豬精液超低溫冷凍保存研究進(jìn)展

吳 夢(mèng)，劉雪芹，劉子嘉，肖普英，丁玉春,3,4，劉作華,3,4*，葛良鵬,3,4*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.養(yǎng)豬科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；3.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；4.重慶市醫(yī)用動(dòng)物資源開(kāi)發(fā)與轉(zhuǎn)化應(yīng)用工程技術(shù)中心，重慶 402460）

豬的遺傳資源保存是實(shí)驗(yàn)用豬作為模式動(dòng)物開(kāi)發(fā)應(yīng)用的基礎(chǔ)性保障。豬精液保存是豬遺傳資源保存的重要途徑，與卵母細(xì)胞、受精卵、胚胎的低溫保存相比，精液低溫保存技術(shù)方便、快捷且更加經(jīng)濟(jì)。不僅如此，精液低溫冷凍保存在建立動(dòng)物精液基因庫(kù)、提高優(yōu)良種公豬的利用率、開(kāi)展國(guó)際間種質(zhì)資源交流、防止疾病傳播等方面有著重要意義。但與鮮精保存相比，冷凍解凍后的精子活率和生育率較低，極大地限制了豬精液冷凍保存技術(shù)的推廣應(yīng)用。本文從豬精液冷凍保存的研究概況、冷凍損傷機(jī)理及豬精液冷凍保存影響因素方面的進(jìn)展進(jìn)行綜述，為豬精液超低溫冷凍保存研究提供新的思路和方法。

1 豬精液冷凍保存的研究概況

Polge 等[1]最初采用牛精液冷凍方法來(lái)冷凍豬精液，雖然解凍后的精子具有一定活力，但沒(méi)有受精能力。Polge 等[2]首次采用外科手術(shù)法將解凍后的精子直接注入受體母豬輸卵管，獲得了83%的受精卵。自20 世紀(jì)70 年代以后，豬冷凍精液的研究發(fā)展較快，陸續(xù)有報(bào)道利用凍精成功獲得存活仔豬。Pursel 等[3]和Westendorf 等[4]分別以顆粒和細(xì)管冷凍方法成功保存了豬精液。此后，為了把豬的精液冷凍技術(shù)應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中人們做出了大量工作，并對(duì)操作程序進(jìn)行了不斷優(yōu)化。20 世紀(jì)80 年代初至90 年代末，研究人員主要采用甘油（GLY）作為冷凍保護(hù)劑，通過(guò)優(yōu)化GLY 濃度、采用不同劑型和不同冷凍速率等探索提高豬精子冷凍效率的方法[5-8]。隨著對(duì)精液冷凍機(jī)理研究的深入，研究人員開(kāi)始發(fā)現(xiàn)并嘗試各種新型精液稀釋液，其中研究較多的是低密度脂蛋白（LDL）、雙糖（乳糖、蔗糖、乳果糖、海藻糖或蜜二糖）、甲基-β-環(huán)糊精載膽固醇（CLC）、谷胱甘肽、過(guò)氧化氫酶等，同時(shí)配合優(yōu)化后的冷凍-解凍方法來(lái)降低對(duì)精子活率和受精率的影響，并取得了一定進(jìn)展[9-15]。

