秈稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)條件優(yōu)化

李三和 閘雯俊 徐華山 劉凱 周雷 游艾青

摘要：以福稻88//華占/甬優(yōu)2640的F1代為材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)。采用正交試驗(yàn)法設(shè)置預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間、熱激溫度、噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）濃度4種因素各4個(gè)水平，共16種處理組合，對不同條件下花藥誘導(dǎo)出愈率進(jìn)行比較。結(jié)果表明，直觀分析確定的4個(gè)因素最優(yōu)組合為預(yù)處理溫度10 ℃、預(yù)處理時(shí)間8 d、熱激溫度37 ℃、TDZ濃度0.10 mg/L，但考慮到因素間的交互作用，進(jìn)一步分析得到最優(yōu)組合為預(yù)處理溫度10 ℃、預(yù)處理時(shí)間8 d、熱激溫度37 ℃、TDZ濃度0.05 mg/L。

關(guān)鍵詞：秈稻;花藥培養(yǎng);誘導(dǎo)效率;交互作用

中圖分類號：S511.2+1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0218-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.054? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization of induction conditions for anther culture of indica rice

LI San-he1，2，ZHA Wen-jun1，XU Hua-shan1，LIU Kai1，ZHOU Lei1，YOU Ai-qing1，2

（1.Food Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasms and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China;2.Collaborative Innovation Center of Hubei Province，The Main Food Crop Industrialization （Yangtze University），Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： Anther culture was carried out with F1 generation of Fudao 88//Huazhan/Yuyou 2640 as material. The orthogonal test method was used to set four levels of pretreatment temperature， pretreatment time， heat shock temperature and concentration of thiazolidine（TDZ）; a total of 16 treatment combinations were used to induce anthers under different conditions. The anther induction rate was compared under different conditions. The results show that the optimal combination of the four factors determined by visual analysis is： pretreatment temperature 10 ℃， pretreatment time 8 d， heat shock temperature 37 ℃， TDZ concentration 0.10 mg/L. However， considering the interaction between the factors， the optimal combination was obtained： pretreatment temperature 10 ℃， pretreatment time 8 d， heat shock temperature 37 ℃， TDZ concentration 0.05 mg/L.

Key words： indica rice; anther culture; induction efficiency; interaction

自1968年日本Niizeki和Oono將花藥培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于水稻第一次獲得水稻花藥培養(yǎng)單倍體植株以來，中國也于1975年利用花藥培養(yǎng)育種技術(shù)第一次育成了粳稻品種單豐1號，此后花培技術(shù)在中國常規(guī)水稻育種中開始應(yīng)用。由于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體通過染色體加倍可以在當(dāng)代獲得穩(wěn)定的純合二倍體，同時(shí)表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，所以將花藥培養(yǎng)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，可以快速純合有益基因，提高選擇效率，縮短育種周期[1-5]，或者快速得到較大的DH群體或穩(wěn)定的水稻材料用于開展水稻相關(guān)基礎(chǔ)研究。

雖然水稻花培技術(shù)已經(jīng)有幾十年的歷史，但受制于基因型和其他多方面因素的影響，該技術(shù)在粳稻上的應(yīng)用已經(jīng)相對比較成熟，但秈稻的花培效率一直較低，嚴(yán)重影響秈稻花培在育種和相關(guān)研究中的應(yīng)用。關(guān)于如何提高花藥培養(yǎng)的效率，國內(nèi)外也有很多的文獻(xiàn)報(bào)道，在基本培養(yǎng)基成分、植物生長調(diào)節(jié)劑種類和配比、低溫預(yù)處理及相關(guān)過程性因素等對培養(yǎng)效率的影響方面作了大量的研究[6-16]，部分培養(yǎng)效率有所提高，但總的來說，效果都不是很穩(wěn)定。這些文獻(xiàn)報(bào)道的試驗(yàn)條件探討基本都是針對單個(gè)或多個(gè)因素的獨(dú)立研究[4，12-24]，沒有考慮因素間的交互作用，因而導(dǎo)致改變基因型時(shí)培養(yǎng)效果有非常大的變化。本研究將通過正交試驗(yàn)法，分析低溫預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間、噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）濃度及熱激溫度4個(gè)因素對花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)效率的影響，探討秈稻花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的最佳條件，提高花培誘導(dǎo)效率，為水稻育種提供更好的技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 所用水稻材料為秈型育種材料福稻88//華占/甬優(yōu)2640。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 以N6為誘導(dǎo)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基：N6+KT 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+脯氨酸600 mg/L+麥芽糖50 mg/L+植物凝膠3.0 mg/L;并添加不同濃度的TDZ;培養(yǎng)基pH均為5.8。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)? 采用正交試驗(yàn)法，設(shè)置了包括不同低溫預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間、TDZ濃度及熱激溫度4因素4水平的正交方案共16種處理組合。具體見表1和表2。

