干細(xì)胞治療宮腔粘連的研究進(jìn)展

郭 靈， 邵曉雯 綜述， 成佳景， 審校

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)上海十院臨床醫(yī)學(xué)院，南京 211166； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

宮腔粘連(intrauterine adhesion, IUA)，又稱(chēng)Asherman綜合征(asherman syndrome, AS)，1894年由Heinrich Fritsch首次報(bào)道，并于1950年由Joseph Asherman進(jìn)一步命名[1]，其在女性繼發(fā)不孕中的發(fā)病率高達(dá)22%。宮腔粘連的發(fā)生機(jī)制目前還不是很清楚，但有研究認(rèn)為創(chuàng)傷、感染和低雌激素狀態(tài)是引起子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)障礙、導(dǎo)致宮腔粘連發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，92%的子宮內(nèi)膜損傷繼發(fā)于流產(chǎn)和產(chǎn)后進(jìn)行的宮腔操作[1-3]。我國(guó)每年有600～1 300萬(wàn)人次行人工流產(chǎn)術(shù)，其中40%會(huì)繼發(fā)不同程度的內(nèi)膜損傷。

子宮內(nèi)膜層主要由上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成。組織學(xué)分為功能層和基底層。女性排卵周期中，子宮內(nèi)膜功能層在激素作用下發(fā)生增生、分泌、脫落，而基底層可生成新的功能層，修復(fù)功能層脫落的創(chuàng)面。在排卵期，子宮內(nèi)膜厚度至少達(dá)到7～8mm是保證胚胎正常植入的前提，低于6mm，則妊娠的可能性極低。流產(chǎn)、產(chǎn)后出血和刮宮術(shù)等宮腔操作常引起基底層的機(jī)械性損傷，若合并生殖道細(xì)菌逆行感染，常導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞再生障礙，新生血管受損，子宮內(nèi)膜活性喪失，肌層缺乏內(nèi)膜覆蓋，發(fā)生內(nèi)膜纖維化和宮腔前后壁粘連，或是子宮內(nèi)膜呈頑固性不再增生。宮腔鏡下可見(jiàn)內(nèi)膜厚度不均、局部變薄和粘連。組織病理學(xué)表現(xiàn)為宮腔內(nèi)附著稠厚的纖維組織，纖維組織附著部位殘留少量甚至完全缺乏正常的內(nèi)膜組織，纖維附著部位的子宮內(nèi)膜菲薄、腺體萎縮，缺乏有血管的間質(zhì)，粘連局部處于低氧缺血的微環(huán)境。臨床表現(xiàn)主要為月經(jīng)紊亂、經(jīng)量減少甚至閉經(jīng)、導(dǎo)致胚胎難以著床造成不孕[1-4]。

目前對(duì)于宮腔粘連并無(wú)治療指南。傳統(tǒng)的治療方案以手術(shù)和雌激素聯(lián)合治療為主。先行宮腔鏡檢查明確宮腔粘連及內(nèi)膜的損傷程度，宮腔鏡下行粘連松解術(shù)同時(shí)放置機(jī)械屏障如宮內(nèi)節(jié)育器或球囊，術(shù)后予以口服雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生。但目前文獻(xiàn)顯示這些方法效果均不佳，宮腔粘連患者的治愈率和妊娠率無(wú)明顯改善，而且粘連復(fù)發(fā)率較高(輕度患者復(fù)發(fā)率超過(guò)30%，重度患者復(fù)發(fā)率超過(guò)60%)，很多患者經(jīng)過(guò)多次治療后仍以失敗告終。此外，大劑量雌激素的應(yīng)用使得乳腺癌、卵巢癌等雌激素相關(guān)性腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高[5-6]。隨著女性性生活年齡提前，婚前人工流產(chǎn)增加，宮腔粘連的發(fā)病率和檢出率逐年上升，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。宮腔操作繼發(fā)宮腔粘連導(dǎo)致的不孕給婚姻和家庭帶來(lái)巨大的負(fù)面影響，成為潛在的重大醫(yī)療和社會(huì)問(wèn)題。探索新的有效防治子宮內(nèi)膜損傷、治療宮腔粘連的方法、恢復(fù)因?qū)m腔粘連造成的不孕成為重大而緊迫的社會(huì)需求。

