Bst DNA聚合酶的純化及等溫?cái)U(kuò)增檢測體系的構(gòu)建

譚擁軍 吳莎莎 譚桂湘 向勤

摘? ?要：Bst DNA 聚合酶是等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵酶，但由于專利限制，目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室所使用的Bst DNA 聚合酶大多需要從國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴且長途運(yùn)輸影響酶活性，因此亟需自主生產(chǎn)出Bst DNA 聚合酶應(yīng)用于等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù). 通過構(gòu)建Bst Fragement的原核表達(dá)質(zhì)粒，采用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)和His-Tag親和純化手段，制備成本低，活性高，特異性強(qiáng)的Bst DNA 聚合酶. 同時(shí)，針對特定的模板，對自制Bst DNA聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，用不同的產(chǎn)物鑒定方法對擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測，并最終篩選出該酶最優(yōu)的擴(kuò)增反應(yīng)條件為60 mM K+、30 mM （NH4）2SO4、pH為 9.0. 最后，驗(yàn)證了Bst DNA聚合酶能用于快速準(zhǔn)確檢測肺炎支原體、肺炎衣原體，降低了相關(guān)病原體核酸檢測的成本，為之后核酸檢測在基層醫(yī)療的更廣泛應(yīng)用提供了條件.

關(guān)鍵詞：Bst DNA 聚合酶;重組蛋白;擴(kuò)增;核酸檢測

中圖分類號：Q784? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Purification of Bst DNA Polymerase and

Construction of Isothermal Amplification Detection System

TAN Yongjun?，WU Shasha，TAN Guixiang，XIANG Qin

（College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：Bst DNA polymerase is a key enzyme in isothermal amplification reaction. However， due to the patent restrictions， most of the Bst DNA polymerase used in domestic laboratories need to be imported abroad， which is expensive and needs long distance transportation. Therefore， it is urgent to produce Bst DNA polymerase for isothermal amplification detection technology independently. From constructing a plasmid containing Bst Fragment， Bst DNA polymerase was prepared on a large scale by prokaryotic expression system followed by His-tag affinity purification method. The purified Bst DNA polymerase possessed the advantages such as low cost， high activity， and strong specificity in the isothermal amplification reaction. The activity of Bst DNA polymerase was optimized for specific DNA templates by detecting the products of amplification. At the same time， the optimal amplification reaction conditions of the enzyme were finally selected，which were 60 mM K+，30 mM（NH4）2SO4，and pH 9.0. With reference to the relevant patents， the obtained Bst DNA polymerase was able to detect mycoplasma pneumonia and Chlamydia pneumonia quickly and accurately through isothermal amplification reactions. In

conclusion， a low cost enzyme was provided for isothermal amplification detection of related pathogen DNA， which can be potentially used in the primary medical care.

Key words：Bst DNA polymerase;recombinant proteins;amplification;nucleic acid detection

近年來，核酸擴(kuò)增技術(shù)[1-2]已廣泛應(yīng)用于涉及民生的傳染病的預(yù)防與控制、遺傳疾病診斷等方面，并逐步滲透到食品與環(huán)境微生物的檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域[3-10]. 這種技術(shù)常用的PCR（Polymerase Chain Reaction）方法敏感、準(zhǔn)確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高的檢測費(fèi)用以及對檢測人員較高的技術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及臨床普及應(yīng)用. 與常規(guī)PCR相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可擺脫對大型儀器依賴且價(jià)格相對低廉，更適合被基層所采用[11].

等溫技術(shù)自2000年發(fā)展至今，已有多種類型的等溫?cái)U(kuò)增方法[12-13]，其中以LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）最為常見，LAMP技術(shù)較其他病原檢測方法更敏感、快速、方便，且可通過多種方法使其反應(yīng)結(jié)果可視化[14-16]，而更適用于臨床，將成為最具潛力的易于普及的病原檢測方法. LAMP成功的關(guān)鍵因素之一是DNA聚合酶. 根據(jù)氨基酸序列與三維結(jié)構(gòu)的不同，DNA聚合酶可分為6個(gè)不同的家族[17-19]. 其中，Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶是來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶的一部分，具有5′—3′DNA 聚合酶活性，但不具有5′—3′外切核酸酶活性[20]. 與其他DNA 聚合酶相比，Bst DNA 聚合酶有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、鏈置換活性及聚合酶活性，因此更適用于等溫?cái)U(kuò)增中. 但是，目前市場上Bst DNA 聚合酶受限于國際性大公司如NEB的專利限制，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室所使用的Bst DNA 聚合酶大多需要從國外進(jìn)口，其價(jià)格昂貴且運(yùn)輸時(shí)間長，造成實(shí)驗(yàn)成本提高，又極易影響酶活性，所以自主生產(chǎn)出批量的高效、特異性強(qiáng)的Bst DNA 聚合酶對于等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)在國內(nèi)基層醫(yī)療中的應(yīng)用十分必要. 目前，已有課題組嘗試過提取Bst DNA 聚合酶[21]，但其批量生產(chǎn)、擴(kuò)增特異性及擴(kuò)增體系的建立還需要進(jìn)一步研究優(yōu)化.