國(guó)內(nèi)豬精液冷凍保存技術(shù)研究起步較晚，于1974年才開(kāi)始對(duì)豬精液冷凍保存技術(shù)開(kāi)展研究，20 世紀(jì)80年代開(kāi)始從國(guó)外引進(jìn)生產(chǎn)冷凍精液的設(shè)備和技術(shù)。吳石堅(jiān)等[16]統(tǒng)計(jì)了1981—1988 年豬冷凍精液人工授精（AI）的推廣與應(yīng)用，總計(jì)配種受體母豬61 481 頭，雖然第一情期平均受胎率為75.97%，但產(chǎn)仔率仍然處于較低水平。從20 世紀(jì)90 年代開(kāi)始，許多研究人員從冷凍保護(hù)劑、稀釋液、凍精劑型、解凍液等多方面進(jìn)行了研究和優(yōu)化，取得了一定成績(jī)，但對(duì)精子損傷機(jī)理、冷凍-解凍機(jī)理、冷凍-解凍對(duì)精子的影響等諸多方面尚不完全清楚，仍處于實(shí)驗(yàn)階段[17-22]。近年來(lái)，由于氧化性損傷對(duì)精子損傷機(jī)理研究的不斷深入，國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)始轉(zhuǎn)向研究抗氧化劑對(duì)豬精液冷凍保存的影響，以期在冷凍-解凍過(guò)程中提高精子活率，除了添加谷胱甘肽、過(guò)氧化物酶、維生素E 等添加劑外，還采用一些植物性抗氧化劑，例如黃芩素、黃芪多糖、紅景天多糖、芝麻酚等，雖然這些抗氧化劑能對(duì)豬精子產(chǎn)生不同程度的抗氧化作用，但就目前的研究結(jié)果來(lái)看，冷凍精液與鮮精相比，在受胎率和窩產(chǎn)仔率方面仍存在較大差距[23-27]，隨著對(duì)豬精子冷凍因素的深入分析，冷凍對(duì)豬精子形態(tài)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和酶活力等冷凍損傷機(jī)理研究的不斷深入，更多的冷凍保護(hù)劑在不斷地被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，因此還需要不斷探索，建立高效穩(wěn)定的豬精液冷凍保存方法，并將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，提高種豬繁殖力和豬種資源利用率。

2 豬精液冷凍損傷機(jī)理

2.1 物理性損傷 物理性損傷是指精子細(xì)胞水分形成的冰晶，其體積增大且形狀不規(guī)則，由于冰晶的擴(kuò)展和移動(dòng)，對(duì)精子質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成機(jī)械性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在緩慢降溫的條件下，冰晶形成的溫度范圍為-60～-10℃，-25～-10℃時(shí)形成冰晶最多，且降溫越緩慢冰晶形成越多，對(duì)精子損害越大。因此，在精液冷凍過(guò)程中要盡量避開(kāi)-60～-10℃這個(gè)危險(xiǎn)溫度區(qū)，才利于精液長(zhǎng)期保存。為了減少或避免發(fā)生冰晶化，必須快速降溫越過(guò)產(chǎn)生冰晶的溫度范圍，并保存在冰晶不再形成的超低溫條件下，如-196℃的液氮或-269℃的液氦[28]。當(dāng)然，冷凍速率并不是越高越好，如果冷凍速率過(guò)高，細(xì)胞內(nèi)水分不會(huì)完全流出，在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，而細(xì)胞質(zhì)中冰晶的形成最終導(dǎo)致冷凍損傷。Byrne 等[29]將5℃平衡后精液直接放入液氮蒸汽中，結(jié)果顯示精子活力明顯低于經(jīng)一定降溫速率冷凍的精子。除了冷凍時(shí)需要盡量減少冰晶形成外，解凍也同樣面臨-60～-10℃的危險(xiǎn)溫度區(qū)間，因此，快速解凍同樣非常必要。Johnson 等[30]以GLY 為例，在保證冷凍后豬精子的活率和頂體完整性上，得到的最佳冷凍組合：3%的GLY、30℃/min 的降溫速率和1 200℃/min 的解凍速率。因此，在豬精液冷凍過(guò)程中，無(wú)論是降溫還是升溫都應(yīng)采取快速處理，且配合適宜濃度的保護(hù)劑，以避免危險(xiǎn)溫度區(qū)對(duì)精子的損傷。

2.2 化學(xué)性損傷 化學(xué)性損傷是指不斷降溫過(guò)程中細(xì)胞外液首先形成一小部分冰晶，使細(xì)胞外液滲透壓逐漸增大，而精子細(xì)胞內(nèi)的水分由內(nèi)向外流出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度和滲透壓增高，精子細(xì)胞嚴(yán)重脫水發(fā)生不可逆的化學(xué)性損傷而死亡。研究表明，在精液稀釋液中添加一定濃度的GLY、二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等抗凍保護(hù)劑能盡量避免產(chǎn)生冰晶，增強(qiáng)精子的抗凍能力。但GLY、DMSO、DMF 等抗凍保護(hù)劑濃度過(guò)高同樣會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用，包括引起精子頂體、頸部及尾部的損傷及破壞某些酶類等[31]。Pinho 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，將GLY 與DMF 和二甲基乙酰胺（DMA）的組合作為抗凍保護(hù)劑冷凍豬精液后精子質(zhì)量要明顯好于單獨(dú)使用GLY 組。因此，選擇合適的抗凍保護(hù)劑組合以及濃度對(duì)精子冷凍效率至關(guān)重要。

