菠菜ＳｐＮＨＸ１基因的克隆及生物信息學(xué)分析

張海洋 付嬈 李茹霞 顧寅鈺 梁曉艷 宋延靜 李萌 王向譽(yù) 郭洪恩

摘要：從菠菜（Spinacia oleracea L.）栽培種中克隆得到1個(gè)NHX1基因，命名為SpNHX1。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SpNHX1屬于Vac亞家族，序列長度為6 090 bp，開放閱讀框?yàn)? 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸殘基。利用相關(guān)軟件或在線工具對(duì)SpNHX1進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明其編碼蛋白分子式為C2 818H4 363N697O772S25，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白;進(jìn)化樹分析表明SpNHX1蛋白與擬南芥AtNHX1、AtNHX2親緣關(guān)系較近，屬于定位在液泡膜上的蛋白，SpNHX1蛋白與雙子葉植物的NHX蛋白親緣關(guān)系較近。

關(guān)鍵詞：菠菜（Spinacia oleracea L.）;耐鹽;SpNHX1;基因克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S636.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）23-0211-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.052? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Cloning and bioinformatic analysis of SpNHX1 gene from Spinacia oleracea L.

ZHANG Hai-yang，F(xiàn)U Rao，LI Ru-xia，GU Yin-yu，LIANG Xiao-yan，SONG Yan-jing，

LI Meng，WANG Xiang-yu，GUO Hong-en

（Shandong Institute of Sericulture，Yantai 264002，Shandong，China）

Abstract： NHX1 gene was cloned from cultivated spinach （Spinacia oleracea L.） and named SpNHX1. Bioinformatics software were used to analyze the obtained gene nucleotide sequences and protein sequences encoded. The results showed that SpNHX1 belonged to the Vac subfamily， with a sequence length of 6 090 bp， an open reading frame of 1 662 bp， and 553 amino acid residues encoded. The bioinformatics analysis of SpNHX1 was carried out by using relevant software or online tools. The results showed that the molecular formula of its coding protein was C2 818H4 363N697O772S25， which was a stable hydrophobic protein. Evolutionary tree analysis shows that SpNHX1 is closely related to AtNHX1 and AtNHX2 proteins of Arabidopsis thaliana， which belong to proteins located on vacuolar membranes. SpNHX1 protein is closely related to NHX proteins of dicotyledons.

Key words： Spinacia oleracea L.; salt tolerance; SpNHX1; gene cloning; bioinformatic analysis

土壤鹽漬化作為一個(gè)普遍的環(huán)境問題，已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的世界性難題。大多數(shù)作物對(duì)土壤中高濃度鹽含量很敏感[1]。鹽的壓力主要是由Na+引起的，高鹽脅迫對(duì)植物的危害主要是由高濃度的Na+積累所導(dǎo)致的。雖然不同植物的耐鹽機(jī)制存在差異，但是其基本策略都是保持胞內(nèi)Na+的平衡[1]。研究顯示，植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Vacuolar Na+/H+ antiporter）在植物抗鹽堿的過程中起著至關(guān)重要的作用[2-5]，它可以將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+區(qū)域化在液泡中，從而使得胞內(nèi)的Na+處于相對(duì)平衡狀態(tài)，以此來使植物更好地適應(yīng)鹽漬生活。除了離子毒性，滲透壓和K+/Na+離子不平衡會(huì)導(dǎo)致代謝異常，比如抑制胞質(zhì)酶活性[6]。為了提高鹽堿地的開發(fā)利用，研究者一直致力于開發(fā)出相關(guān)的抗鹽堿基因。隨著對(duì)擬南芥、水稻等植物的抗鹽堿分子機(jī)理研究的深入，這些植物中的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因被克隆出來，并且其較強(qiáng)的耐鹽能力也得到了證實(shí)[7，8]。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料和試劑

新鮮菠菜（Spinacia oleracea L.）葉片采至山東省蠶業(yè)研究所日光溫室。受體菌株Escherichia coli DH5α購自北京全式金生物工程技術(shù)有限公司。Taq DNA聚合酶、IPTG、X-gal、dNTPs、DNA凝膠回收試劑盒、Peasy-cloning blunt載體等購自北京全式金工程技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購自TaKaRa公司;其他生化試劑和常規(guī)試劑均為超純或分析純。

1.2? 基因完整編碼區(qū)獲取

查找SpinachBase（http：//www.spinachbase.org/cgi

-bin/spinach/index.cgi）獲取二倍體菠菜的NHX1編碼區(qū)序列，在SpinachBase中的ID是Spo20154。

1.3? 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)序列，利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過PCR引物篩選確定最終引物。SpNHX1正向引物序列為5′-ATGTGGTCGCAGTTAAGCTCTT-3′，反向引物序列為5′-TTATGTTGCTCTGTCTGGCATG

-3′。

1.4? 菠菜基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、克隆測序與序列比對(duì)

