犬新鮮冰凍血漿的制備及應(yīng)用

杜志國，尹 月，王 洋，高曉琦，郭 穎，尹燕博

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109 ; 2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；3. 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科,遼寧 沈陽 100016 ; 4.青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,山東 青島 266200 ; 5. 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院輸血科,遼寧 沈陽 100016)

輸血療法是輸入正常血液或血液成分進(jìn)行補(bǔ)血、止血、解毒的治療措施，在治療一些危重病例時(shí)具有重要作用。近年來，寵物臨床上使用輸血療法的情況逐漸增加。目前，國外普遍用成分血制劑替代全血制劑，這種做法不但節(jié)約了血液資源，還降低了輸血風(fēng)險(xiǎn)。成分血制劑是在一定條件下，用物理方法分離出全血內(nèi)的一種或幾種血液成分而制成的血液制劑。血液采集后，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)分離出的血漿，放置于-50 ℃溫度以下速凍后即為新鮮冰凍血漿。犬新鮮冰凍血漿功能主要有：改善凝血能力，大幅度提高血漿蛋白濃度，治療嚴(yán)重低蛋白血癥、低血容量、惡病質(zhì)等，補(bǔ)充缺少初乳的幼犬體內(nèi)的免疫球蛋白IgG[1]。隨著對新鮮冰凍血漿應(yīng)用了解加深，目前臨床上更多的用新鮮冰凍血漿治療凝血能力缺乏，如抗凝血?dú)⑹髣┲卸?，遺傳性或獲得性凝血因子缺失等[2]。輸注血漿的過程是有一定風(fēng)險(xiǎn)的。建立嚴(yán)格供血犬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，特別是血傳病原體檢測標(biāo)準(zhǔn)，可有效控制因輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。嚴(yán)格按照操作規(guī)范制備、儲存和運(yùn)輸血漿，不僅確保凝血因子和血漿蛋白不被破壞，也可有效降低輸血時(shí)的不良反應(yīng)。為保障犬新鮮冰凍血漿的質(zhì)量與生物安全，我們參照《血站技術(shù)操作規(guī)程》[3]，從供血犬的篩選、血傳病原檢測、血液的采集、新鮮冰凍血漿的制備、運(yùn)輸?shù)确矫妫_展了如下研究。

1 材料與方法

1.1 供血犬 健康狀況良好的比格犬，執(zhí)行了完善的免疫、驅(qū)蟲程序，性格溫順，服從性強(qiáng)，頸靜脈暴露清晰，紅細(xì)胞壓積不低于40%，體重10 kg以上，年齡1-8歲[1,4-6]，無輸血史及血液傳染病史[4,7-8]。

1.2 主要儀器 低溫保存箱(-86 ℃)、血液冷藏箱(儲血冰箱)、高頻熱合機(jī)、微電腦采液控制器(采血稱)、血液分漿夾、低溫低速大容量離心機(jī)、電子天平、一次性使用塑料血袋(多聯(lián)袋)、血細(xì)胞分析儀、采血架等。以上僅提供采集、制備犬新鮮冰凍血漿的基本儀器，滿足其采集、制備的最低要求。一些檢測項(xiàng)目需要在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.3 采血量及采血間隔 為保障動(dòng)物福利，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[1,6,7,9]采取了適當(dāng)補(bǔ)充營養(yǎng)，采血量不超過全部血量的20%，間隔21 d的方法。

1.4 病原檢測 檢測項(xiàng)目為：無形體屬(Anaplasmaspp)，巴貝蟲屬(Babesiaspp)，巴爾通體屬(Bartonellaspp)，埃立克體屬(Ehrlichiaspp)，嗜血支原體(Hemoplasmas)，利什曼原蟲屬(Leishmaniaspp)，犬布魯菌(Brucellacanis)[10-11]?？筛鶕?jù)地區(qū)流行情況適當(dāng)增減。

1.5 血液采集

1.5.1 采血前準(zhǔn)備 采血前對供血犬種群的健康狀況進(jìn)行檢查，檢測血常規(guī)，抽驗(yàn)血傳病原與某些病毒的抗體滴度，合格后方可采血；檢查采血器材并核實(shí)采血耗材清單，采血環(huán)境消毒；供血犬獻(xiàn)血前禁食(可不禁水)，剃除頸部毛發(fā)，檢測體溫。

1.5.2 采集血液 適當(dāng)保定并安撫供血犬，使之情緒穩(wěn)定。拇指按住頸部嵌窩處，即頸靜脈近心端，用食指指腹觸摸頸部皮膚并確定頸靜脈位置、走向和粗細(xì)程度，根據(jù)觸摸情況確定穿刺位點(diǎn)和進(jìn)針路徑。穿刺部位消毒后，進(jìn)行靜脈穿刺。如需進(jìn)行2次穿刺，應(yīng)在供血犬情緒穩(wěn)定后，在頸部另一側(cè)選擇穿刺部位。如犬情緒緊張，出現(xiàn)不配合表現(xiàn)，應(yīng)停止采血，廢棄未采到規(guī)定量的血袋，按醫(yī)療廢棄物管理規(guī)范集中處理。

