響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌ＣＹ３０發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

劉芳 廖先清 周榮華 陳偉 饒犇 黃大野

摘要：為了對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CY30的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化以提高芽孢產(chǎn)量，應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計法對影響貝萊斯芽孢桿菌CY30芽孢形成的關(guān)鍵因子進(jìn)行篩選，通過最陡爬坡路徑法確定主要影響因素的響應(yīng)中心點(diǎn)，并進(jìn)一步采用中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)培養(yǎng)基。結(jié)果表明，該菌株芽孢產(chǎn)量的關(guān)鍵影響因素為甘薯粉和酵母膏的濃度。通過響應(yīng)面分析法的擬合和推算得到，甘薯粉和酵母膏濃度分別為37.35 g/L和15.29 g/L時，模型預(yù)測發(fā)酵最佳產(chǎn)量為91.2億CFU/mL，驗證值為97.5億CFU/mL，預(yù)測值與驗證值之間吻合較好，比優(yōu)化前實(shí)際產(chǎn)量（63.8億CFU/mL）提高了53%。

關(guān)鍵詞：貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CY30;發(fā)酵培養(yǎng)基;優(yōu)化;芽孢數(shù);響應(yīng)面法

中圖分類號：Q939.92? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0091-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.021? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on optimization of fermentation medium of Bacillus velezensis CY30

by using response-surface method

LIU Fang，LIAO Xian-qing，ZHOU Rong-hua，CHEN Wei，RAO Ben，HUANG Da-ye

（Hubei Biopesticide Engineering Research Centre，Wuhan 430064，China）

Abstract： To optimize the fermentation medium of Bacillus velezensis CY30 for enhancing the spore counts in the fermentation broth， the key factors among the media components were investigated by using Plackett-Burman（PB） design. The central axises of these factors were determined by using steepest-ascent method. The optimized medium for Bacillus velezensis CY30 was determined by central combination design and response surface method. The results demonstrated that the key factors influcening the spore counts in fermentation broth were sweet potato powder and yeast extract. The optimized medium was obtained through response surface analysis was 37.52 g/L of sweet potato powder， 15.29 g/L of yeast extract. The estimated maximum spore counts was 9.12 billion CFU/mL， while the real spore counts was 9.75 billion CFU/mL in shake-flask fermentation. The spore counts of the fermentation broth with optimized medium was 53% higher than that before the optimization（6.38 billion CFU/mL）.

Key words： Bacillus vezelensis CY30; fermentation medium; optimization; spore count; response-surface method

芽孢桿菌（Bacillus）廣泛存在于自然界，是重要的農(nóng)作物病蟲害生物防治因子，并廣泛開發(fā)為活體微生物農(nóng)藥，用于農(nóng)作物病蟲害的防治[1]。作為芽孢桿菌屬中的一種，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）最早由Ruiz-Garcia等[2]從采自西班牙貝萊斯河的水樣中分離獲得，可產(chǎn)生表面活性劑。后續(xù)研究者從不同的生態(tài)環(huán)境中分離到貝萊斯芽孢桿菌，并發(fā)現(xiàn)其對多種植物病原真菌、黃單胞菌及馬鈴薯瘡痂病菌等具有抑菌活性[3]。貝萊斯芽孢桿菌還可用作絮凝劑、食品發(fā)酵劑，并用于表面活性劑的生產(chǎn)[3]。筆者所在研究團(tuán)隊在前期的研究中從茶樹根際土壤中分離到貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株，其對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，并對茶輪斑病具有一定的防效，表明其具有一定的開發(fā)價值。通過對貝萊斯芽孢桿菌CY30發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，提升該菌株的發(fā)酵水平，可加快該菌株的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