取菠菜幼苗新鮮葉片，用CTAB法提取基因組DNA。以菠菜基因組DNA為模板，以上述合成的引物進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增。采用50 μL反應(yīng)體系，組成為10×PCR緩沖液（不含Mg2+）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）5 μL，dNTP混合物（10 mmol/L each）1 μL，上、下游引物（均為20 μmol/L）各1 μL，菠菜基因組DNA（80 ng/μL）2 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，無菌ddH2O 34.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35輪循環(huán);72 ℃延伸10 min。電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶，用柱式DNA膠回收試劑盒純化。

1.5? 菠菜NHX1基因的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)菠菜NHX1進(jìn)行分析，用Protparam[9]分析NHX1編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì);在NCBI[10]對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。所用主要分析軟件的網(wǎng)址為Protparam：https：//web.expasy.org/protparam/;NCBI：

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi。

利用MEGA 7.0軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 栽培種小葉菠菜NHX1基因全長及編碼區(qū)序列的克隆及基因結(jié)構(gòu)分析

以山東小葉菠菜基因組DNA為模板，使用設(shè)計(jì)出的SpNHX1引物，經(jīng)PCR各擴(kuò)增出1條6 kb和1.6 kb左右的片段（圖1）。通過測序分析獲得SpNHX1基因全長及編碼區(qū)序列信息。經(jīng)分析，克隆得到的SpNHX1序列長度為 6 090 bp，開放閱讀框?yàn)? 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸殘基。對(duì)菠菜SpNHX1基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因具有14個(gè)外顯子區(qū)域（圖2）。

2.2? 菠菜SpNHX1基因編碼的氨基酸序列分析

在NCBI對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果如圖3所示，NhaP結(jié)構(gòu)域是Na+/H+和K+/H+無機(jī)離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;Na_H_Exchanger是Na+/H+交換體家族。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是維持細(xì)胞所需物質(zhì)交換的最適pH最關(guān)鍵的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其分子機(jī)理目前還不太清楚。這些逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氨基末端含有10～12個(gè)跨膜區(qū)域，在羧基末端有一個(gè)大的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。M3～M12跨膜區(qū)域與家族其他成員是一樣的。M6和M7區(qū)域是高度保守的。所以，推測這些區(qū)域參與了Na+和H+的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3? 菠菜SpNHX1的生物信息學(xué)分析

2.3.1? 菠菜SpNHX1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)? 用ProtParam分析軟件對(duì)菠菜SpNHX1編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，推測該蛋白的分子式為C2 818H4 363N697O772S25，分子質(zhì)量為61.2 ku，等電點(diǎn)為6.76;理論推導(dǎo)其半衰期分別為30 h（體外，哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)）、>20 h（體內(nèi)，酵母細(xì)胞內(nèi)）、>10 h（體內(nèi)，大腸桿菌）。不穩(wěn)定參數(shù)是31.75，屬于穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的氨基酸如圖4所示，含Leu（L）最多，占13.60%;不含Pyl（O）、Sec（U）;總的帶正電殘基（Arg+Lys）為36，負(fù)電殘基（Asp+Glu）為38;總的親水性平均系數(shù)為0.493，預(yù)測該蛋白屬于疏水性蛋白。

2.3.2? 菠菜SpNHX1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析? 對(duì)SpNHX1基因編碼氨基酸序列與楊樹、擬南芥、苜蓿、大豆、水稻以及玉米NHX基因家族的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖5所示。菠菜SpNHX1蛋白與擬南芥的AtNHX1、AtNHX2蛋白進(jìn)化關(guān)系較近。NHX主要分為兩大類，一類是定位于液泡膜上的蛋白，如AtNHX1、AtNHX2等;另一類是定位于質(zhì)膜上的蛋白，如AtNHX5、AtNHX6，因此SpNHX1蛋白歸屬于液泡膜蛋白。同時(shí)定位到液泡膜上的蛋白又分為單子葉與雙子葉兩類，說明單子葉植物和雙子葉植物的NHX在進(jìn)化上存在差異，其中SpNHX1蛋白與雙子葉植物的NHX蛋白親緣關(guān)系較近。

3? 小結(jié)與討論

隨著土壤鹽漬化的加重，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)植物抵抗外界鹽漬環(huán)境具有非常重要的意義。本試驗(yàn)從菠菜基因組中得到了編碼液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的SpNHX1基因，對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，SpNHX1蛋白具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，具有NhaP結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域是Na+/H+和K+/H+無機(jī)離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，SpNHX1蛋白屬于液泡膜型NHX，而且與雙子葉植物聚為一類，表明單子葉植物與雙子葉植物NHX在進(jìn)化上可能存在著一定差異，有待于進(jìn)一步探討菠菜的耐鹽機(jī)制。

目前，隨著土壤鹽漬化問題的日益加重，依靠分子生物學(xué)手段來克隆相關(guān)耐鹽基因并將其轉(zhuǎn)移到非抗鹽作物中，以培育出耐鹽轉(zhuǎn)基因新品種顯得尤為重要，這不僅可以在一定程度上開發(fā)利用鹽堿土地，而且對(duì)于提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有非常重要的意義。

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