靜脈穿刺成功后，松開導(dǎo)管上的止流夾，使采集的血液直接進(jìn)入采血稱上的采血袋。血液開始流入采血袋后，固定針頭位置，打開采血稱搖擺開關(guān)，自動(dòng)混勻血液。維持靜脈穿刺點(diǎn)與血袋之間的落差，利用重力保持血流通暢。血流不暢時(shí)，及時(shí)調(diào)整針頭位置。

1.5.3 留取樣本 采血時(shí)同步留取樣本，其檢測結(jié)果用于判定血液能否合格。

1.5.4 血袋及血液樣本標(biāo)識 對同一供血犬的血袋、樣本管和采血記錄進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)識。經(jīng)核對后，在采血袋、樣本管、血袋導(dǎo)管標(biāo)記同種編號，并在記錄單上詳細(xì)記錄采血時(shí)間，供血犬耳號，血袋編號，導(dǎo)管編號等信息。采血袋、樣本管和采血記錄的標(biāo)識連續(xù)完成，不得中斷。血液采集后盡快保存在血液運(yùn)輸箱中，以待進(jìn)一步處理。

1.5.5 熱合 根據(jù)導(dǎo)管上的編號分段熱合血袋導(dǎo)管并記錄導(dǎo)管編號，以供交叉配血、血型復(fù)查和血液樣本保存使用(見中插彩版圖1)。逐一檢查熱合部位，如有滲漏的情況，應(yīng)重新熱合，并評估對血液樣本無菌性的影響。熱合分離采血針頭，將其放置在專用的利器盒內(nèi)，統(tǒng)一處理。

1.5.6 采血現(xiàn)場整理 檢查采集的血液、樣本及記錄單信息一一對應(yīng)，保證準(zhǔn)確無誤；盤點(diǎn)并記錄物品消耗；整理廢棄物，用環(huán)境消毒劑擦拭操作臺及采血器材并進(jìn)行環(huán)境消毒。

1.6 新鮮冰凍血漿的制備 將血袋(聯(lián)袋，見中插彩版圖2)放于低溫大容量冷凍離心機(jī)的離心杯中，配平離心(±5 g)，離心力5 000 g，離心時(shí)間5 min。離心結(jié)束后，在離心機(jī)中取出離心杯，從離心杯中取出血袋，避免振動(dòng)，進(jìn)行檢查，觀察離心效果、血袋及其導(dǎo)管有無滲漏，離心杯中有無血跡，如有破損應(yīng)查找滲漏點(diǎn)。血袋破漏的，應(yīng)作消毒和報(bào)廢處理[3]。

檢查完成后，將血袋豎直放置于血液分漿夾中，將各導(dǎo)管附帶的止流夾移動(dòng)到連通器處并使之處于關(guān)閉狀態(tài)。將空的衛(wèi)星袋放置于電子稱上，電子秤歸零并打開相應(yīng)導(dǎo)管的止流夾。一切準(zhǔn)備就緒后，輕輕掰開血袋出口處的阻塞塞，此時(shí)處于血袋上層的血漿會(huì)通過導(dǎo)管流入空的衛(wèi)星袋(見中插彩版圖3)。第1次重離心后將盡可能多的血漿轉(zhuǎn)移至衛(wèi)星袋，在衛(wèi)星袋上作與血袋相同的標(biāo)識，完成后熱合斷離，生成1袋血漿。血漿中紅細(xì)胞混入量少(目視觀察)時(shí)，可繼續(xù)進(jìn)行下一步操作，如血漿紅細(xì)胞混入量較多，應(yīng)當(dāng)再一次進(jìn)行離心，離心完成后把上清血漿轉(zhuǎn)移至其他衛(wèi)星袋。

將分離的血漿編號(要與之前的編號分開并且能相互對應(yīng))并完善標(biāo)簽。完成后將血漿放于-80 ℃環(huán)境中速凍，注意速凍時(shí)要平鋪放置，不可堆放。速凍完成后，即為新鮮冰凍血漿，可將其存放于-20 ℃以下的環(huán)境中，保質(zhì)期1年，期滿后可作為冰凍血漿使用，保質(zhì)期在原有的基礎(chǔ)上再加4年。整個(gè)制備過程應(yīng)在血液采集后6-8 h內(nèi)完成。

1.7 生物安全檢測 將熱合的小段導(dǎo)管或樣本管中的血液進(jìn)行血傳病原檢測、無菌檢測。血傳病原檢測利用血液涂片和PCR手段，無菌檢測利用血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果剔除不合格的血漿。

1.8 運(yùn)輸 利用厚度為35～40 mm高密度泡沫保溫箱作為運(yùn)輸容器。通過查閱文獻(xiàn)[12]并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行調(diào)整，運(yùn)輸容器內(nèi)部構(gòu)造從底層開始依次為：蓄冷劑、吸水紙、緩沖帶、犬血漿、緩沖帶、吸水紙、蓄冷劑、容器蓋。冷卻劑為干冰和化學(xué)冰袋，并在血漿袋之間放置適量化學(xué)冰袋。每個(gè)血漿袋都單獨(dú)包裝在一個(gè)封閉的塑料袋中，防止意外導(dǎo)致的泄露。