不同的微生物對營養(yǎng)的需求各不相同，在微生物工業(yè)化生產(chǎn)之前，必須要對其發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法種類眾多，其中以響應(yīng)面法能夠快速有效地確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件。本研究以自主分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株為研究對象，對其培養(yǎng)基配方進(jìn)行Plackett-Burman試驗，篩選顯著的影響因子，然后通過中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析，獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組合，以期為該菌株的擴(kuò)大生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供支撐。

1? 材料與方法

1.1? 供試菌株

貝萊斯芽孢桿菌CY30菌株由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣茶園根際土壤分離得到并保存于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M2018710。

1.2? 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基的組成：①LB瓊脂培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，pH 7.0。②種子培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL。③初始發(fā)酵培養(yǎng)基。淀粉15 g，豆粕20 g，碳酸鈣1.0 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀0.1 g， 去離子水1 L，pH 7.5，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

1.3? 搖瓶培養(yǎng)

斜面菌種30 ℃活化后接種一環(huán)入LB液體培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)16 h，按2%（V/V）接種量再接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時停止。

1.4? 芽孢數(shù)的測定

培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液芽孢數(shù)采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定，稀釋液涂布LB平板前置于80 ℃水浴20 min。

1.5? 試驗方法

1.5.1? Plackett-Burman設(shè)計? 采用Minitab的Plackett-Burman兩水平法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，篩選影響生物量和芽孢產(chǎn)量的重要因素，確定最佳配方。

1.5.2? 最陡爬坡試驗? 根據(jù)Plackett-Burman試驗得出的擬合方程安排最陡爬坡試驗來確定因素取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長，另外步長確定亦與試驗條件相關(guān)。

1.5.3? 中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析? 對Plackett-Burman試驗確定的因素以最陡爬坡試驗得到的中心點(diǎn)，根據(jù)中心組合設(shè)計原理安排響應(yīng)面試驗獲得重要因素的最佳配方水平。根據(jù)中心組合設(shè)計結(jié)果來擬合數(shù)據(jù)，得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

式中，Y是產(chǎn)物能力測量值，X為因素，b0是截距，bi、bj是關(guān)鍵因素i、j線性效果的系數(shù)，bii是關(guān)鍵因素的二次效應(yīng)的系數(shù)，bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)。

根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應(yīng)面圖和等高線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時利用擬合的數(shù)學(xué)方程求解最優(yōu)結(jié)果。

1.5.4? 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的驗證試驗? 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)。

1.5.5? 200 L罐發(fā)酵? 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，投料體積120 L，消泡劑0.2%，滅菌前pH 7.5，1×105 Pa滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入1%（V/V）的種子液，通氣比1∶（0.5～1.2），罐壓0.5×105 Pa，培養(yǎng)溫度30～32 ℃，攪拌常開。發(fā)酵過程中取樣鏡檢，芽孢脫落分離20%時結(jié)束發(fā)酵，發(fā)酵液在5 000 r/min條離心10 min，棄部分上清液，得到3倍濃縮液，濃縮液真空冷凍干燥得到凍干粉，測定發(fā)酵液和凍干粉的芽孢數(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，確定以甘薯粉為碳源（X1），以花生粕（X2）、酵母膏（X3）、工業(yè)蛋白胨（X4）為氮源，共4種因素一起進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計試驗，設(shè)計方案和試驗結(jié)果見表1。

由檢驗結(jié)果（表2）t可知，甘薯粉和酵母膏對CY30的生長和芽孢形成有顯著影響，可信度在90.70%以上，且兩者對芽孢形成的影響是正效應(yīng)。

由表2得到的回歸方程如下：

Y=60.650+11.117X1-1.983X2+5.850X3+0.483X4

方程擬合的相關(guān)性R2=96.74%，表明此方程能很好地模擬和解釋Plackett-Burman的試驗結(jié)果。

2.2? 最速爬坡試驗

找到對產(chǎn)物發(fā)酵影響最大的因素后，需要進(jìn)一步地對這些因素進(jìn)行分析。最常用的分析方法就是響應(yīng)面分析，但該方法是一種局部的分析方法，是在一定范圍內(nèi)根據(jù)試驗求得最優(yōu)解。所以在進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗前首先應(yīng)當(dāng)通過試驗找到最優(yōu)值附近的區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)再進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

