影響馬精液冷凍保存效率的因素分析

湯 馳，段洪云，鄧 亮*，韓國才

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.幽蘭醫(yī)療健康有限公司，廣東深圳 518000；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

自1957 年首次利用凍精輸精使母馬妊娠并獲得了幼駒[1]后，人們對馬精液冷凍保存技術(shù)的研究從未間斷過，但保存效果沒有實現(xiàn)很大的突破，凍精使用也未完全普及。長期以來，馬凍精的操作方法、稀釋液的選擇等都存在較大差異[2]，尚未形成統(tǒng)一的冷凍操作技術(shù)方法，缺乏直接有效的評估凍精制作效果的標(biāo)準(zhǔn)。影響馬精液冷凍保存效率的因素主要包括凍精稀釋液的種類、不同抗凍劑的使用、離心過程和平衡溫度的選擇等，目前尚未確定一套完整的標(biāo)準(zhǔn)。近年來，隨著我國現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)不斷升溫，對冷凍精液的研發(fā)和使用需求逐步增加[3-4]，如何在精液冷凍保存過程中降低精子死亡率是面臨的首要問題。本文綜述馬精液冷凍保存過程中精子死亡的影響因素，以期為提高馬精液冷凍保存效率、促進(jìn)我國馬產(chǎn)業(yè)更快發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

1 精 清

主要來源于副性腺的精清為精子的保護(hù)和運輸提供重要幫助，如前列腺含有較多的蛋白質(zhì)、檸檬酸、鋅，可以讓精子提前成熟。精清為精子提供合適的滲透壓、pH，防止過氧化作用[5-6]。但精液射出后精清中的某些物質(zhì)會使得精子提前獲能從而縮短精子存活時間，導(dǎo)致受胎率下降。另外，精清中的氯化鈉以及磷脂酶的水平直接影響降溫和冷凍時精子的存活[7-8]。人們希望通過去除精清中的有害物質(zhì)保留對精液冷凍保存有益成分，從而達(dá)到最佳的冷凍保存效果[7,9]，但目前精清中對精子有害的成分尚未研究透徹，其機理還不夠明確。

為了減少精清的毒害作用，在采精后需要去除精液中體積占比為5%～10%的精清，以500 ×g 離心10 min效果較佳[10]。采用單層梯度離心技術(shù)能夠有效提高冷凍-解凍后馬精子的質(zhì)量[11-12]。但若離心過程中離心力、離心時間和離心稀釋液等條件選擇不合適，將造成精子的大量死亡。在離心管底部加入瑞典沙克等緩沖液以及使用奶嘴式離心管，可以減少離心時精子在離心管底部因堆積造成的死亡[13]。

2 抗凍劑

在精液的冷凍保存中，抗凍劑是不可或缺的物質(zhì)之一，抗凍劑通過降低水的冰點值從而起到保護(hù)精子的作用?？箖鰟┌B透性和非滲透性抗凍劑，滲透性抗凍劑又分為甘油類和酰胺類，理想的抗凍劑應(yīng)該具有易溶、分子量小、毒性弱等特點。目前，甘油在精液的冷凍保存技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛，但甘油對精子具有一定毒性。甘油會導(dǎo)致精子的蛋白質(zhì)分解、改變頂體反應(yīng)、引起細(xì)胞膜囊泡化[14]；甘油會影響細(xì)胞質(zhì)膜的通透性以及生物能量的平衡性，改變胞內(nèi)微管蛋白和微絲蛋白以及胞質(zhì)糖蛋白的功能[15]。Macedo 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，甘油慢速穿過細(xì)胞質(zhì)膜會增加其毒性作用。胺類和酰胺類物質(zhì)作為馬精液冷凍保存抗凍劑的研究較為深入，主要涉及到甲酰胺、乙酰胺、甲基乙酰胺、二甲胺、二乙基甲酰胺、二甲基乙二胺、二甲基甲酰胺等不同物質(zhì)的選擇及混合使用等[17]。胺類和酰胺類物質(zhì)分子量較小，對精子的滲透壓影響較小，穿透精子膜的速度也較快，對精子造成的毒性較小[18]。Melo 等[19]分析發(fā)現(xiàn)，二甲胺、甘油和二甲基甲酰胺在解凍后對公馬精子活力影響無顯著差異，但二甲胺組的精子質(zhì)膜完整性比甘油組更好。Santiani 等[20]比較二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、乙二醇、甘油對秘魯帕索馬精液的抗凍保護(hù)能力，發(fā)現(xiàn)二甲基乙二胺效果最佳。

