食品工業(yè)中噬菌體滅活方法研究進展

柴詩語，郭靜，馬瑞瑞，孟根其其格，陳霞

（內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業(yè)部奶制品加工重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引 言

1915年，FrederickW.Twort發(fā)現噬菌體病毒具有吞噬細菌的能力。其作用機理是將自身遺傳物質注入宿主細胞內，通過控制細胞代謝破壞細菌，達到致死細菌的目的[1]。自然界中噬菌體分布很廣，在土壤、地表水、食物、動物和植物等環(huán)境均可找到[2]。噬菌體的存在是發(fā)酵食品工業(yè)面臨最大的威脅之一，如何控制噬菌體侵染是食品發(fā)酵工業(yè)一直試圖解決的難題。

發(fā)酵作為食品保藏的主要方法之一，在賦予食品特殊風味物質的同時豐富營養(yǎng)物質。發(fā)酵過程若發(fā)生噬菌體污染，會降低發(fā)酵劑活力，致產品發(fā)酵時間延遲、酸度降低和發(fā)酵活力下降等，甚至造成發(fā)酵失敗。特別是在乳制品等產品生產中，噬菌體污染是導致發(fā)酵異常的主要原因[3-4]。以酸奶為例，噬菌體污染后可觀察到糖消耗逐步減慢，pH值變化異常，產氣量減少，發(fā)酵稀薄，使乳酸菌數降低。噬菌體有多種侵入渠道，如原料乳、細菌培養(yǎng)物、空氣和設備等。噬菌體的生存、生長繁殖離不開寄主菌體，并有高度特異性[3]。發(fā)酵過程中可通過測定宿主特異性、溶菌斑形成能力和電鏡觀察等方式檢測是否發(fā)生噬菌體污染[5]。常見滅活噬菌體方法有：高溫、加壓、紫外線和消毒劑等。近年來關于滅活噬菌體的研究報道較多，為此本文將具有應用潛力的滅活方法及研究進展進行梳理討論。

1 物理滅活方法

1.1 熱處理

熱處理是最常用的傳統(tǒng)滅菌方法，具有簡單、快捷、易控制等特點。食品熱處理優(yōu)勢在于可改善食品品質與特性，如產生特別色澤、風味和組織狀態(tài)等。此外，熱處理可提高食品營養(yǎng)成分的可利用率及可消化率等。其作用機理是利用加熱使噬菌體的蛋白質、核酸等發(fā)生不可逆變性，致使病毒失活[6]。例如乳桿菌噬菌體PL-1和J-1均可在63℃，30min、72℃，15s、82℃，5min或90℃，15min條件下被有效滅活[7]。嗜熱鏈球菌噬菌體021-4，0BJ和CYM在90℃條件下處理5min后即檢測不到噬菌體顆粒。021-5和031-D在72℃經5min和30min可分別降低6到7個對數級[8]。但是，許多噬菌體具有耐高溫特性，需要對各噬菌體的熱滅活效果進行大量深入研究。發(fā)酵乳制品中最常出現的3類噬菌體為：936型、c2型、p335型，其中多數c2型、p335型噬菌體都難以抵御高溫，而大多936型噬菌體具有耐高溫特性。如噬菌體phi19在85℃作用30 min，僅下降2個對數級。噬菌體ViridisJM 2在85℃作用5 min則可降低4個對數級，但是剩余的25 min沒有進一步減少，這可能由于環(huán)境導致936型噬菌體產生越來越強的耐熱性[4]。在加熱過程中，其他因素也會影響滅活效果。例如在發(fā)酵乳制品加工過程中，由于牛奶在打入和加熱過程中會產生大量的泡沫，泡沫中空氣和泡沫薄膜有隔熱作用，熱量不易穿透殺死其中的噬菌體，在冷卻過程中一旦泡沫破裂，潛伏的噬菌體就被釋出造成污染。所以在加熱過程中必須手動除去浮沫或添加消泡劑并延長加熱時間，以消除噬菌體，這也大大增加了人力物力[4,6]。