2.3 氧化性損傷 氧化性損傷是指發(fā)生的氧化反應(yīng)對(duì)精子的結(jié)構(gòu)和活性造成的損傷。在正常狀態(tài)下，活性氧（ROS）的生成和消除是動(dòng)態(tài)平衡的，并且適量ROS 對(duì)機(jī)體的生理活動(dòng)也是必須的。但在精液冷凍過(guò)程中，由于低溫對(duì)精子的影響，精子細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，而細(xì)胞內(nèi)用于消除ROS 的抗氧化酶活性大大降低，造成ROS 在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量堆積，對(duì)精子造成不可逆的損傷[33-36]。研究表明，ROS 通過(guò)引發(fā)精子膜上的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量脂類過(guò)氧化物，從而使精子膜出現(xiàn)不可逆性破壞并消失，抑制精子的運(yùn)動(dòng)功能[35]。由于豬精子膜上的不飽和脂類含量較其他物種高，更容易發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致精子冷凍質(zhì)量低下，因此在豬精液冷凍過(guò)程中，更應(yīng)注意氧化性損傷對(duì)精子質(zhì)量的影響。

3 豬精液冷凍保存的影響因素

3.1 精液稀釋液 豬精液稀釋液是精子冷凍保存過(guò)程中的保護(hù)劑，對(duì)精液的冷凍效果起決定性作用。由于冷凍方法和冷凍劑型的不同，其冷凍稀釋液的組成成分也不盡相同，因此目前冷凍稀釋液的種類繁多。豬精液稀釋液主要分為含緩沖鹽和不含緩沖鹽的的冷凍稀釋液，含緩沖鹽的冷凍稀釋液主要包括甘氨酸-磷酸和葡萄糖-磷酸[37]、卵黃-葡萄糖-檸檬酸[38]、Beltsville F3（BF3）[39]、Tes-三羥甲基氨基甲烷（tris）-果糖-檸檬酸-卵黃（TEST）[40]、Beltsvle F5（BF5）[3]、Tris-葡萄糖-乙二胺四乙酸-卵黃[41]等；不含緩沖鹽的冷凍稀釋液主要包括卵黃-葡萄糖[2]、卵黃-蔗糖[42]及卵黃-乳糖[4]等。研究表明，精子在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)會(huì)使稀釋液的pH 發(fā)生變化，對(duì)精子產(chǎn)生不利影響，而含緩沖鹽的冷凍稀釋液中的檸檬酸、Tris 等緩沖物質(zhì)可調(diào)節(jié)精液適宜的pH為7.0～7.5，對(duì)精液有一定的保護(hù)作用[43]。

