將分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入高等農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”本科課程教學(xué)的建議——以熒光原位雜交技術(shù)為例

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

“遺傳學(xué)”課程是高等農(nóng)林院校生物科學(xué)、生物技術(shù)、林學(xué)、草業(yè)科學(xué)、園藝以及自然保護(hù)區(qū)等專業(yè)的核心主干課程之一，是一門重要的專業(yè)必修課程。隨著分子遺傳學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展與進(jìn)步，基因工程、基因組學(xué)以及基因的表達(dá)與調(diào)控等內(nèi)容均已寫入高等農(nóng)林院校本科專業(yè)的“遺傳學(xué)”課程教材中，有實(shí)驗(yàn)條件的高校也已將基因工程、DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，唯獨(dú)缺少從細(xì)胞遺傳學(xué)過渡到分子遺傳學(xué)的連接橋梁和紐帶的分子細(xì)胞遺傳學(xué)。這種相對(duì)有缺陷的課程教學(xué)內(nèi)容體系，不僅影響“遺傳學(xué)”課程知識(shí)體系的構(gòu)建，也不利于推動(dòng)分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的進(jìn)步。其中，以熒光原位雜交(FISH)為代表的分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在染色體精準(zhǔn)識(shí)別、染色體作圖、染色體畸變、物種進(jìn)化以及功能基因定位等方面發(fā)揮了重要作用。因此，將分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入本科生“遺傳學(xué)”課程教學(xué)中就顯得非常必要。

一、分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容長(zhǎng)期未納入高等農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”本科課程教學(xué)的原因

細(xì)胞遺傳學(xué)是“遺傳學(xué)”課程與細(xì)胞學(xué)有機(jī)結(jié)合而建立的一門遺傳學(xué)分支科學(xué)，是從細(xì)胞學(xué)的角度，特別是從染色體的結(jié)構(gòu)和功能、染色體與其他細(xì)胞的相互關(guān)系來研究生物遺傳變異規(guī)律的科學(xué)。而分子細(xì)胞遺傳學(xué)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)與細(xì)胞遺傳學(xué)相結(jié)合而建立的另一門遺傳學(xué)分支科學(xué)，其主要在分子層面上進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究。與經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)相比，分子細(xì)胞遺傳學(xué)的研究范圍更為廣泛，涵蓋了染色體生物學(xué)的各方面內(nèi)容以及分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

目前，分子細(xì)胞遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域主要包括染色體與細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能、基因組變異、基因表達(dá)和進(jìn)化、染色體畸變以及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和腫瘤遺傳學(xué)中的基因組變異等。通過分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究，可以將看不見摸不著的抽象基因定位在染色體上，從而實(shí)現(xiàn)染色體物理圖譜的繪制。自20世紀(jì)80年代以來，盡管分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)取得了飛速發(fā)展，但有關(guān)分子細(xì)胞遺傳學(xué)的內(nèi)容一直未寫入高等農(nóng)林院校本科生的“遺傳學(xué)”課程教材中。究其原因，筆者認(rèn)為主要與當(dāng)時(shí)分子細(xì)胞遺傳學(xué)的相關(guān)理論和技術(shù)難題未攻克有關(guān)。

(一)分子細(xì)胞遺傳學(xué)缺乏相對(duì)獨(dú)立的理論體系

原位雜交是分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的核心技術(shù)和手段，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間互補(bǔ)堿基序列，將有放射性或非放射性標(biāo)記的外源核酸單鏈(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或核糖核酸(RNA)單鏈進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。從上述定義可以看出，核酸原位雜交最基本的原理是利用核酸鏈間的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，即分子遺傳學(xué)中的查爾格佛(E.Chargaff)定則。因此，諸多學(xué)者對(duì)分子細(xì)胞遺傳學(xué)的地位提出了質(zhì)疑，甚至有的學(xué)者認(rèn)為因其缺乏相對(duì)獨(dú)立的理論體系，分子細(xì)胞遺傳學(xué)不能稱為遺傳學(xué)的一門分支科學(xué)，原位雜交亦僅僅是一項(xiàng)技術(shù)而已。