1.2 超高壓

高壓滅菌方法條件簡單：置于密閉高壓容器中，利用高壓及蒸汽達到消毒作用。是常用的有效致死微生物，包括芽孢的方法。近幾年新興的超高壓（High Hydrostatic Pressure，HHP）技術，正以作用均一、低能耗、高效、安全等優(yōu)點被廣泛應用到食品工業(yè)中[9]。超高壓可通過大于100 MPa壓力在常溫或較低溫度下使微生物中的酶、蛋白質、核糖核酸和淀粉等生物大分子變性或糊化，在殺死微生物同時最大限度地維持食品的原有風味和營養(yǎng)價值[9-11]。其只作用于非共價鍵，因此對維生素、色素和風味物質等低分子化合物的共價鍵無明顯影響，使食品較好地保持了其原有營養(yǎng)價值、色澤和天然風味[10]。不同種類的噬菌體在不同壓力下可被有效滅活。在20℃時，大腸桿菌噬菌體Qβ和c2加壓至500～700 MPa，處理30 min后，可下降6到7個對數級，當壓力達到800 MPa時，可使其降至不可檢測水平[11]。嗜熱鏈球菌噬菌體在600 MPa的滅活效果最為明顯，其在10～20 min可將噬菌體ALQ 13.2、DT 1、Abc2完全失活[9]。加壓同時改變理化條件可增強其滅活效果，如在牛奶中噬菌體λcI 857在壓力300 MPa，350 M Pa，400 MPa下，分別處理400 min，80 min，20 min，可將噬菌體的滴度降低5.4，6.4和7.1個對數值。而在緩沖液中300、350、400 MPa分別處理300、36、8 min即可使噬菌體顆粒降低7.5，7.6和7.7個對數級[10]。

1.3 紫外線

紫外線是波長在（10～400）nm之間的電磁輻射，針對大多數種類噬菌體有效。其機理是：紫外線可被噬菌體蛋白質和核酸吸收并作用于DNA，其中1條DNA鏈上的相鄰胸腺嘧啶鍵結合形成二聚體，DNA喪失轉化能力而致死噬菌體[12-14]。紫外線對噬菌體破壞率需視噬菌體的濃度、紫外線燈照射量和照射物距離等因素決定[12]。具有能耗少、應用便捷和保留食物原有風味等優(yōu)點，在果汁、蔬菜包等食品加工應用較廣[5,12]。研究表明：MS2噬菌體在不同時間和強度的短波紫外線照射下均可達到消毒水平效果，在370μW/cm2照射10 min、680μW/cm2照射5 min和1130μW/cm2照射3 min的條件下，分別下降4.49、4.52和4.16個對數級。T4噬菌體則在370μW/cm2照射20 min、680μW/cm2照射15 min和1130μW/cm2照射5 min的處理下分別下降4.60、4.02和5.46個對數級[12]。同樣，經紫外線處理，噬菌體IME195隨時間增長存活率急劇下降，在作用45 min后噬菌體存活率僅為6%，120 min后噬菌體全部失活[13]。由于紫外線穿透能力較弱，因此該法常用于殺滅存在于表面或空氣中的噬菌體。