近年來(lái)，有學(xué)者提出導(dǎo)致宮腔粘連的子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙與局部干細(xì)胞損傷和缺失有關(guān)，認(rèn)為子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)源自?xún)?nèi)膜中的干細(xì)胞。子宮內(nèi)膜創(chuàng)傷和感染時(shí)內(nèi)膜基底層損傷可能使位于此處的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞數(shù)量減少甚至缺失、功能受損，子宮內(nèi)膜腺上皮不能完全再生，導(dǎo)致內(nèi)膜疤痕性修復(fù)，最終引起內(nèi)膜損傷[7-8]。這一理念的提出突破了傳統(tǒng)的治療手段，為子宮內(nèi)膜損傷的治療提供了新思路。

1 治療子宮內(nèi)膜損傷干細(xì)胞的種類(lèi)及研發(fā)現(xiàn)狀

干細(xì)胞被定義為可自我復(fù)制以及可分化成多種不同種類(lèi)的細(xì)胞，并能夠進(jìn)一步產(chǎn)生至少一種高度分化后代的未分化細(xì)胞群體。人體內(nèi)的多數(shù)器官和組織都含有干細(xì)胞群，在組織受到破壞或老化時(shí)提供替代細(xì)胞從而維持組織的內(nèi)穩(wěn)定。

干細(xì)胞具有自我復(fù)制和分化潛能，在一定的生理和病理誘導(dǎo)下，能夠活化增殖，向同一或不同組織起源的細(xì)胞類(lèi)型分化，維持機(jī)體和組織器官的功能、穩(wěn)態(tài)和再生修復(fù)，在再生治療中具有巨大的潛力，成為重大疾病防治的研究熱點(diǎn)[9-10]。

2 子宮內(nèi)膜干細(xì)胞

目前，許多實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)都已證明子宮內(nèi)膜中存在內(nèi)膜干細(xì)胞，可能在每次月經(jīng)周期中激活參與子宮內(nèi)膜的重建。關(guān)于子宮內(nèi)膜上皮干細(xì)胞的身份仍有待探究，目前主要認(rèn)為它們存在于子宮腺基的基底層血管周?chē)鶾11]，包括以下類(lèi)型。

子宮內(nèi)膜類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞(endometrial mese-nchymal stem-like cells, eMSCs)是集落形成基質(zhì)細(xì)胞中的一個(gè)小細(xì)胞群，存在于基底層和功能層的血管周?chē)?，共同表達(dá)CD146+和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β+(PDGF-βR+)。該實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)也首次證實(shí)eMSCs可在體內(nèi)再生形成子宮內(nèi)膜基質(zhì)[11-12]。

側(cè)群細(xì)胞(side population cells, SP cells)因其表達(dá)多種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記而被認(rèn)為是一種內(nèi)皮干細(xì)胞。SP細(xì)胞集中于表達(dá)CD9-CD13-的子宮內(nèi)膜部分。這些從子宮內(nèi)膜中分離出來(lái)的SP細(xì)胞可產(chǎn)生類(lèi)腺體(CD9+)或類(lèi)基質(zhì)(CD13+)細(xì)胞[11-13]。Masuda等[14]證明了SP細(xì)胞在特殊介質(zhì)中可以增殖分化為多種類(lèi)型的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，包括腺細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。他們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將SP細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠的腎包膜下，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞可以生成含腺狀結(jié)構(gòu)、基質(zhì)、血管和肌層的內(nèi)膜組織，并隨激素的變化而產(chǎn)生增生、分化、脫落的周期性改變。Cervelló等[15-16]亦證實(shí)了相同的結(jié)果，SP細(xì)胞可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生類(lèi)內(nèi)膜樣組織，同時(shí)該組織中的內(nèi)膜腺體可表達(dá)孕激素并能夠進(jìn)一步分化形成蛻膜。