(二)原位雜交技術(shù)作為分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的核心技術(shù)存在局限性

原位雜交技術(shù)的起源可追溯到20世紀(jì)60年代末期，Gall等[1]以攜帶放射性標(biāo)記的非洲爪蟾核糖體基因?yàn)樘结?，與其卵母細(xì)胞染色體進(jìn)行雜交，首次實(shí)現(xiàn)了核糖體基因的染色體定位，標(biāo)志著放射性原位雜交技術(shù)的誕生。由于放射性標(biāo)記存在安全隱患，危險(xiǎn)性大，Rayburn等[2]以更為安全的生物素取代放射性同位素進(jìn)行探針標(biāo)記，與小麥體細(xì)胞染色體進(jìn)行雜交，獲得了小麥特異DNA序列在染色體上的準(zhǔn)確位置。生物素?zé)晒鈽?biāo)記探針取代放射性同位素標(biāo)記探針成功應(yīng)用于原位雜交，促進(jìn)了熒光原位雜交技術(shù)(FISH)的快速發(fā)展[3]。

20世紀(jì)80年代，熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期。由于研究目的多樣化，研究人員對(duì)熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行改良，產(chǎn)生了一系列改良型熒光原位雜交技術(shù)。Durnam等[4]以核基因組為探針進(jìn)行原位雜交，辨別體細(xì)胞內(nèi)異源染色體，發(fā)展了基因組原位雜交(GISH)技術(shù)。Nederlof等[5]利用不同的熒光素標(biāo)記探針，同時(shí)定位了不同探針靶序列在染色體上的分布，建立了多色熒光原位雜交體系(M-FISH)。但由于中期染色體高度凝縮，致使高分辨率染色體物理圖譜的構(gòu)建幾無可能。為了克服中期染色體高度凝縮這一缺陷，促使以間期細(xì)胞為研究對(duì)象的纖維熒光原位雜交技術(shù)(Fiber-FISH)的產(chǎn)生，顯著提高了染色體圖譜的分辨率[6]。21世紀(jì)初，隨著人工合成染色體技術(shù)的興起，使植物單條染色體作圖成為可能。Lysak等[7]以人工合成細(xì)菌單條染色體為探針，與擬南芥染色體進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)展了細(xì)菌人工染色體熒光原位雜交(BAC-FISH)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了植物單條染色體作圖。

近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，部分植物種，如擬南芥、水稻、楊樹以及葡萄等物種基因組測(cè)序工作的完成，科學(xué)家可以根據(jù)物種的單條染色體序列，將染色體DNA序列設(shè)計(jì)為覆蓋整條染色體的寡核苷酸短鏈，通過PCR擴(kuò)增后，制備成寡核苷酸(Oligos)探針，與染色體進(jìn)行雜交，從而獲得高分辨率的染色體圖譜。Han等[8]首次利用該技術(shù)對(duì)黃瓜的3號(hào)和7號(hào)染色體進(jìn)行了作圖研究。該方法最大的優(yōu)勢(shì)就是可以根據(jù)研究需要，對(duì)任何染色體或片段進(jìn)行人工設(shè)計(jì)，缺點(diǎn)是受制于是否有基因組序列。

綜上所述，盡管原位雜交技術(shù)取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但其不同發(fā)展階段的技術(shù)自身存在一定的局限性，故此農(nóng)林高等院校在確定“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容時(shí)只能選擇放棄。

二、分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入高等農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”本科課程教學(xué)的必要性

目前，隨著熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展，植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究取得了突破性進(jìn)展。但由于染色體形態(tài)差異，導(dǎo)致小染色體物種難以開展分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究，因此部分植物種的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究不能代表植物細(xì)胞遺傳學(xué)的全部。盡管如此，筆者仍然認(rèn)為有必要盡快將分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入到高等農(nóng)林院校相關(guān)專業(yè)的“遺傳學(xué)”課程教學(xué)中。

(一)納入分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容是遺傳學(xué)構(gòu)建完整知識(shí)體系的客觀需要