1.4 高壓脈沖電場

高壓脈沖電場（Pulsed Electric Field，PEF）是近年果汁、液態(tài)奶等液體消毒的研究熱點，幾微秒到幾毫秒的處理時間，可延長貨架期4～6周。其機理是利用兩個電極間產生的瞬時高壓，在物料上加以脈沖電場形式，不可恢復性破壞噬菌體[15]。殺菌高壓脈沖電場一般強度為15～100 k V/cm，脈沖頻率為1～100k H，放電頻率為1～20Hz，常溫環(huán)境下處理（10～20）ms即可。此方法優(yōu)勢有：殺菌環(huán)境要求低（常溫常壓）、殺菌時間短、食品感官影響小和殺菌效果明顯，特別適用于熱敏性高的食品，是一種值得發(fā)展的殺菌技術[15-16]。應南嬌應用高壓脈沖電場治理工業(yè)污染時對大腸桿菌噬菌體做了不同條件的研究。研究表明：在室溫下輸出電壓1～10k V，寬度1～10μs，脈沖數50～300的范圍內，滅活效率隨著電場強度的增加而提高，電場強度在2k V時，多面體λ噬菌體和線性ΦX 174噬菌體的生存率下降3個對數級，而電場強度提高到10k V時，生存率下降7個對數級。且PEF對噬菌體的滅活效率并不依賴于噬菌體的顆粒結構，但噬菌體顆粒結構對脈沖寬度滅活效率有影響。λ噬菌體與ΦX 174噬菌體在脈沖寬度1～10μs的范圍內，兩株噬菌體的滅活效率都至少下降4個對數級。而在脈沖寬度為3μs時λ噬菌體滅活效率較高，ΦX 174噬菌體則在脈沖寬度5μs時滅活效率較高。其他參數相同的情況下，多面體λ噬菌體和線性ΦX 174噬菌體，對脈沖寬度г的敏感性差異顯著，說明噬菌體顆粒的結構差異對滅活效率有一定影響[16]。

2 化學滅活方法

2.1 酸堿類消毒劑

酸堿類消毒劑價格便宜，易溶于水，其作用取決于氫離子或氫氧根離子濃度及溶液溫度。通過溶解蛋白質，破壞噬菌體結構，起到消毒作用[17]。例如谷氨酸發(fā)酵過程中，可加入0.3%～0.5%的草酸鹽或檸檬酸銨抑制噬菌體吸附和增殖[18]。在食品工業(yè)中，對化學藥劑用量有嚴格的國標要求，加入的化學藥劑量須低于國家要求的可檢測量，所以同源于食品加工廠的有機酸被優(yōu)先考慮。將噬菌體與0.5%乳酸（來源標準乳制品廠，p H=2.16）混合，作用20 min，可使噬菌體sk1、bIL170、jj50、CaseusJM 1、ViridisJM 2、PastusJM 3快速失活。Phi93和phi191在作用5 min后減少約3.5個對數級，10 min后噬菌體phi43和phiLj分別減少3、2.5個對數級。這4種噬菌體在15 min后完全滅活。噬菌體PhiLcj具有較高耐藥性，15 min后檢測僅降低4個對數級，但20 min后則無法檢測到噬菌體顆粒[8]。利用堿類消毒劑滅活噬菌體的報道相對較少，Murphy等將11種噬菌體與p H=12.64的氫氧化鈉（0.2%）混合，取混合樣品于各個時間點（0.5、5、10、15、20、30 min）檢測。經檢測氫氧化鈉（0.2%）是高效的噬菌體滅活劑，5 min后即可使噬菌體 phi43、phi93、CaseusJM 1、ViridisJM 2、PastusJM 3、phi19、phiLj、phiLcj完全失活，而jj50、bIL170、sk1則被立即滅活[4]。但含有酸堿成分的消毒劑存在一定的劣勢，加入后會改變培養(yǎng)基pH值，甚至發(fā)生沉淀反應，須根據滅菌溶液情況而定。

2.2 醇類消毒劑

醇類消毒劑為中效消毒劑，對細菌繁殖體、分枝桿菌、真菌及病毒均有滅活作用，但不能致死細菌芽孢。最常用的醇類消毒劑是乙醇和異丙醇，一般使用濃度為70%～75%。醇類物質可使噬菌體脫水，隨即迅速滲入到噬菌體體內，使蛋白質變性、凝固、破壞外殼的結構和功能，使內容物漏出，最終導致噬菌體死亡，但不可作用于噬菌體的DNA[8]。75%乙醇溶液對于噬菌體顆粒失活非常有效：75%乙醇處理噬菌體021-4，15 min或處理噬菌體031-D和CYM 30 min，可有效減少6-7個對數級的噬菌體顆粒。且50%異丙醇溶液與75%乙醇溶液對噬菌體031-D滅活效果作用30 min相似，而與噬菌體0BJ混合45 min后則可使其至少降低4個對數級[7]。醇類消毒劑作用效果迅速，操作簡單，價格便宜是工廠中最常用的表面消毒劑之一。