利用最速上升法試驗可以實(shí)現(xiàn)這樣的目的，最速上升法以前述Plackett-Burman設(shè)計試驗得到的一次方程為基礎(chǔ)，以相應(yīng)因素的系數(shù)比為基準(zhǔn)進(jìn)行步移，直到步移至最高點(diǎn)，然后以最高點(diǎn)附近的范圍作為響應(yīng)面優(yōu)化的相應(yīng)范圍。從Plackett-Burman設(shè)計試驗所得方程中甘薯粉和酵母膏的系數(shù)（X1為11.117，X3為5.850）可算得這兩個因素步移的步長比為1∶0.526，即當(dāng)甘薯粉步移1個單位（5 g/L）時，酵母膏步移0.526個單位（2.63 g/L）。以Plackett-Burman設(shè)計中的中心點(diǎn)（甘薯粉為25 g/L;酵母膏為10.00 g/L）作為步移的起點(diǎn)，試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示。由表3可知，開始時CY30芽孢產(chǎn)量隨著甘薯粉與酵母膏的升高而增加，在步移進(jìn)行至第三步時達(dá)到最高點(diǎn)，之后CY30芽孢產(chǎn)量開始下降。步移最高點(diǎn)時甘薯粉與酵母膏的濃度分別為35 g/L和15.26 g/L，這一點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

2.3? 中心組合設(shè)計試驗及響應(yīng)面分析

由Plackett-Burman試驗可知，影響CY30芽孢產(chǎn)量的兩個重要因素分別是甘薯粉與酵母膏。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，設(shè)計了2因素5水平的響應(yīng)面分析（RSA），試驗設(shè)計見表4，共13組試驗。

以甘薯粉和酵母膏為自變量，以CY30菌株產(chǎn)生的芽孢數(shù)（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項式回歸方程為：

Y=-84.660+4.817X1+2.842X2-1.455X12+2.120

X22-3.025X1X2

利用Minitab軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，考察所擬合響應(yīng)面的形狀，得到各響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖，見圖1和圖2。由圖及軟件分析可知該模型具有最大值，利用Minitab軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計算可得，最大值處X1=37.35 g/L，X2=15.29 g/L，在此條件下理論預(yù)測得到CY30菌株產(chǎn)生的芽孢數(shù)為91.2億CFU/mL。

2.4? 最佳培養(yǎng)基的驗證

為了確定試驗結(jié)果的可靠性，對上述優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行了驗證試驗，共做3組平行試驗，CY30芽孢桿菌的芽孢數(shù)為97.5億CFU/mL，與預(yù)測值十分接近，比優(yōu)化前實(shí)際產(chǎn)量（63.8億CFU/mL）提高了53%。

2.5? 200 L罐發(fā)酵

發(fā)酵周期36 h，發(fā)酵28 h時取樣鏡檢，芽孢形成率為98%，菌體大小整齊;放罐時取樣鏡檢，約20%芽孢脫落，芽孢整齊。發(fā)酵液芽孢數(shù)為120億CFU/mL，較搖瓶發(fā)酵提升了30%以上。利用200 L發(fā)酵罐發(fā)酵液制備的凍干菌粉的芽孢數(shù)為31.2億CFU/g。