1.2.2? 幼穗取材、低溫處理及花藥接種? 操作按文獻(xiàn)常規(guī)[17]進(jìn)行，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種100個(gè)花藥。接種后于28 ℃黑暗進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3? 統(tǒng)計(jì)方法? 黑暗培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)每瓶誘導(dǎo)的愈傷組織個(gè)數(shù)，計(jì)算平均值得出該試驗(yàn)類型的愈傷組織誘導(dǎo)率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 花藥誘導(dǎo)效果的觀察

花藥培養(yǎng)一般用出愈率來評價(jià)愈傷組織誘導(dǎo)效果?；ㄋ幷T導(dǎo)效果試驗(yàn)各個(gè)處理組合的平均出愈率觀察結(jié)果見表3。

出愈率=（愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù)）×100%

2.2? 不考察交互作用的直觀分析

低溫預(yù)處理主要用于改善水稻花粉的生理狀態(tài)，減少培養(yǎng)過程中的褐化，提高花粉脫分化程度，使之轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育，從而提高誘導(dǎo)效率。由表4預(yù)處理溫度4個(gè)水平的出愈率平均值k大小變化可知，預(yù)處理溫度在4～10 ℃范圍內(nèi)變化時(shí)，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率隨溫度升高而增加，試驗(yàn)中預(yù)處理溫度為10 ℃時(shí)，花藥誘導(dǎo)效率達(dá)到最優(yōu);預(yù)處理時(shí)間在8～15 d范圍內(nèi)變化時(shí)，花藥出愈率隨時(shí)間延長逐漸下降，因而預(yù)處理時(shí)間為8 d時(shí)，花藥誘導(dǎo)效率最優(yōu)。

高溫?zé)峒ぬ幚砟芗涌煨℃咦臃至?，從而提高花藥培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)率。熱激溫度和熱激時(shí)間長短都對熱激效果有影響，一般認(rèn)為熱激24 h效果最好，不同的熱激溫度對花藥生理生化性狀的影響有所差異，從而導(dǎo)致每個(gè)水平的出愈率不同。由表4熱激溫度4個(gè)水平的出愈率平均值k大小變化可知，試驗(yàn)中熱激溫度變化對花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率的影響并不穩(wěn)定，但37 ℃時(shí)，花藥誘導(dǎo)效率最優(yōu)，這可能與多個(gè)因素的協(xié)同影響有關(guān)。

TDZ是一種非常有效的人工合成植物生長調(diào)節(jié)劑，它具有生長素和細(xì)胞分裂素的活性，能夠替代生長素和細(xì)胞分裂素促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生[25]，所以誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入一定濃度的TDZ能影響花藥的出愈率。從表4 TDZ濃度4個(gè)水平的出愈率平均值k大小可知，一定范圍內(nèi)，TDZ濃度升高，花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率在逐漸增加，添加量為0.10 mg/L時(shí)達(dá)到最高;繼續(xù)增加TDZ濃度，花藥出愈率反而下降。

綜合4個(gè)因素在不同水平條件下的出愈率的總和K及其平均值k和極差R可以看出，影響出愈率的因素極差大小排序?yàn)轭A(yù)處理溫度>熱激溫度>預(yù)處理時(shí)間>TDZ濃度（A>C>B>D），根據(jù)各因素各水平的平均值確定優(yōu)水平分別為A4、B1、C4、D3，即預(yù)處理溫度為10 ℃、預(yù)處理時(shí)間為8 d、熱激溫度為37 ℃、TDZ濃度為0.10 mg/L，進(jìn)而選出優(yōu)組合為A4B1C4D3。

2.3? 考慮交互作用的結(jié)果分析

2.3.1? 預(yù)處理溫度和預(yù)處理時(shí)間? 圖1為預(yù)處理溫度A與預(yù)處理時(shí)間B的交互作用折線圖。假定A、B間有交互作用，那么它們不同水平間的交互作用折線應(yīng)該會有明顯相交的現(xiàn)象，反之折線應(yīng)該是趨于平行的。由圖1可以看出，預(yù)處理時(shí)間為12 d和15 d的兩條折線在預(yù)處理溫度為4 ℃和6 ℃處是平行的，預(yù)處理時(shí)間為8 d和12 d的兩條折線在預(yù)處理溫度為8 ℃和10 ℃處是平行的，雖然圖中有部分折線平行，但仍有明顯相交的地方，即預(yù)處理溫度和預(yù)處理時(shí)間之間存在交互作用。

2.3.2? 預(yù)處理溫度和熱激溫度? 同理，由圖2可以看出，預(yù)處理溫度和熱激溫度的交互作用折線圖上的折線有明顯相交，沒有平行的部分，即預(yù)處理溫度和熱激溫度存在交互作用。

2.3.3? 預(yù)處理溫度和TDZ濃度? 由圖3可以看出，TDZ濃度為0、0.05和0.50 mg/L的3條折線在預(yù)處理溫度為4 ℃和6 ℃處是平行的，但是圖上4條折線更多的還是有明顯相交的地方，并沒有完全平行，所以預(yù)處理溫度和TDZ濃度存在較小的交互作用。