2.3 醛類消毒劑

醛類消毒劑包括甲醛和戊二醛等。其特點是殺菌能力強，屬于廣譜抗菌劑。滅菌濃度一般為2%；pH在7.5-8.5時，戊二醛的殺菌作用最強，化學性質穩(wěn)定，便于貯存和運輸[19-20]。戊二醛可作用于蛋白質中的氨基、羧基、羥基和巰基，使噬菌體外殼蛋白遭到破壞，通過損傷核酸，使噬菌體不能正常復制。戊二醛滅活T4噬菌體效果顯著，3 000 mg/L，20 min或6 000 mg/L，5 min，可使噬菌體降低4到5個對數級；2 500 mg/L的戊二醛作用于噬菌體hi174D 20 min或5 000 mg/L作用5 min，可使其減少4到5個對數級。噬菌體f2分別在濃度為4 000 mg/L以及8 000 mg/L的戊二醛的作用下，40 min和10 min，可減少5個對數級[20]。

2.4 含氯消毒劑

含氯消毒劑是指溶于水可產生具有致死微生物活性的次氯酸類消毒劑[21]。次氯酸分子量小，易擴散穿透外殼進入微生物體內，使蛋白質氧化，導致微生物死亡[22]。一般應用于食品工業(yè)消毒的有效氯濃度及時間：水消毒，0.3～1.0 mg/kg，3～5 min；果蔬消毒，50～100 mg/kg，5～10 min；食器消毒，100 mg/kg，2～5 min；淀粉的漂白殺菌使用0.16%以下濃度；啤酒制造廠的墻、地、設備等用75 mg/kg的溶液噴霧消毒。

在酸性環(huán)境中，含氯消毒劑溶解通過產生次氯酸增強殺菌能力。次氯酸可分解產生具有強氧化作用上午新生態(tài)氧，增強消毒效果[3,21]。Ebrecht發(fā)現次氯酸鈉完全滅活德氏乳桿菌噬菌體Cb1/204和Cb1/342的時間均為2.5 min，但滅活噬菌體Cb1/204所需濃度為200 mol/L，而噬菌體Cb1/342需要300 mol/L[6]。含氯消毒劑種類繁多，可分為無機和有機兩大類。無機氯消毒劑（次氯酸鈉、氯化磷酸三鈉、漂白粉等）的作用速度快，但不穩(wěn)定，易受光、熱和潮濕影響，從而喪失有效成分；有機氯消毒劑（氨銨T、雙氨銨T、三氯異氰尿酸等）雖性質穩(wěn)定，但有消毒作用較慢、溶于水穩(wěn)定性差等缺點[3]。不同噬菌體對含氯消毒劑的敏感程度不同：濃度為800 mol/L的次氯酸鈉在滅活植物乳桿菌噬菌體ATCC 8014-B2時需15 min，而滅活噬菌體ATCC 8014-B1、FAGK1和 FAGK2則需要30 min[23]。同樣濃度的次氯酸鈉滅活副干酪乳桿菌噬菌體ΦiLp84需要30 min，ΦiLp1308則僅需5 min[24]。另外，不同濃度含氯消毒劑的滅活效果差異顯著。在常溫下含有50 mol/L的次氯酸鈉作用16～18 h，可使94.7%的植物乳桿菌噬菌體P1失活；當含量達到800 mol/L時，P1完全失活[21]。戰(zhàn)威等發(fā)現將1.0 mg/L的氯胺與f2噬菌體混合10 min，可使其存活率下降0.78個對數級；0.10 mg/L二氧化氯作用10 min則可使其減少3.92個對數級。而當氯胺和二氧化氯協(xié)同作用時，滅活效果明顯提高，1.0 mg/L的氯胺與0.10 mg/L二氧化氯與噬菌體混合5 min后，可使其下降6個對數級[22]。還有研究表明，具有高強度滅菌效果的有機氯在含有其他有機溶劑時，其滅活效果會有所降低。這可能是由于有機物在病毒的表面形成了一層保護層，阻礙了消毒劑與病毒接觸，使病毒逐漸產生對藥物的適應性。帖金鳳等發(fā)現含氯消毒劑濃度與小牛血清含量對T7噬菌體的滅活效果有顯著影響。150 mg/L有效氯對懸液內大腸桿菌T 7噬菌體作用1 min可使其完全失活。當病毒懸液內加入體積分數為50%的小牛血清時，250 mg/L有效氯即使作用5 min也不可使其完全滅活，滅活率僅為99.97%[23]。