2 結(jié)果

2.1 采血后供血犬狀態(tài) 采血709例，因供血犬掙扎，不能很好配合造成采血失敗36例(5.07%，36/709)，其中因掙扎，進(jìn)針方向等問題造成皮下淤血12例(5.04%，12/238)。供血犬采血后未出現(xiàn)明顯不適癥狀。采血失敗，皮下淤血等并未引起其他不良反應(yīng)。

2.2 質(zhì)量與管理 離心后出現(xiàn)不明原因溶血32例(4.75%，32/673)，其余均達(dá)到使用要求。血傳病原、無菌檢驗(yàn)全部為陰性。每袋血漿標(biāo)識明確，均可追溯到相應(yīng)供血犬。

2.3 運(yùn)輸安全性 通過快遞、汽運(yùn)等方式運(yùn)輸16次，試驗(yàn)前期出現(xiàn)融化現(xiàn)象1次，改進(jìn)后未發(fā)現(xiàn)因運(yùn)輸造成的包裝破損、血漿融化等現(xiàn)象。

2.4 臨床輸注結(jié)果 臨床輸注新鮮冰凍血漿1 197例，醫(yī)師反饋使用效果良好。除個(gè)別表現(xiàn)為體溫略微升高外，未發(fā)現(xiàn)其他不良癥狀。在本單位輸注新鮮冰凍血漿55例，用于嚴(yán)重脫水、凝血因子缺乏及重危病例，病犬康復(fù)效果明顯。其中3例出現(xiàn)單純發(fā)熱癥狀，治療后恢復(fù)正常；1例為突發(fā)性四肢僵直，停止輸注后癥狀消失；過敏反應(yīng)2例，表現(xiàn)為臉部腫脹，體溫升高，抗過敏治療后癥狀消失，未見其他不良反應(yīng)。

3 討論

Bernard F.Feldman、Jenny Helm、R.L.Lucas認(rèn)為供血犬體重應(yīng)為22.6～25 kg以上[1,5-6]，國內(nèi)張海斌、梁永春提出供血犬體重應(yīng)為10～20 kg[13-14]。我們通過比格犬的采血試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 kg以上的比格犬完全可以承擔(dān)供血犬的任務(wù)。目前經(jīng)國際標(biāo)準(zhǔn)確定的血型為8種，每個(gè)血型采用“DEA+數(shù)字”方法進(jìn)行命名[15-16]。DEA1.1和DEA1.2是DEA1血型的兩個(gè)亞型，抗原性最強(qiáng)，分布廣泛，是引發(fā)急性溶血性輸血反應(yīng)的主要原因。目前DEA1血型的檢測手段已十分成熟，但其他血型的快速檢測手段仍然處于開發(fā)階段。根據(jù)現(xiàn)有條件，將供血犬血型分為DEA1陰性與陽性兩類。由于犬體內(nèi)不存在DEA1.1、DEA1.2、DEA4和DEA6的天然抗體[17]，如果僅是制備血漿的情況下，可以不對供血犬進(jìn)行血型檢查。如果隨血漿同步制備紅細(xì)胞懸液，則必須檢測供血犬血型。為了減少病原體的傳播，所有采集的血液都應(yīng)進(jìn)行血傳病原檢測。供血犬采血前進(jìn)行的血傳病原檢測結(jié)果不能代替相應(yīng)血液制劑中的血傳病原檢測。

建立嚴(yán)格供血犬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，按照操作規(guī)范制備、儲存和運(yùn)輸犬新鮮冰凍血漿，是保障其質(zhì)量與生物安全的基礎(chǔ)。我們通過參考人類血站的操作規(guī)程，并經(jīng)多次實(shí)踐得出了適用于寵物臨床的操作流程。在犬新鮮冰凍血漿的制備、儲存、運(yùn)輸、追溯性與生物安全性等方面，已趨于成熟，形成了自己的規(guī)范。但仍存在不足，如供血犬的保定與安撫問題、血傳病原的檢測手段仍未達(dá)到國外先進(jìn)水平等。

通過大量臨床輸注，發(fā)現(xiàn)本方法制備的新鮮冰凍血漿安全性高，療效顯著。雖有少量病例發(fā)生輸血反應(yīng)，但癥狀輕微，及時(shí)發(fā)現(xiàn)，對癥治療后，輸血反應(yīng)均很快消失，臨床未發(fā)現(xiàn)其他損害。上述結(jié)果證明，我們建立的工藝流程、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是可行的，設(shè)施、設(shè)備及工作環(huán)境是可靠的，產(chǎn)品的儲存、運(yùn)輸方式也經(jīng)得起實(shí)踐的檢驗(yàn)，這些工作為建立專業(yè)動(dòng)物血站提供了參考。