子宮內(nèi)膜干細(xì)胞是具有自我更新、多向分化和高增殖潛能的成體干細(xì)胞，并且可以通過(guò)搔刮子宮內(nèi)膜或月經(jīng)血涂片等手段獲得，操作簡(jiǎn)單、取材便利，或許能成為多能干細(xì)胞的一種新的潛在資源。2016年，Zhang等[17]將來(lái)源于月經(jīng)血的eMSCs移植入子宮內(nèi)膜受損的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜厚度及微血管密度增加，子宮內(nèi)膜的損傷修復(fù)速度明顯增加。此外，與內(nèi)膜損傷的小鼠相比，治療組的生育能力提高，具有較高的受孕率和較大的胚胎數(shù)。2018年，Domnina等[18]在宮腔粘連大鼠模型中植入月經(jīng)血來(lái)源的eMSCs，大鼠的生育力顯著提高，與接受骨髓干細(xì)胞移植的大鼠相比，其每胎分娩數(shù)量更多。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived stem cells, BMDSCs)因其可從骨髓中分離，較易在體外進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴(kuò)增，是目前干細(xì)胞移植治療領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的一類(lèi)種子細(xì)胞，具有分化為多種類(lèi)型細(xì)胞的能力，可能對(duì)受損的組織有一定再生或修復(fù)作用，但相關(guān)具體機(jī)制仍需探究。

研究者發(fā)現(xiàn)接受過(guò)男性捐贈(zèng)者骨髓進(jìn)行移植的女性患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中有Y染色體的存在，由此推測(cè)BMDSCs也許能形成子宮內(nèi)膜細(xì)胞，后續(xù)研究也進(jìn)一步證實(shí)了移植于子宮內(nèi)膜的BMDSCs具有分化成為上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的能力。有研究[19-21]在接受了雄性小鼠血液干細(xì)胞移植的雌性小鼠樣本中發(fā)現(xiàn)所有受試雌性小鼠都含有捐贈(zèng)者來(lái)源的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，證明供體BMDSCs都可在受體體內(nèi)分化成子宮內(nèi)膜。Dimitrov等[22]也發(fā)現(xiàn)在人子宮內(nèi)膜中含有少量具有子宮內(nèi)膜基質(zhì)干/原始細(xì)胞特征的細(xì)胞，該類(lèi)細(xì)胞似乎屬于MDSCs家族。然而，Cervelló等[23]開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)顯示，BMDSCs可能只是一種激活子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化從而使子宮修復(fù)再生的限制性外生因子，而非循環(huán)的干細(xì)胞來(lái)源。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)行BMDSCs治療的大鼠模型中雌、孕激素受體均有顯著的提高，提示BMDSCs移植可能是通過(guò)提高雌、孕激素受體的表達(dá)從而對(duì)受損的子宮內(nèi)膜進(jìn)行功能學(xué)修復(fù)[24]。此外，BMDSCs具有促進(jìn)血管系統(tǒng)生成的作用[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)BMDSCs移植的大鼠模型與對(duì)照組相比，其子宮內(nèi)膜組織可表達(dá)更高水平的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors, FGF)、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，這些因子都會(huì)提高子宮內(nèi)膜細(xì)胞和子宮肌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)微血管重建，使子宮內(nèi)膜恢復(fù)接受胚胎并支持其發(fā)育[26]。BMDSCs移植促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖，提高妊娠率的能力亦已在大鼠模型中得到驗(yàn)證[27-29]。一系列研究均證明BMDSCs可使傳統(tǒng)宮腔粘連治療無(wú)效的受損子宮內(nèi)膜再生。