2.5 含氧類消毒劑

含氧類消毒劑（如高錳酸鉀、過氧乙酸、二氧化鈦和臭氧等）屬于高效消毒劑，具有強氧化能力，微生物對其十分敏感。一般食品工業(yè)應用過氧乙酸的濃度為0.2%～0.5%。過氧乙酸的強氧化性可直接氧化蛋白質致噬菌體死亡[7]，但增加濃度其滅菌效果提高不顯著（具有易揮發(fā)特性）。Binetti等發(fā)現0.15%過氧乙酸5 min就可滅活全部的大腸桿菌噬菌體021-4、031-D、CYM[8]。Capra等發(fā)現800ppm過氧乙酸處理5 min可使副干酪乳桿菌噬菌體PL-1（ATCC 27092-B1）和J-1（ATCC 27139-B1）完全失活[7]。

此外，一些氧化劑可配合其他物理條件達到較好滅活效果。如納米二氧化鈦，具有較強光催化性和氧化性，對噬菌體無滅活效果，經紫外線照射激發(fā)后，可有效滅活噬菌體[14]，其具有化學性質穩(wěn)定、成本低和無毒無害等特點。2009年，Mariángeles等發(fā)現紫外照射3 h，4種植物乳桿菌噬菌體B1、B2、FAGK1、FAGK2存活率在3 h分別下降2.3到3個對數級，而加入TiO2后，噬菌體B1、B2在2h，FAGK1、FAGK2在3 h后，達到完全滅活[5]。吳秉婷等應用納米二氧化鈦對噬菌體MS2進行了分析研究，發(fā)現無論在單純紫外光或自然光，增加一定量的納米二氧化鈦對噬菌體的滅活都有顯著作用。在紫外光下，加入800 mg/L的納米二氧化鈦10 min或者200 mg/L，20 min均可達到消毒作用。在自然光下，1000 mg/L納米二氧化鈦對噬菌體MS2作用5 min或200 mg/L，20 min可達到消毒水平。且紫外線作用時間較短時（＜30 min），與濃度有關；當照射時間較長時（＞30 min），改變二氧化鈦濃度對滅活效果影響不大。在紫外光協(xié)同作用下，分別加入（200、400、600、800和1000）mg/L納米二氧化鈦作用（5～20）min，平均滅活對數值隨時間增加而增加，作用（30～60）min時濃度對滅活效果影響不顯著[25]。