2.3.4? 預(yù)處理時(shí)間和熱激溫度? 由圖4可以看出，圖上4條折線有明顯相交，所以預(yù)處理時(shí)間和熱激溫度之間是存在交互作用的。

2.3.5? 預(yù)處理時(shí)間和TDZ濃度? 由圖5可以看出，TDZ濃度為0.05、0.10 mg/L的兩條折線有部分平行，但是其他部分、與另外兩條折線都有明顯相交的部分，沒有完全平行，所以預(yù)處理時(shí)間和TDZ濃度之間也存在交互作用。

2.3.6? 熱激溫度和TDZ濃度? 由圖6可以看出，TDZ濃度為0.10和0.50 mg/L的兩條折線有部分平行，但是其他部分、與另外兩條折線都有明顯相交的部分，沒有完全平行，所以熱激溫度和TDZ濃度是存在交互作用的。

2.3.7? 考慮交互作用的試驗(yàn)結(jié)果分析? 由表5的幾個(gè)因素極差大小可知，這些因素對該材料花藥誘導(dǎo)愈傷組織影響效應(yīng)的主次順序是A、A×B、A×C、A×D、C、C×D、B、B×C、B×D、D，在不考慮因素間的交互作用時(shí)，根據(jù)數(shù)據(jù)分析選出的最優(yōu)組合為A4B1C4D3。但該試驗(yàn)中，交互作用A×D比交互作用C×D對該材料出愈率的影響更大，而交互作用C×D又比交互作用B×D的影響更大，交互作用B×D比因素D的影響更大，所以按A、D各水平搭配的好壞確定D的優(yōu)水平，經(jīng)過比較可以得到，取A4D2時(shí)最好，從而可以確定優(yōu)方案為A4B1C4D2，即預(yù)處理溫度為10 ℃、預(yù)處理時(shí)間為8 d、熱激溫度為37 ℃、TDZ濃度為0.05 mg/L（I-13處理組合），這也是試驗(yàn)16種處理組合中出愈率最高的組合。這個(gè)結(jié)果也證明了本試驗(yàn)正交設(shè)計(jì)得出的結(jié)果正是考慮了各因素間的交互作用。

3? 討論

以每種處理組合的出愈率作為檢測該秈稻材料在每種條件下的誘導(dǎo)效率，具有簡便快捷的優(yōu)點(diǎn)，可較快地選出最優(yōu)組合。本試驗(yàn)采用正交法設(shè)置了預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間、熱激溫度、TDZ濃度4個(gè)因素4個(gè)水平共16種處理組合，統(tǒng)計(jì)每種處理組合的出愈率，得出了預(yù)處理溫度10 ℃、預(yù)處理時(shí)間8 d、熱激溫度37 ℃、TDZ濃度0.05 mg/L的優(yōu)方案，即正交設(shè)計(jì)的方案I-13，這也印證了正交設(shè)計(jì)的合理性。當(dāng)然，各因素的各水平之間可能還存在著一個(gè)更精細(xì)的水平可以使花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率更高，這需要更進(jìn)一步的試驗(yàn)，縮小因素水平范圍。同時(shí)，此次試驗(yàn)確定了每兩個(gè)因素之間具有交互作用，但關(guān)于它們之間的交互作用到底是正作用還是負(fù)作用還有待進(jìn)一步的研究。

趙永英等[26]曾經(jīng)研究過TDZ在小麥花培中的作用，結(jié)果表明它的作用和劑量與小麥基因型有關(guān)系，因而在有的材料中呈現(xiàn)負(fù)向調(diào)控作用在有的材料中又呈現(xiàn)出正向調(diào)控作用。本試驗(yàn)中，TDZ濃度對秈稻花培的調(diào)控作用是正向的，但濃度不同，調(diào)控程度不一樣，會出現(xiàn)波動，若只考慮單因素的影響，濃度為0.10 mg/L時(shí)效果最好，但綜合其他因素，TDZ的濃度以0.05 mg/L為宜。其他品種水稻花藥培養(yǎng)效果是否也可以受TDZ濃度的影響有待繼續(xù)研究。

孫杰等[15]在水稻花藥培養(yǎng)適宜條件的相關(guān)研究中關(guān)于最適宜的預(yù)處理溫度是8 ℃，但本試驗(yàn)的最適溫度是10 ℃，結(jié)論有所差異，可能是因?yàn)椴牧喜煌蛘呤桥囵B(yǎng)過程中受到了其他因素的影響，但也沒有超出一般文獻(xiàn)報(bào)道的8～10 ℃預(yù)處理有較好效果的范圍。通過熱激溫度對花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)率影響的測定，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)花培誘導(dǎo)效率隨著熱激溫度的升高而逐步增加，綜合考慮多個(gè)因素也能得出相同的結(jié)論，即一般來說，37 ℃熱激24 h能起到最好的效果。

總的來說，秈稻花藥培養(yǎng)效率受基因型的影響最大，且秈稻比粳稻低很多，想要將該項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用到水稻育種中，除了多方面探索各種影響因素的最佳條件外，創(chuàng)制高花培效率的種質(zhì)作為育種中間材料也尤為重要。

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