2011年，Nagori等[30]為1位重度宮腔粘連患者進(jìn)行自體干細(xì)胞移植治療并使患者成功妊娠。他們從患者的骨髓中分離出子宮內(nèi)膜血管源干細(xì)胞，在對(duì)患者行刮宮術(shù)后于超聲引導(dǎo)下將這些細(xì)胞置于子宮內(nèi)膜腔，當(dāng)子宮內(nèi)膜達(dá)到合適的厚度后，該患者接受了體外受精并最終受孕。2015年，研究[31]進(jìn)行了自體細(xì)胞療法治療難治性宮腔粘連和子宮內(nèi)膜萎縮癥的先導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，受試患者接受了自體CD133+BMDSCs移植聯(lián)合激素替代療法，其中11名宮腔粘連患者均有月經(jīng)情況改善，宮腔粘連程度降低同時(shí)子宮內(nèi)膜厚度增加及血管生成，部分患者通過(guò)自然或人工方式相繼受孕[31]。

子宮局部缺血/再灌注損傷可促進(jìn)BMDSC向子宮內(nèi)膜募集。BMDSCs可表達(dá)一種趨化因子受體CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)，CXCR4與其配體，即基質(zhì)來(lái)源因子(C-X-C motif chemokine 12, CXCL12)在調(diào)節(jié)干細(xì)胞返回中發(fā)揮了重要作用。大鼠模型試驗(yàn)[32]證明，CSCL12在宮腔粘連的子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中促進(jìn)了BMDSCs遷移至子宮內(nèi)膜，同時(shí)可使宮腔粘連的大鼠更短時(shí)間受孕并且產(chǎn)胎更多。這些結(jié)果提示在BMDSCs移植前進(jìn)行宮腔鏡下粘連松解術(shù)，并在移植之后使用CXCL12或其他CXCR4受體激動(dòng)劑可能提高宮腔粘連的治療效果。

4 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesen derived stem cells, AMDSCs)在細(xì)胞表型、分化能力等方面與BMDSCs相似，但其來(lái)源更豐富，取材創(chuàng)傷小，體外增殖速率快，易于大規(guī)模量產(chǎn)。

Kilic等[33]從雄鼠的脂肪組織中分離出干細(xì)胞并移植入宮腔粘連的雌鼠模型中，觀察到移植后雌性大鼠的子宮內(nèi)膜纖維化水平降低，且血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原Ki-67等多種細(xì)胞增殖標(biāo)記物表達(dá)升高。同時(shí)，該試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)AMDSCs聯(lián)合使用雌激素效果更佳，可有效促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖。

AMDSCs作為一種更易獲得的資源有望成為子宮內(nèi)膜重建領(lǐng)域良好的細(xì)胞來(lái)源。但有研究發(fā)現(xiàn)，移植體內(nèi)的AMDSCs存活時(shí)間較短，且對(duì)損傷發(fā)生部位的靶向性較差。祁旻龍等[34]考慮到人AMDSCs中缺乏炎癥趨化因子受體2(chemokine receptor 2, CCR2)，而已有證據(jù)表明CCR2可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和聚集、加快組織修復(fù)過(guò)程，因此通過(guò)慢病毒感染設(shè)計(jì)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CCR2的AMDSCs，并移植到創(chuàng)傷模型小鼠的創(chuàng)面4周，發(fā)現(xiàn)損傷部位的修復(fù)顯著加快。該試驗(yàn)提示誘導(dǎo)CCR2過(guò)表達(dá)或可增強(qiáng)AMDSCs的靶向性。

5 人胚胎干細(xì)胞

人胚胎干細(xì)胞(humanEmbryonic stem cells, hESCs)來(lái)源于胚胎的內(nèi)胚層，可在體外分化為3個(gè)胚層。多項(xiàng)研究顯示hESCs在特定的培養(yǎng)介質(zhì)中可以分化為各種細(xì)胞類(lèi)型。