我國(guó)高等農(nóng)林院校現(xiàn)行《遺傳學(xué)》教材，大多包括遺傳的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)、遺傳物質(zhì)的分子基礎(chǔ)、孟德爾遺傳、連鎖遺傳和性連鎖、基因突變、染色體畸變、數(shù)量性狀的遺傳、細(xì)菌和病毒的遺傳、細(xì)胞質(zhì)遺傳、基因工程、基因組學(xué)、基因的表達(dá)與調(diào)控、遺傳與發(fā)育、群體遺傳與進(jìn)化等內(nèi)容[9]，唯獨(dú)缺少分子細(xì)胞遺傳學(xué)的內(nèi)容。這種不完整的“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容，顯然不利于學(xué)生系統(tǒng)地學(xué)習(xí)遺傳學(xué)知識(shí)。因此，以熒光原位雜交技術(shù)為核心的分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容不應(yīng)被忽視，而應(yīng)納入到高等農(nóng)林院校本科生的“遺傳學(xué)”課程教學(xué)中，這有助于學(xué)生構(gòu)建完整的遺傳學(xué)知識(shí)體系，促進(jìn)遺傳學(xué)的發(fā)展。

(二)分子細(xì)胞遺傳學(xué)在遺傳學(xué)研究中具有舉足輕重的地位

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體，攜帶有控制生物性狀發(fā)育所需要的全部基因。因此，精確識(shí)別每一條染色體，獲得精準(zhǔn)的核型分析圖是開展染色體生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的染色體制片和核型分析技術(shù)促進(jìn)了染色體生物學(xué)的快速發(fā)展。但這些傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)均存在一定的局限性，導(dǎo)致從形態(tài)上難以準(zhǔn)確區(qū)分每一條染色體，特別是對(duì)于染色體小且數(shù)目多的物種而言，這種局限性猶為明顯。熒光原位雜交技術(shù)是在傳統(tǒng)染色體技術(shù)上發(fā)展起來的，是傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的拓展與補(bǔ)充，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)技術(shù)的不足。王坤波[10]以基因組DNA和核糖體DNA(rDNA)為探針，利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)棉屬21個(gè)種進(jìn)行了核型分析，并對(duì)4個(gè)四倍體棉花種的親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定。佘朝文[11]將顯帶技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，對(duì)花生進(jìn)行了核型分析，建立了花生的核型公式為：2n=4x=40=38m+2sm(SAT)，核型不對(duì)稱類型屬于2A型。熒光原位雜交技術(shù)在植物中的廣泛應(yīng)用，使其在繼顯帶技術(shù)后，成為核型分析又一重要工具，促進(jìn)了植物細(xì)胞遺傳學(xué)的快速發(fā)展。

1953年，沃森(J.D.Watson)和克里克(F.Crick)提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，標(biāo)志著分子遺傳學(xué)的誕生。基因的概念也從經(jīng)典“孟德爾遺傳因子”發(fā)展至現(xiàn)代遺傳學(xué)的基因概念，即基因是染色體上可轉(zhuǎn)錄一條完整RNA分子，或編碼一條多肽鏈的一段DNA序列。因此，基因既看不見又摸不著，更感覺不到它的存在，顯得十分抽象。利用已知序列的熒光標(biāo)記探針與染色體雜交可確定基因在染色體上的物理位置，從而構(gòu)建染色體物理圖譜。張新新[12]利用熒光原位雜交技術(shù)和原位PCR技術(shù)，將巴西橡膠樹乳膠合成相關(guān)的4個(gè)基因HMGR1、HbRT1、HbCPT、HCPT-3分別定位在3、6、9、10號(hào)染色體上。盡管這種物理圖譜的分辨率相對(duì)偏低，要求兩個(gè)分子標(biāo)記之間至少相距1 000 kb才可以成功定位，但仍然對(duì)于植物的分子輔助育種和比較基因組學(xué)研究有重要意義。張永泰[13]對(duì)蕓薹屬基本種進(jìn)行物理圖譜繪制，并根據(jù)定位信息分析探針序列在植物基因組中的進(jìn)化趨勢(shì)，為種屬間的基因組進(jìn)化關(guān)系研究提供了重要信息。

