蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的教學(xué)實(shí)踐研究

魏旭旭

[摘? ? ? ? ? ?要]? 在本科生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，主要利用了G蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)吞的原理，與綠色熒光蛋白與熒光蛋白顯微成像的技術(shù)結(jié)合起來(lái)，對(duì)受體蛋白內(nèi)吞的過(guò)程以及動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察，這種實(shí)驗(yàn)具有操作性強(qiáng)、結(jié)果清晰和直觀等特點(diǎn)，讓生物化學(xué)本科教學(xué)的內(nèi)容得到不斷的擴(kuò)展，使學(xué)生對(duì)蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)特征理解更加深入，從而將學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的綜合能力有效提高。主要對(duì)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的教學(xué)實(shí)踐進(jìn)行探討，希望能夠提供一定的參考價(jià)值。

[關(guān)? ? 鍵? ?詞]? 蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng);生物化學(xué);實(shí)驗(yàn)教學(xué)

[中圖分類(lèi)號(hào)]? G712? ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]? A? ? ? ? ? ? [文章編號(hào)]? 2096-0603（2019）31-0292-02

目前在高校進(jìn)行生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主要內(nèi)容是對(duì)體外非細(xì)胞體系的測(cè)試性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比如檢測(cè)酶的活性、測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度等，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的教學(xué)非常少，通過(guò)有效利用相關(guān)的原理和熒光蛋白顯微成像的技術(shù)，讓學(xué)生能夠?qū)κ荏w蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)以及回膜運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察和實(shí)驗(yàn)，并且還能對(duì)下游招募蛋白的定位和運(yùn)動(dòng)同時(shí)進(jìn)行觀察，這種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒粌H能研究膜受體的內(nèi)吞機(jī)制基礎(chǔ)，還能篩選出受體的藥物，具有非常大的推廣價(jià)值。

一、蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)原理

G蛋白偶聯(lián)受體在真菌和哺乳動(dòng)物的生命體中廣泛存在，是一種具有高保守性的細(xì)胞膜蛋白超家族。在細(xì)胞外其信號(hào)主要是通過(guò)GPCRs傳遞信息至細(xì)胞內(nèi)部，并能充分發(fā)揮調(diào)控的作用，該類(lèi)信號(hào)傳輸系統(tǒng)能夠緊密聯(lián)系人體內(nèi)部的疾病，比如肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松等，所以GPCRs一直是研發(fā)新藥的重要因素。當(dāng)GPCRs中的激動(dòng)劑一直存在時(shí)，將會(huì)在幾分鐘或幾個(gè)小時(shí)內(nèi)降低引起細(xì)胞膜表面的受體數(shù)量，則會(huì)發(fā)生內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)，之后GPCRs就會(huì)呈現(xiàn)出反應(yīng)性的降低情況，這種現(xiàn)象被稱為受體失敏現(xiàn)象，GPCRs進(jìn)行內(nèi)吞以及失敏是對(duì)GPCRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要內(nèi)容。進(jìn)行內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)后，受體可以通過(guò)內(nèi)含體循環(huán)運(yùn)動(dòng)回到細(xì)胞膜表面，從而完成復(fù)敏，還可以被送到溶酶體中進(jìn)行不可逆的降解工序。

二、蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的具體實(shí)驗(yàn)步驟

（一）提取并檢測(cè)質(zhì)粒

在本實(shí)驗(yàn)中所使用的質(zhì)粒包括FPR1-pEGFP、PCMV-FPR1等，在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化所用的質(zhì)粒，并擴(kuò)大培養(yǎng)搖菌，使用專用的去除內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒將相關(guān)的質(zhì)粒提取出來(lái)，并用紫外分光光度法定量分析所有提取的質(zhì)粒。

（二）培養(yǎng)相關(guān)的細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞株為人胚胎腎細(xì)胞HEK293，用FBS（10%）的DMEM/Low Glucose的培養(yǎng)基在37℃的溫度以及CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)（80%～90%），再對(duì)其進(jìn)行稀釋，比例為1∶3～1∶5。

（三）轉(zhuǎn)染工序

HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)比較良好，將其繼續(xù)接種在有6個(gè)孔的培養(yǎng)板中，其密度值為3×105～5×105，繼續(xù)在37℃的溫度下以及CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中對(duì)其培養(yǎng)，時(shí)間長(zhǎng)度一般為18～24h，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，再使用Lipofectamine對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染工序，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)4～6h之后，將其換入新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)8～12h，目前比較常使用的轉(zhuǎn)染方案是將6孔培養(yǎng)板中其中2孔的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，直接對(duì)FPR1-GFP的受體蛋白進(jìn)行觀察，主要觀察發(fā)生的內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)，其他4孔細(xì)胞主要用于對(duì)FPR1被配體激活后輔助蛋白的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察，在該實(shí)驗(yàn)中學(xué)生可以根據(jù)實(shí)際的情況對(duì)設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行調(diào)整。