2015年，有研究[35]將hESCs與小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化為子宮內(nèi)膜樣上皮，其表面可表達(dá)雌、孕激素受體、細(xì)胞角蛋白、上皮細(xì)胞連接分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)、β-微管蛋白等，證實(shí)了hESCs可以向子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞分化[35]。同年，有研究[36]將hESCs與子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜樣細(xì)胞，并將hESCs來(lái)源的細(xì)胞聯(lián)合膠原支架移植入子宮被全層破壞的大鼠模型，12周后，該細(xì)胞存活下來(lái)，且其中一個(gè)子宮重度損傷大鼠模型子宮角的結(jié)構(gòu)和功能得到恢復(fù)。

然而，使用胚胎以分離干細(xì)胞在倫理學(xué)上仍有爭(zhēng)議。此外，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)體外誘導(dǎo)的hESCs可能會(huì)成為腫瘤細(xì)胞的來(lái)源。

6 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

考慮到使用hESCs的限制性，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了一項(xiàng)新的工具。經(jīng)過(guò)重新編程的iPSCs通常與hESCs有同樣的自我復(fù)制和分化為3胚層的能力。iPSCs的優(yōu)點(diǎn)包括可對(duì)患者體細(xì)胞中特定的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行異位表達(dá)而獲得，從而避免了排異的可能性[37]。

研究[38]證明了iPSCs可從小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞和成人成纖維細(xì)胞通過(guò)對(duì)4種轉(zhuǎn)錄因子，即Oct-3/4(octamer-binding transcription factor 3/4)，Sox2(SRY(sex determining region Y)-box 2)，c-Myc和Klf4(Kruppel-like factor 4)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染而獲得。有實(shí)驗(yàn)[39]發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的iPSCs有分化為中胚層和外胚層組織的能力。Park等[40]發(fā)現(xiàn)iPSCs也可從進(jìn)行了Oct-4、Sox2、Klf4、Myc轉(zhuǎn)換的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)并重新編程得到。這些結(jié)果都證明了子宮內(nèi)膜可以作為干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的來(lái)源以誘導(dǎo)iPSCs，該類(lèi)型的iPSCs或可在將來(lái)成為干細(xì)胞治療宮腔粘連的最佳選擇。

7 展 望

干細(xì)胞現(xiàn)已成為一種恢復(fù)性細(xì)胞治療的潛在資源而被廣泛探索應(yīng)用。對(duì)于接受傳統(tǒng)激素聯(lián)合手術(shù)及后續(xù)治療的宮腔粘連患者，其子宮內(nèi)膜的恢復(fù)情況并不十分理想，因此科學(xué)家們轉(zhuǎn)而探索干細(xì)胞修復(fù)子宮內(nèi)膜以作為宮腔粘連的一種新的治療方式，但該項(xiàng)技術(shù)尚有許多問(wèn)題亟待解決，如: 種細(xì)胞的選擇，需要選取一種獲取簡(jiǎn)便、性質(zhì)穩(wěn)定并且可以大量復(fù)制擴(kuò)增的干細(xì)胞；以及干細(xì)胞的最佳定向誘導(dǎo)分化條件和效率；干細(xì)胞的移植時(shí)間、途徑、劑量、復(fù)合作用機(jī)制問(wèn)題；此外，需要尋找某種對(duì)患者傷害較小的方法嚴(yán)格監(jiān)測(cè)移植至人體內(nèi)的干細(xì)胞的安全性和質(zhì)量，以上這些問(wèn)題都有待于進(jìn)一步研究，也是現(xiàn)在干細(xì)胞應(yīng)用的主要探索方向。雖然迄今為止，對(duì)于利用干細(xì)胞修復(fù)子宮內(nèi)膜的研究大多仍局限于動(dòng)物模型或小樣本量的臨床試驗(yàn)，尚無(wú)大規(guī)模臨床試驗(yàn)，但隨著研究的進(jìn)一步深入，相信干細(xì)胞移植治療在未來(lái)一定能為眾多宮腔粘連等子宮內(nèi)膜再生障礙性疾病患者帶來(lái)新的希望。