臭氧(O3)為強氧化劑，光譜殺菌劑。常應用于食品保鮮、漂白、水質處理中，一般用臭氧消毒食品加工車間，0.5-1.0ppm即可殺滅空氣中80%的自然菌。國際臭氧協(xié)會工業(yè)衛(wèi)生標準包括：0.1 ppm，接觸10 h（美國）：0.1 ppm，接觸8 h（德、法、日本）：0.1 ppm，0.16 mg/m3（中國），衛(wèi)生部規(guī)定臭氧最高允許濃度為0.2 mg/m3。臭氧的滅菌作用通過生物化學氧化反應實現，滅菌性能試驗表明：臭氧對大多數細菌、病毒、真菌及原蟲、卵囊都有明顯的滅活效果[26-27]，可直接破壞DNA或RNA，分解蛋白質、脂質類和多糖等大分子聚合物，影響噬菌體的生長繁殖過程[28]。早在1980年Kim等人就應用寄主吸附性電鏡技術研究了臭氧對f2噬菌體的滅菌機理，發(fā)現臭氧作用過程中可使噬菌體中RNA釋放出來，電鏡觀察還可見噬菌體斷裂成碎片[27]。并且利用臭氧滅活噬菌體效果非常顯著，在純水中，使用0.15 mg/L臭氧作用60 s后，噬菌體MS2存活率降低了1.75個對數級。隨臭氧濃度增加滅活效果也隨之增加，0.25 mg/L臭氧在30s內可使噬菌體MS2減少4個對數級，1.5 mg/L臭氧在10s內可使該噬菌體降低8個對數級[28]。

2.6 季銨鹽類消毒劑

季銨鹽類消毒劑是低效消毒劑，屬于陽離子表面活性劑，其優(yōu)點是毒性小、穩(wěn)定性好，常用于制造商業(yè)衛(wèi)生消毒劑。由于這類化合物可使蛋白質變性、沉淀，從而破壞噬菌體。Mercanti等在滅活噬菌體ΦiLp84和ΦiLp1308的研究中發(fā)現，0.50%（體積比）季銨氯化物作用5 min可使噬菌體完全滅活。即使在較低濃度0.25%（體積比）也可導致ΦiLp84顆?？焖儆行Щ睿═ 99＜5 min，完全失活需要15 min），但噬菌體ΦiLp1308在作用45 min后僅減少1個對數級[3]。

2.7 二氧化碳

二氧化碳是一種天然、無毒的殺菌劑，具有惰性、溶解性、蓄冷量和降低p H等性質，在食品領域中已經有廣泛應用，如碳酸飲料抑菌、超臨界流體萃取、食品急速冷凍和食品褐變控制等。由于二氧化碳的脂和親水性，若經溶解的二氧化碳在細胞內區(qū)域積聚，會在內部區(qū)域產生大量氫離子，降低p H值，導致代謝紊亂。其滅活噬菌體的機理是氫離子能輕易穿透噬菌體蛋白層，溶解磷脂和改變蛋白質的生理功能，內容物滲透，降低酶活性，而致死噬菌體[29]。此外，由于高溫可改變生物大分子活性，所以加壓的二氧化碳滅活效果更加明顯，無消毒副產物形成。2014年Huy等人證實，二氧化碳可有效滅活噬菌體ΦX 174和Qβ，0.7MPa作用25 min，兩種噬菌體分別減少了3和3.5個對數級[30]。由于二氧化碳屬于溫室氣體，在滅活噬菌體的同時也可減輕環(huán)境的壓力，因此可成為未來大力研發(fā)的方向。

3 結 論

目前，噬菌體侵染和滅活研究已取得較大突破，但多數處于實驗室試驗階段，在食品加工業(yè)中應用較少，沒有形成穩(wěn)定成熟的滅活體系。本文總結了滅活噬菌體的物理及化學方法作用機理，針對噬菌體個體差異可選擇不同的措施。通過豐富滅活方法，可在避免噬菌體侵染、防止產品質量和口感風味下降等方面獲得更多選擇。滅活噬菌體辦法的科學選擇仍將是未來研究的科研熱點和重點，掌握噬菌體的出現規(guī)律和污染途徑，積極采取綜合性、全方位的有效治理措施，對于有效防止噬菌體污染具有重要意義。