抗凍劑對精子的保護(hù)作用主要是由于抗凍劑所含的羥乙基中孤電子對的數(shù)量能夠形成氫鍵，使細(xì)胞脫水或者吸收細(xì)胞內(nèi)的水，從而使冰點值下降；另外，加入抗凍劑后溶液的濃度升高使稀釋倍數(shù)增大，冰點值也會下降，從而達(dá)到保護(hù)精子的目的[21]。

3 微生物

公馬陰莖和包皮內(nèi)有多種長駐微生物菌落，因此精液在采集后會攜帶許多微生物，且精液處理過程中使用的儀器設(shè)備、稀釋液等都含有一定的微生物。精液中某些微生物的抗凍能力很強，其不僅會直接抑制常溫下精子的存活，也會影響冷凍精液的質(zhì)量，有些甚至還會直接引發(fā)母馬生殖道疾病。精液中較為常見的微生物有肺炎桿菌和綠膿桿菌[22]。

在馬精液稀釋液中加入適量抗生素是抑制微生物的較為理想的方法。在精液冷凍保存中使用較多的抗生素有青霉素（鹽類）、鏈霉素（鹽類）、慶大霉素、阿米卡星、多粘菌素B 等[23]，但慶大霉素、阿米卡星加入到稀釋液后會直接影響稀釋液pH，不利于精子存活，此外pH 改變會使得以奶油為基礎(chǔ)的稀釋液凝結(jié)。慶大霉素和粘菌素等抗生素會抑制精子的運動，所以需要在稀釋液中合理添加抗生素[5]。

4 過氧化作用

正常情況下，精液中具有活性氧的生成和清除系統(tǒng)，二者處于動態(tài)平衡過程，而馬精液在制作成凍精時，體外處理時間較長容易產(chǎn)生活性氧[24]。在采集的精液中，精子死亡后便開始產(chǎn)生活性氧，死精中芳香化氨基酸在芳香化氨基酸酶的作用下降解產(chǎn)生過氧化物質(zhì)。精液中生成的活性氧過多或精子的清除能力下降時，活性氧就易誘發(fā)精子質(zhì)膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成大量脂質(zhì)過氧化物（LPO）[25]，導(dǎo)致精子運動力下降、質(zhì)膜完整性喪失，從而出現(xiàn)精子提前獲能、頂體反應(yīng)和超活化現(xiàn)象，降低母馬受胎率。另外，精子DNA 包括線粒體DNA 鏈的斷裂與過氧化作用也密切相關(guān)。合適的過氧化作用可以促進(jìn)精子獲能從而提高受胎率，大量的過氧化物產(chǎn)生雖然仍然能夠完成受精，但是會使得精子DNA 不完整，如發(fā)生堿基異位、堿基改變等，造成后代發(fā)生某些遺傳病[26]。

精液中存在抗氧化的酶類和非酶類物質(zhì)，構(gòu)成活性氧清除系統(tǒng)?？寡趸拿割愇镔|(zhì)包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等[27]；另外麥角硫因、谷胱甘肽、維生素、硒等非酶類物質(zhì)也具有一定的抗氧化作用。這些活性氧物質(zhì)之間相互協(xié)同，共同保護(hù)精子免受活性氧損傷。其機理主要分為3 個階段：第一階段為谷胱甘肽酶、超氧化歧化酶等抗氧化酶和金屬離子結(jié)合去除自由基；第二階段為維生素A、維生素E、谷胱甘肽等非酶類物質(zhì)結(jié)合谷胱甘肽酶類物質(zhì)共同清除過氧化物；第三階段為多種酶共同作用，修復(fù)及清除損傷的細(xì)胞表面分子和質(zhì)膜[28]。Franco 等[29]比較了添加α-生育酚與無抗過氧化劑條件下馬精液冷凍的效果，結(jié)果證明α-生育酚可顯著降低低溫保存對精子的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化作用。Wu 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，多種抗過氧化劑聯(lián)用比使用單一抗過氧化劑對馬精液冷凍保存的效果更好。