豬精液稀釋液的另一重要組成成分是冷凍保護(hù)劑，按其特性分為滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑因其相對(duì)分子質(zhì)量較小，容易透過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部，也被稱為細(xì)胞內(nèi)液冷凍保護(hù)劑，其親水性強(qiáng)、易與水分子結(jié)合，能在水結(jié)晶過(guò)程中限制和干擾水分子晶格的排列，抑制水分子形成冰晶。滲透性冷凍保護(hù)劑主要包括GLY、DMSO、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、甲醇（MeOH）、DMF、DMA 等。GLY 是目前應(yīng)用最廣泛的冷凍保護(hù)添加劑之一，它能在精液冷凍降溫時(shí)增加精子細(xì)胞內(nèi)部的滲透壓，減少精子由于失水過(guò)多而產(chǎn)生細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的不可逆性破壞，從而減緩細(xì)胞膜通透性的改變，減少精子死亡。同時(shí)，GLY 含有3 個(gè)羥基，能夠和細(xì)胞內(nèi)的水分結(jié)合，使精子在降溫過(guò)程中減少細(xì)胞內(nèi)部冰晶的形成，減輕精子細(xì)胞受到的物理性損傷[31]。Zeng 等[44]研究結(jié)果顯示，2%和3%的GLY 具有最佳的抗細(xì)胞凋亡作用，且B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 及其同源蛋白（Bcl-2/Bax）、腫瘤壞死因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體跨膜蛋白及其配體（Fas/FasL）的表達(dá)與精子凋亡有很強(qiáng)的相關(guān)性。李大吉[45]研究表明，GLY 濃度在2%～4%時(shí)凍融豬精液的精子活率和頂體完整性明顯優(yōu)于高濃度組。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能自由通過(guò)細(xì)胞膜，因此又叫細(xì)胞外液冷凍保護(hù)劑，其主要特性是溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，能誘導(dǎo)胞外冰晶網(wǎng)格及水分子籠型結(jié)構(gòu)的形成，減輕細(xì)胞物理性損傷。非滲透性冷凍保護(hù)劑分為低分子質(zhì)量和高分子質(zhì)量2 種，低分子質(zhì)量非滲透性冷凍保護(hù)劑主要通過(guò)改變細(xì)胞外液滲透壓，促使細(xì)胞在冷凍時(shí)脫水，而在解凍時(shí)防止水分快速進(jìn)入細(xì)胞，降低對(duì)細(xì)胞的損傷，其主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、乳糖等，不同濃度的幾種糖類混合使用對(duì)精液保護(hù)效果更好。潘紅梅等[46]將3 種雙糖（乳糖、蔗糖和海藻糖）以不同比例組合添加于豬精液冷凍保護(hù)液后，發(fā)現(xiàn)以33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖的組合對(duì)豬精液冷凍保護(hù)的效果最好。Gómez 等[47]研究了3 種單糖和5 種雙糖對(duì)精液冷凍效果的影響，結(jié)果顯示，單糖組中葡萄糖的效果最好，雙糖組中海藻糖效果最好，但海藻糖效果還是明顯優(yōu)于葡萄糖。高分子質(zhì)量非滲透性冷凍保護(hù)劑主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞玻璃化形成，減少冷凍和解凍過(guò)程致死性冰晶的生成，穩(wěn)定細(xì)胞膜，同時(shí)部分替代滲透性冷凍保護(hù)劑以減輕冷凍液的毒性，其主要包括葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯乙二醇和聚乙烯比咯烷酮（PVP）等。聚蔗糖在人胚胎和牛胚胎保存上已經(jīng)取得了成功，并廣泛應(yīng)用于多種哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍保存[48]。Checura 等[49]研究在稀釋液中加入不同濃度的PVP 對(duì)凍后牛胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示添加6%和20%的PVP 取得了較高的囊胚率。目前高分子質(zhì)量非滲透性冷凍保護(hù)劑主要用于卵母細(xì)胞及胚胎的玻璃化冷凍保存，在豬精液中的應(yīng)用還比較少見(jiàn)。

