(tài)之間的體積，繼而又繼續(xù)研究了壓力對(duì)于酶的構(gòu)像的影響，得出當(dāng)壓力分別為200 MPa和600 MPa時(shí)，酶活性位點(diǎn)與底物的結(jié)合親和力分別為最高和最低的結(jié)論。

2.2 對(duì)于華根霉的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

隨著深入的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)也被用于微生物研究領(lǐng)域，其中雙向電泳技術(shù)由于靈敏度高，速度快被廣泛應(yīng)用[25]。目前，針對(duì)絲狀真菌的蛋白質(zhì)組學(xué)主要集中在曲霉上，而鄭禮月等[26-28]首先將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于華根霉，并創(chuàng)建和優(yōu)化了華根霉的胞內(nèi)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，又在此基礎(chǔ)上研究了華根霉液態(tài)發(fā)酵菌體形態(tài)差異與其產(chǎn)物有一定的聯(lián)系，為研究菌體形態(tài)與代謝產(chǎn)生的分子機(jī)制提供了技術(shù)支持。此后郭月[29]又通過(guò)雙向電泳技術(shù)初步探討了橄欖油對(duì)華根霉合成活性脂肪酶及菌體量的影響機(jī)制，得出橄欖油可以提高脂肪酶的表達(dá)量及酶活。蔡軍等[30]研究了華根霉固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)胞外蛋白酶的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，研究表明固態(tài)和液態(tài)不同培養(yǎng)方式影響了華根霉產(chǎn)胞外蛋白的組成，范凱[31]對(duì)根霉液態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)脂肪酶不同形態(tài)菌體的轉(zhuǎn)錄組的差異進(jìn)行了分析，得出菌體形態(tài)的差異顯著影響了華根霉的轉(zhuǎn)錄組，從而對(duì)其在液態(tài)發(fā)酵中的產(chǎn)物產(chǎn)生了影響。

2.3 華根霉產(chǎn)其他酶

除了脂肪酶，華根霉也產(chǎn)淀粉酶，纖溶酶和復(fù)合酶。劉芳等[32-33]從甜酒小曲中分離出華根霉淀粉酶菌株，并通過(guò)紫外誘變得到了菌株酶活力高的優(yōu)良變株SCLG-華根霉28，接著又通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終將其酶活提高了60.96%。汪彬彬等[34]通過(guò)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)和Box-Benhnken Design（BBD）試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定了華根霉產(chǎn)糖化酶的最佳發(fā)酵條件為橄欖油0.01%、酪蛋白胨8.14%、麥麩4.32%，該條件下酶活比優(yōu)化前提高81%。劉曉蘭等[35]從南方小藥酒中分離出的華根霉12#，對(duì)其經(jīng)過(guò)固體發(fā)酵得到了多種纖維活性成分，并經(jīng)過(guò)多種方式對(duì)活性組分進(jìn)行分離提純，得到電泳純的纖溶酶。YIN J等[36]利用中華根霉12#固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶，試驗(yàn)結(jié)果表明中華根霉12#固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的飼用復(fù)合酶可以用于降低飼料中的某些抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善飼料品質(zhì)。

3 華根霉的應(yīng)用

3.1 在釀酒方面

古語(yǔ)有云：“酒香不怕巷子深”，華根霉產(chǎn)的脂肪酶可以催化酸類物質(zhì)和酒精合成酯類，而酯類是酒中重要的增香物質(zhì)，對(duì)酒類風(fēng)味的形成至關(guān)重要。劉雪等[37]用生物酶法對(duì)華根霉合成己酸乙酯的方法進(jìn)行了研究，通過(guò)優(yōu)化確定了在工廠中合成己酸乙酯的最佳條件，得到的己酸乙酯可達(dá)2 302 mg/100 mL。利用脂肪酶具有酯類合成能力的特性，崔如生等[38]制取了一種新的調(diào)味酒，而這種調(diào)味酒制成的勾兌酒去除了酒精和香料味，窖香濃郁，醇香回甜。

3.2 在合成生物柴油方面

生物柴油是指由動(dòng)植物油脂與短鏈醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)所制備的脂肪酸單酯，生物柴油是一種替代石油柴油的可再生燃料。目前工業(yè)生產(chǎn)生物柴油的主要方法是酯交換法，而脂肪酶則可通過(guò)酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油[39-40]。賀芹等[41]首次將華根霉CCTCC M201021全細(xì)胞菌體作為催化劑轉(zhuǎn)化油脂合成生物柴油，得出華根霉全細(xì)胞脂肪酶在無(wú)溶劑體系中脂肪酸甲酯最高收率可達(dá)86.0%以上，在有機(jī)溶劑體系中轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)中脂肪酸甲酯的最高收率為86.7%。