5 滲透壓

精子表面膜上的脂類物質(zhì)一般包括70%的磷脂、25%的中性脂類和5%的糖脂，但不同動物精子表面膜的組成存在一定差異[31]。精子質(zhì)膜脂類物質(zhì)的組成與精子降溫時抗冷打擊能力存在一定的相關(guān)性，即質(zhì)膜中膽固醇與磷脂之比越大，精子的抗冷打擊能力越強，另外飽和的磷脂酰類含量越多抗冷打擊能力也越強[32]。馬的精子質(zhì)膜中膽固醇與磷脂之比與牛、羊等家畜不同，因此精子對低溫的敏感性程度存在差異[33]。

溫度降低時，精子質(zhì)膜會從液態(tài)變?yōu)槟z狀，發(fā)生相位轉(zhuǎn)變時的溫度為17～34℃。不同的磷脂組成發(fā)生相位變化時的溫度也不同，月桂酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸等碳鏈短而不飽和的脂類其相變溫度在10～15℃，膽固醇、糖脂、鞘磷脂等碳鏈長而飽和的脂類相變溫度為30～40℃。馬的精子質(zhì)膜中含有較多的月桂酸和花生四烯酸，因此其相變溫度較低，精子也具有較強的抗冷打擊能力[34]。

人、牛和羊的精子體積約為20～28 μm3，馬精子體積約為25 μm3[35]。精子的等滲透壓為300 mosm/kg，馬精液在冷凍過程中精子受到的滲透壓改變主要來自2 個方面：第一，稀釋液，包括離心時的稀釋液和抗凍稀釋液。通過使用不同滲透壓的臺式液（TALP）研究對馬精子的影響，發(fā)現(xiàn)高滲溶液和低滲溶液中精子的活力、頂體完整率、線粒體完整率都有所下降，但是高滲溶液較低滲溶液的影響要小，且不論高滲或者低滲溶液，當(dāng)精子重新等滲時精子的體積不少于原先的0.707 8[36]。第二，溫度的變化，包括冷凍和解凍過程的溫度變化。冷凍時精子表面的水先結(jié)晶導(dǎo)致精子周圍的滲透壓增大，精子脫水，解凍時精子因吸水而膨脹，均會對精子造成一定的影響[37]。通過冷凍過程中精子的生物物理及生物化學(xué)現(xiàn)象來度量滲透壓對精子的損害程度，在溫度不變情況下，可以得出公式Vi=（M0/Mi）×（V0＋Vb）+ Vb，其 中V0、M0、Mi、Vb、Vi分 別 代 表 精 子 等滲體積、等滲壓、非等滲壓、重新等滲的體積和細(xì)胞非等滲體積，根據(jù)該公式可以選擇合適的稀釋液滲透壓。然而，精子所能承受的滲透壓與精子基因、溫度、水的穿透性、冷凍劑以及冰晶的形成都有關(guān)系，所以必須綜合考慮各方面的因素才能更有效地減少滲透壓對精子的損害[38]。

6 冷凍和解凍

精液冷凍保存時需要經(jīng)歷降溫的階段，快速降溫和慢速降溫都會對精子造成一定的損害?？焖俳禍?，細(xì)胞核內(nèi)的水分來不及流出，水分將滯留在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶損害細(xì)胞。慢速降溫，細(xì)胞外的水開始結(jié)晶，細(xì)胞外的滲透壓升高，細(xì)胞逐漸脫水，體積減小，而且慢速降溫時間比較長，細(xì)胞一直處于高滲溶液中會受到損害[39]。因此降溫速率一定要合適，才能最大程度減少化學(xué)性和滲透性傷害。

凍精的解凍過程也是造成精子死亡的重要因素之一，不合適的解凍方法會直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。凍精的解凍相當(dāng)于冷凍的逆過程，解凍時復(fù)溫的速率非常重要。一般來說越快越好，慢速復(fù)溫會使得細(xì)胞內(nèi)重新生成冰晶損害細(xì)胞。目前較為常見的馬凍精解凍方法包括37℃解凍30 s、46℃解凍20 s、75℃解凍7 s，這些方法都可以得到較好的凍后精液活力[40]。

7 小 結(jié)

精液冷凍保存是馬人工輔助繁殖技術(shù)之一，對促進(jìn)我國現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重要作用。目前我國對于馬精液冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用和推廣還不廣泛，對于馬精液冷凍保存時造成精子大部分死亡的因素尚未揭示清楚。因此，需要進(jìn)一步深入研究精液在冷凍過程中經(jīng)歷的生物物理和生物化學(xué)變化，以尋求相應(yīng)的技術(shù)手段為改進(jìn)馬精液的冷凍保存效果提供可靠的理論依據(jù)。