3.2 冷凍劑型 在豬精液冷凍劑型方面，最初采用玻璃瓶、玻璃試管加入稀釋液進(jìn)行冷凍保存。目前，在豬精液冷凍保存研究中，分別采用顆粒、5 mL 大型細(xì)管、5 mL 不同類型塑料袋、4～5 mL 鋁箔袋、1.7～2.0 mL 扁平細(xì)管、0.5 mL 中型細(xì)管和0.25 mL 微型細(xì)管等方法進(jìn)行保存，這些保存方式有著各自的優(yōu)缺點(diǎn)。Clarke 等[50]證實(shí)，顆粒法冷凍精液在冷凍和解凍時(shí)容易交叉污染，冷凍顆粒的劑量不準(zhǔn)確，在使用便利性上存在缺陷，且解凍后精子受精率較差，因此這一包裝類型在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用較少。李林林[51]采用0.25 mL 微型細(xì)管、5 mL 大型細(xì)管冷凍豬精液，發(fā)現(xiàn)兩者在凍后精子活力和活率的差異不顯著，可在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣使用。Eriksson 等[52]用5 mL 塑料袋冷凍豬精液，凍后精子的質(zhì)膜完整率平均為60%，精子活率為50%左右，產(chǎn)仔率達(dá)73%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)達(dá)10.7 頭。Waide[53]研究結(jié)果顯示，使用5 mL 鋁箔袋冷凍豬精液，采用快速冷凍法的精子活率明顯高于慢速冷凍法，且平均產(chǎn)仔率為72.9%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)為8 頭。Barbas 等[54]研究結(jié)果顯示，扁平細(xì)管或5 mL 塑料袋在受精能力、輸卵管富余精子方面比大型細(xì)管有明顯優(yōu)勢(shì)。殷方芝[55]研究發(fā)現(xiàn)，5 mL 大型細(xì)管解凍后的精子活力、活率、質(zhì)膜完整性都低于0.25 mL 微型細(xì)管，但差異不顯著。Bwanga 等[56]利用程序化冷凍儀進(jìn)行冷凍保存，解凍后0.25 mL 微型細(xì)管的精子活率明顯高于5 mL 大型細(xì)管，但兩者的頂體完整性差異不明顯。劉德玉等[57]采用3 種細(xì)管類型（0.25、0.5、5 mL）研究了對(duì)不同公豬精液冷凍效果的影響，結(jié)果顯示，相同劑型下，除0.25 mL 微型細(xì)管存在品種效應(yīng)外，其余2 種劑型在解凍后精子頂體完整率無(wú)顯著差異，0.5 mL 中型細(xì)管的精子活力最好，5 mL 大型細(xì)管的精子畸形率及頂體完整性最好。薛琦[58]研究表明，0.5 mL 中型細(xì)管解凍后精子活率顯著高于0.25 mL 微型細(xì)管。從生產(chǎn)實(shí)際來(lái)說(shuō)，采用大劑量包裝類型可以減少精液分裝及解凍的時(shí)間，提高AI 效率，但由于大劑量包裝在冷凍過(guò)程中冷凍速率不一致，精子受冷不均勻，導(dǎo)致解凍后精子質(zhì)量下降。從低溫生物學(xué)技術(shù)來(lái)說(shuō)，小劑量包裝類型有較大的表面積/容積比，可以達(dá)到較好的冷凍和解凍速率，且適合超低溫冷凍保存的形狀可以提高精液冷凍質(zhì)量，但由于單根冷凍保存劑量小，豬AI 一次需要的精液數(shù)量非常大，因此不利于生產(chǎn)實(shí)踐的推廣應(yīng)用。目前就國(guó)內(nèi)外應(yīng)用來(lái)看，為了保證冷凍精子的質(zhì)量，豬精液冷凍大多還是以0.25 mL 微型細(xì)管、0.5 mL 中型細(xì)管和5 mL 大型細(xì)管為主。