3.3 在化妝品方面

脂肪酶不僅可以合成酯類物質(zhì)，還可以水解發(fā)酵底物中的油脂等。楊敏等[15]用初步篩選得到的含有脂肪酶的華根霉CCTCCM201021全細(xì)胞催化油酸與油醇酯化合成油酸油醇酯，并對(duì)其的轉(zhuǎn)換率進(jìn)行了探索，研究表明，華根霉全細(xì)胞脂肪酶對(duì)油酸油醇酯合成反應(yīng)具有很強(qiáng)的催化能力，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上。王楠等[42]也用華根霉脂肪酶催化生成乙酸香茅酯并得出合成乙酸香茅酯的最佳條件，最終轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%。

3.4 在醫(yī)學(xué)方面

血栓栓塞性疾病嚴(yán)重威脅人類生命和健康，溶栓治療是血栓性疾病安全有效的治療手段，而纖溶酶中血纖維蛋白是溶解血栓的主要成分。遲文鶴[43]利用華根霉TK317固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶，隨后對(duì)編碼華根霉纖溶酶的基因進(jìn)行克隆，得到編碼該纖溶酶的新基因，并將該基因成功的在大腸桿菌pET系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。王盛楠[44]構(gòu)建了華根霉全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并從中篩選出一種能編碼合成具有水解血纖維蛋白活性基因，通過(guò)其在畢赤酵母中的表達(dá)，對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)質(zhì)量較高，可長(zhǎng)期保存并用于新基因的篩選，且本實(shí)驗(yàn)所得的纖溶酶基因是一種新型纖溶酶基因。

4 華根霉研究存在問(wèn)題及建議

4.1 在生產(chǎn)方面

華根霉的生產(chǎn)主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方法。固態(tài)發(fā)酵法具有工藝簡(jiǎn)單、發(fā)酵條件較為粗放、設(shè)備投資及廢物產(chǎn)生較少等特點(diǎn)，但是也存在一些問(wèn)題，如占地面積大、產(chǎn)量低、操作技術(shù)繁瑣、難度大，質(zhì)量不穩(wěn)定等[45]。與固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)相比，液態(tài)發(fā)酵法具有營(yíng)養(yǎng)源選擇范圍廣、培養(yǎng)條件易于調(diào)控、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)過(guò)程雜菌污染率低等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)液體發(fā)酵存在產(chǎn)物雜質(zhì)較多、發(fā)酵后產(chǎn)物提取成本高的問(wèn)題。針對(duì)上述存在問(wèn)題，結(jié)合華根霉自身特性和產(chǎn)酶條件來(lái)看，華根霉固態(tài)發(fā)酵的實(shí)用性更大，但是對(duì)于華根霉進(jìn)一步的學(xué)術(shù)研究，華根霉液態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用價(jià)值更大。

4.2 在釀酒方面

目前來(lái)說(shuō)雖然華根霉在釀酒方面有著重要的作用，但是如果只用華根霉做純種曲釀造出的酒口味較單一，因此必須要添加其他風(fēng)味物質(zhì)才能克服自身的不足，所以對(duì)于華根霉在釀酒中單獨(dú)作用的研究還很少。因此，可以著重于將華根霉與其他菌體混合發(fā)酵，取長(zhǎng)補(bǔ)短，將各自的優(yōu)勢(shì)發(fā)揮出來(lái)，這樣既可以提高產(chǎn)品的生產(chǎn)質(zhì)量，又可以節(jié)約成本，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

4.3 在現(xiàn)代分子技術(shù)方面

雖然將華根霉脂肪酶基因進(jìn)行突變，然后轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，得到的結(jié)果是令人滿意的，但是也存在了一些問(wèn)題，如很多研究都針對(duì)于提高酶活，但對(duì)于應(yīng)用方面研究的不是很多，因此可以在分子技術(shù)水平上將華根霉研究成果應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如可以通過(guò)分子改造等技術(shù)，通過(guò)控制華根霉的菌體形態(tài)或者優(yōu)化條件來(lái)大幅提高脂肪酶的酶活和產(chǎn)量，這樣就可以使現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)達(dá)到一個(gè)新的高度。

4.4 在蛋白質(zhì)組學(xué)方面

目前的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要研究了華根霉固液態(tài)培養(yǎng)方式和華根霉的不同形態(tài)與其產(chǎn)物有聯(lián)系，但是由于其本身的局限性，只能提供一個(gè)宏觀的研究方向，對(duì)于其微觀聯(lián)系以及其內(nèi)在的機(jī)理機(jī)制的研究并不清楚，因此可以在此基礎(chǔ)上結(jié)合一些其他的技術(shù)方法和手段，如基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等，對(duì)此進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

4.5 展望

隨著人們對(duì)華根霉研究工作的深入，華根霉必將在食品、醫(yī)學(xué)、能源等各個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。文章總結(jié)了近年來(lái)對(duì)于華根霉的研究成果，但目前由于菌種酶活低、生產(chǎn)成本高、技術(shù)落后等原因華根霉在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用還比較少，因此我們將來(lái)要做的就是采取各種行之有效的高新技術(shù)，發(fā)展能夠滿足市場(chǎng)需求的新產(chǎn)品。