3? 討論

芽孢數(shù)是芽孢桿菌生防菌劑的一個重要質(zhì)量指標(biāo)，而芽孢的產(chǎn)生受到培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件的影響。本研究表明，影響芽孢桿菌 CY30菌株產(chǎn)生芽孢的關(guān)鍵因素為甘薯粉與酵母膏，通過優(yōu)化獲得CY30菌株最佳培養(yǎng)基配方為甘薯粉37.35 g/L、花生粕15.00 g/L、酵母膏15.29 g/L、工業(yè)蛋白胨15.00 g/L、碳酸鈣1.00 g/L、硫酸鎂0.30 g/L、磷酸二氫鉀0.10 g/L、pH 7.5。甄新武等[4]的研究表明，芽孢桿菌Z-27菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基為玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、 MnSO4·H2O 0.07%，在最適條件下的發(fā)酵水平約為20億芽孢/mL。李姝江等[5]通過優(yōu)化獲得了芽孢桿菌 ZJ-20菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，在最適條件下的發(fā)酵水平為7.69×109芽孢/mL。楊可等[6]利用響應(yīng)面法對芽孢桿菌TCS001菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了優(yōu)化培養(yǎng)基組成為蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖12.5 g/L、牛肉浸膏4.0 g/L、酵母粉1.0 g/L，大幅提升了發(fā)酵液對黃瓜灰霉病菌病斑的抑制率。本研究所得培養(yǎng)基組成與他們的研究存在明顯的差異，表明不同來源的芽孢桿菌菌株的營養(yǎng)需求不相同，而且發(fā)酵水平也存在較大差異。

對植物病原菌具有拮抗活性的芽孢桿菌菌株通過產(chǎn)生脂肽[7]、揮發(fā)性抑菌物質(zhì)[8]、葡聚酶[9]或抑菌蛋白[10]等來抑制病原菌的生長。本研究僅針對芽孢數(shù)來對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得了高產(chǎn)芽孢的培養(yǎng)基優(yōu)化配方。但培養(yǎng)條件，包括轉(zhuǎn)速、溶氧、pH及發(fā)酵溫度對芽孢的形成及抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生影響也較大。下一步還要結(jié)合CY30菌株所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件作進(jìn)一步的優(yōu)化，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王? 春，汪? 琨，崔志峰.芽孢桿菌活體微生物農(nóng)藥研究現(xiàn)狀及應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（7）：830-834.

[2] RUIZ-GARCIA C，BEJAR V，MATINEZ-CHECA F，et al. Bacillus velezensis sp. nov.，a surfactant-producing bacterium isolated from the river Velez in Malaga，southern Spain[J].Intl J Syst Evol Microbiol，2005，55（1）：191-195.

[3] 張彩文，程? 坤，張? 欣，等.貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）分類學(xué)及功能研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（17）：258-265.

[4] 甄新武，喬均儉.BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合正交試驗法優(yōu)化Bacillus? velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（3）：3109-3112.

[5] 李姝江，王淋敏，譙天敏，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌ZJ20發(fā)酵參數(shù)[J].西北農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2019，47（2）：1-9.

[6] 楊? 可，司? 文，林? 海，等.利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化貝萊斯芽孢桿菌TCS001的發(fā)酵條件[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2019，21（4）：444-452.

[7] LUO C，CHEN Y，LIU X，et al. Engineered biosynthesis of cyclic lipopeptide locillomycins in surrogate hot Bacillus velezensis FZB42 and derivative strains enhance antibacterial activity[J].Appl Microbiol Biotechnol，2019，103（11）：4467-4481.

[8] LIM S M，YOON M Y，CHOI G J，et al. Diffusible and volatile antifungal compounds produced by an antagonistic Bacillus velezensis G341 against various phytopathogenic fungi[J].Plant Pathol J，2017，33（5）：488-498.

[9] XU T，ZHU T H，LI S J. β-1，3-1，4-glucanase from Bacillus velezensis ZJ20 exerts antifungal effect on plant pathogenic fungi[J].World J Microbiol Biotechno，2016，32（2）：26-34.

[10] 楊勝清，張? 帆，馬貴龍.貝萊斯芽孢桿菌S6拮抗物質(zhì)分離純化及抑菌機(jī)理[J].農(nóng)藥，2017，56（9）：645-649.