3.3 冷凍方法 在豬商業(yè)化精液冷凍生產(chǎn)中，主要采用的方法有Beltsville 冷凍法和改良Westendorf 冷凍法。Beltsville冷凍法是將采集后的精液經(jīng)過(guò)兩步法進(jìn)行稀釋，稀釋后的精液采用顆粒法進(jìn)行冷凍，制成0.15～0.2 mL 顆粒凍精，最后投入液氮（-196℃）貯存。解凍時(shí)，從液氮中取出冷凍精液，置于室溫3 min，然后迅速投入裝有BTS 解凍液的燒杯中（50℃，20 s）進(jìn)行解凍。Westendorf 冷凍法是將采集后的精液經(jīng)過(guò)三步法進(jìn)行稀釋，稀釋后的精液分裝在0.5 mL 中型細(xì)管、5 mL 大型細(xì)管等不同劑型里，利用程序化冷凍儀，按照初始溫度為5℃，以3℃/min從5℃降至-5℃，在-5℃條件下保持1 min 結(jié)晶，然后以50℃/min 從-5℃降至-140℃，最后投入液氮（-196℃）貯存。解凍時(shí)，從液氮中取出冷凍精液，迅速在恒溫水浴鍋中解凍，不同劑型解凍條件有所差異：0.25 mL微型細(xì)管（37℃，30 s）0.5 mL 中型細(xì)管（50℃，12 s 或37℃，20 s），5 mL 大型細(xì)管（50℃，40 s），5 mL 扁平袋（50℃，13 s），然后在室溫下用預(yù)熱的BTS 解凍液進(jìn)行相應(yīng)濃度稀釋。其中，Beltsville 冷凍法適用于豬顆粒凍精生產(chǎn)，Westendorf 冷凍法更適用于豬細(xì)管凍精的生產(chǎn)。雖然2 種豬精液冷凍法在生產(chǎn)實(shí)踐中已被認(rèn)作是標(biāo)準(zhǔn)方法，但在冷凍-解凍方法及解凍液等方面仍有改進(jìn)空間。周鑫等[59]采用不同冷凍方法和解凍液優(yōu)化了豬精液冷凍保存的方法，結(jié)果顯示，與液氮顆粒和液氮細(xì)管法相比，采用顆粒法冷凍結(jié)合葡萄糖-乙二胺四乙酸解凍液解凍是最優(yōu)的冷凍方法，使用該方法冷凍、解凍的豬精液進(jìn)行體外受精后的胚胎發(fā)育率與鮮精沒(méi)有顯著差異，同時(shí)體外受精后囊胚率與新鮮精液無(wú)顯著差異。梁鴻斌等[60]在冷凍速率和解凍溫度兩方面優(yōu)化了豬精液冷凍的方法，結(jié)果表明，采用-120℃平衡10 min冷凍，37℃，30 s 水浴解凍方法更為適合0.25 mL 微型細(xì)管豬冷凍精液解凍。查星琴等[61]研究不同解凍液配方和解凍方法對(duì)版納微型豬近交系（BMI）豬精液冷凍的影響，對(duì)比解凍后的精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率顯示，2%或3%的GLY 作為抗凍保護(hù)劑時(shí)，Ⅰ號(hào)解凍液解凍40℃、6 s 或50℃、6 s 水浴解凍效果最好。隨著冷凍方法各個(gè)環(huán)節(jié)的不斷優(yōu)化，細(xì)管凍精解凍后精子活率已與顆粒凍精相當(dāng)，加之采用細(xì)管凍精操作方便且不易交叉污染，因此，改良Westendorf 冷凍法已逐漸代替顆粒凍精并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

4 展 望

盡管近年來(lái)豬精液超低溫冷凍保存技術(shù)的研究取得了一定成績(jī)，但與牛、馬等家畜相比仍有很大差距，其主要原因在于：豬一次射精量大，約200～300 mL，精液對(duì)外界溫度非常敏感，極其不耐凍；其次，豬是多胎動(dòng)物，需要多達(dá)20 億～50 億枚凍精才能滿足1 次配種，這給大劑量豬精液冷凍保存帶來(lái)了極大困難；再者，一頭種公豬的經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)沒(méi)有種公牛高，且使用鮮精的繁殖效果比凍精更好。

根據(jù)最新報(bào)道顯示，河北省廊坊市研發(fā)的豬冷凍精液技術(shù)在全國(guó)率先實(shí)現(xiàn)了冷凍精液配種與鮮精配種同等效果的繁育水平，凍精解凍后精子活力為74%～87%，平均受胎率在90%以上，產(chǎn)仔數(shù)已接近常溫精液水平。盡管如此，由于豬冷凍精液所需儀器設(shè)備昂貴及操作程序復(fù)雜、對(duì)操作者技術(shù)和熟練程度有較高的要求、液氮保存和運(yùn)輸困難等各方面原因，豬精液超低溫冷凍保存技術(shù)仍然未建立一套完整、科學(xué)的冷凍程序和保存體系，無(wú)法在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。因此，針對(duì)豬精液冷凍保存技術(shù)目前存在的問(wèn)題，還需從以下幾個(gè)方面繼續(xù)努力：第一，建立一套完整的豬精液冷凍保存技術(shù)體系，并配套快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的精子質(zhì)量評(píng)估方法；第二，研發(fā)高通量大體積、自動(dòng)化的豬精液凍存設(shè)備，制定標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程；第三，建立豬精液種子保存平臺(tái)，為我國(guó)實(shí)驗(yàn)用豬、地方豬遺傳基因保存提供支撐。