基因工程是將外源基因?qū)肷锘蚪M中，改良生物性狀的有效技術(shù)和手段。常用的轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法包括PCR檢測(cè)和Southern、Northern以及Western雜交。這些傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法可以從不同水平檢測(cè)目的基因是否整合至核基因組并是否進(jìn)行了性狀表達(dá)，但均不能確定目的基因插入至染色體的具體位置。有關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)化植株性狀遺傳定性與轉(zhuǎn)入目的基因表達(dá)以及插入位置密切相關(guān)。另外，外源基因的插入位置也不是完全隨機(jī)的，其優(yōu)先插入到染色體的遠(yuǎn)端區(qū)[14]。因此，精準(zhǔn)確定目的基因在染色體上的位置顯得尤其重要。由于目的基因序列已知，因此以目的基因?yàn)樘结槪脽晒庠浑s交技術(shù)，不僅可以檢測(cè)外源基因是否導(dǎo)入核基因組，還可以直觀地觀察到外源基因在染色體上的位置[15]。金危危等[16]利用熒光原位雜交技術(shù)成功對(duì)水稻轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)外源基因成功導(dǎo)入核基因組，并將Barnase-ps1基因定位在8個(gè)株系的10條染色體臂上，因此熒光原位雜交技術(shù)可作為轉(zhuǎn)基因生物鑒定的一種既準(zhǔn)確又高效的檢測(cè)方法。熒光原位雜交等分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)在染色體識(shí)別和核型分析、染色體物理圖譜繪制、比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物外源基因鑒定等方面具有重要作用，應(yīng)引起科技工作者的高度重視。

三、將分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”本科課程教學(xué)的實(shí)施建議

基于我國(guó)高等農(nóng)林院?，F(xiàn)行“遺傳學(xué)”課程教材缺少分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容的事實(shí)，筆者就在農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”課程教學(xué)中增加分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容提出如下建議。

首先，將以熒光原位雜交技術(shù)為代表的分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”課程教學(xué)，構(gòu)建涵蓋孟德爾經(jīng)典遺傳學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)、分子細(xì)胞遺傳學(xué)、數(shù)量遺傳學(xué)以及群體遺傳學(xué)等學(xué)科的完整“遺傳學(xué)”課程知識(shí)體系。

其次，優(yōu)化整合“遺傳學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，引入“植物根尖材料的收集、預(yù)處理與固定”“植物根尖細(xì)胞染色體制片”“切口平移法制備45S rDNA分子探針”“植物熒光原位雜交與信號(hào)檢測(cè)”等實(shí)驗(yàn)。

四、將分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”本科課程教學(xué)的意義

筆者將分子細(xì)胞遺傳學(xué)納入“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容后，彌補(bǔ)了《遺傳學(xué)》教材缺少分子細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容的缺憾，豐富了“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容，構(gòu)建了更為完整的遺傳學(xué)知識(shí)體系，促進(jìn)了知識(shí)的融會(huì)貫通，強(qiáng)化了創(chuàng)新意識(shí)，提高了創(chuàng)新能力。

開設(shè)“植物根尖材料的收集、預(yù)處理與固定”“植物根尖細(xì)胞染色體制片”“切口平移法制備45S rDNA分子探針”“植物熒光原位雜交與信號(hào)檢測(cè)”等實(shí)驗(yàn)，不僅優(yōu)化了“遺傳學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)資源，而且還將相對(duì)孤立的實(shí)驗(yàn)整合為一個(gè)整體，使“遺傳學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)既包含了細(xì)胞遺傳學(xué)內(nèi)容又包含了分子遺傳學(xué)內(nèi)容，保證了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的系統(tǒng)性和完整性。

資助項(xiàng)目：北京林業(yè)大學(xué)2018年教改項(xiàng)目“熒光原位雜交納入本科遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索與實(shí)踐”，項(xiàng)目編號(hào)BJFU2018JY045。