（四）研究受體的定位以及內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)

首先需要在有滅菌蓋玻片的6孔板中平均分配6孔板中轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞，讓細(xì)胞在滅菌蓋玻片上進(jìn)行生長(zhǎng)，在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，并且在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天觀察細(xì)胞的匯合度是否達(dá)到70%～80%，在6孔板中將其中2孔的細(xì)胞提前加入蛋白質(zhì)合成的抑制劑放線菌酮進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，然后使用激動(dòng)劑對(duì)已經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行孵育，孵育時(shí)常分別為0min、5min、30min、45min，主要是對(duì)激動(dòng)劑處理時(shí)間不同受體蛋白發(fā)生的定位以及內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察，再配置出不同濃度的激動(dòng)劑fMLP對(duì)其進(jìn)行稀釋，在37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育45min，對(duì)不同濃度激動(dòng)劑對(duì)FPR1受體內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)的影響進(jìn)行觀察，待孵育完畢后吸出待檢細(xì)胞中的細(xì)胞培養(yǎng)基，并使用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行漂洗，漂洗后，首先使用多聚甲醛（濃度為4%）在室溫中固定10min，再在6孔板中取出玻片，將其放置在滴有甘油的蓋玻片上進(jìn)行封片，最后使用熒光顯微鏡對(duì)綠色熒光蛋白的分布進(jìn)行觀測(cè)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）對(duì)不同時(shí)間的激動(dòng)劑作用下FPR1從細(xì)胞膜到包漿的內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察

使用FPR1激動(dòng)劑fMLP對(duì)有FPR1-pEGFP的細(xì)胞進(jìn)行刺激轉(zhuǎn)染，并在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中分別孵育0、5、30以及45min，用使用熒光顯微鏡對(duì)融合蛋白的定位進(jìn)行觀察，其膜受體蛋白內(nèi)存運(yùn)動(dòng)的具體過(guò)程如圖1所示。

由圖1可以看出，在0min時(shí)加不加激動(dòng)劑，受體蛋白主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，而在5min時(shí)，部分的受體蛋白已經(jīng)形成顆粒狀，并出現(xiàn)了內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)，但是細(xì)胞膜上還存在一部分的受體蛋白。

（二）對(duì)激動(dòng)劑濃度不同作用于FPR1后的受體內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)進(jìn)行觀察

使用不同濃度的FPR1激動(dòng)劑對(duì)有FPR1-pEGFP的細(xì)胞進(jìn)行刺激轉(zhuǎn)染，濃度分別為1μmol/L、100nmol/L以及10nmol/L，在溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育45min，并使用熒光顯微鏡對(duì)受體蛋白的定位進(jìn)行觀察，其實(shí)主要的內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)如圖2所示。

由圖2可以看出，當(dāng)激動(dòng)劑為低濃度10nmol/L時(shí)，受體蛋白沒(méi)有發(fā)生內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)，而在100nmol/L的刺激下，則開(kāi)始發(fā)生部分的內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)，最后使用高濃度1μmol/L激動(dòng)劑時(shí)，幾乎全部發(fā)生了內(nèi)存運(yùn)動(dòng)，這說(shuō)明在受體蛋白內(nèi)吞的數(shù)量與激動(dòng)劑的濃度存在一定的關(guān)聯(lián)。

四、結(jié)語(yǔ)

通過(guò)在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)的教學(xué)實(shí)踐，可以了解到這種教學(xué)實(shí)踐能夠?qū)?shí)驗(yàn)的思考有效擴(kuò)展開(kāi)來(lái)，并且讓學(xué)生學(xué)習(xí)到熒光蛋白顯微成像技術(shù)，具有較強(qiáng)的綜合性，也能積極調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，最后實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也非常直觀，能夠讓學(xué)生對(duì)蛋白質(zhì)在信號(hào)刺激以及一系列分子事件當(dāng)中的運(yùn)動(dòng)和相關(guān)機(jī)制得到更加深入的認(rèn)識(shí)和了解，促進(jìn)學(xué)生得到全面發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

史影，王偉偉，葉伶燕，等.蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的教學(xué)實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2019，36（1）：24-27.

編輯 陳鮮艷