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Bst大片段的原核表達(dá)質(zhì)粒，使其在大腸桿菌中表達(dá)，通過蛋白質(zhì)提取及純化手段[22]自主獲得Bst DNA 聚合酶，針對特定引物初步優(yōu)化其擴(kuò)增反應(yīng)條件，最終獲得Bst DNA聚合酶. 并嘗試?yán)脤?shí)驗(yàn)室已提取并處理的肺炎支原體、肺炎衣原體DNA，參照已發(fā)表的專利方法[23-24]，檢測Bst DNA聚合酶是否可以用于快速準(zhǔn)確檢測肺炎支原體和肺炎衣原體.

1? ?材料和方法

1.1? ?菌種和材料

DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，Rostta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，Bst Fragement，pET-15b載體質(zhì)粒，F(xiàn)OXM1 cDNA，293T細(xì)胞.

肺炎衣原體DNA來源：通過PCR擴(kuò)增得到肺炎衣原體基因組保守基因DNA片段，模板來源：湖南圣湘公司贈予的肺炎衣原體ATCC J-21菌株，NCBI Reference Sequence：NC_000922.1，1 501 bp，Chlamydophila pneumoniae CWL029 chromosome complete genome，引物F-CTCTGA GCATAAATCAGAGCCT，R-GGCCGTTTTTCAATGATAAGAGC.

肺炎支原體DNA來源：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)肺炎支原體Mycoplasma pneumoniae M129，通過氯仿抽提法提取基因組DNA.

1.2? ?主要試劑和儀器

蛋白核酸分析儀，Nano Drop，搖床，細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱，質(zhì)粒小提試劑盒，膠回收試劑盒，Nde I，BamH I限制性內(nèi)切酶，PBS，氨芐青霉素（Amp），氯霉素（Chl），IPTG誘導(dǎo)劑，溶菌酶，His-tag親和鎳珠，1 kb DNA Ladder marker，雙色蛋白預(yù)染蛋白marker，過硫酸銨（APS），十二烷基磺酸鈉（SDS），imidazole，TEMED，Na3PO4，NaCl，Tris，Tryptone，Yeast Extract，Agar，Acrylamide，Bis-acrylamide，Agarose，EB染料，濃鹽酸，SYBR Green I染料，考馬斯亮藍(lán)G250，His-Tag抗體（小鼠單抗），anti-mouse（鼠二抗）.

1%瓊脂糖凝膠配制方法：Agarose 2 g、1XTE Buffer 200 mL、EB 9 μL;LB液體培養(yǎng)基配方： Tryptone10 g、 Yeast Extract 5 g、NaCl 10 g，加ddH2O定容至1 L;Binding Buffer配方：20 mM Na3PO4，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 7.5;Elution Buffer配方：20 mM Na3PO4，500 mM NaCl，300 mM imidazole，pH 為7.5;12% SDS-PAGE分離膠配方：ddH2O 2.31mL、30% Acrylamide 2.8 mL、1.5 M Tris-HCl（pH8.8） 1.75 mL、10%SDS 70 μL、10%APS 70 μL、TEMED 3 μL;SDS-PAGE濃縮膠配方：ddH2O 1 mL、30% Acrylamide 0.5 mL、0.5 M Tris-HCl（pH6.8） 0.38 mL、10%SDS 30 μL、10%APS 30 μL、TEMED 3 μL;考馬斯亮藍(lán)染色液配方：考馬斯亮藍(lán)G250為0.25 g、甲醇 45 mL、冰醋酸 10 mL、加dd H2O定容至100 mL;考馬斯亮藍(lán)脫色液配方：甲醇 125 mL、冰醋酸 40 mL、加ddH2O定容至500 mL;1X Transfer Buffer 配方：甘氨酸 1.45 g、 Tris 2.9 g ，甲醇 100 L，加ddH2O定容至500 mL;TBST配制方法：5M NaCl 溶液 30 mL，1M Tris-HCl（pH8.0） 20 mL，Tween 20 0.5 mL，加ddH2O定容至1 L;封閉液配方：脫脂奶粉2.5 g，加TBST定容至50 mL.

1.3? ?實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1? ?重組質(zhì)粒 pET-15b-Bst Fragement plasmid的?構(gòu)建

1）Bst Fragment的獲取. 取一支15 mL 的離心管，加入5 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素濃度為0.1 mg/mL），吸取從公司訂購的宿主菌top10菌液5 μL，置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌14 h，利用質(zhì)粒小提試劑盒從菌液中提取Bst Fragment所在的原始質(zhì)粒pUC-SP，利用Nano Drop測定濃度并通過雙酶切獲得Bst Fragment，酶切體系及反應(yīng)條件為：pUC-SP（150 ng/mL）6μL，Nde I限制性內(nèi)切酶1 μL，BamH I限制性內(nèi)切酶1 μL，10XFast Digest Buffer 2 μL，加ddH2O至總體積20 μL，37 ℃水浴120 min后，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，收集目的條帶所在膠體并利用膠回收試劑盒獲得Bst Fragment;

2）對載體質(zhì)粒pET-15b進(jìn)行雙酶切. 酶切體系及反應(yīng)條件為：pET-15b質(zhì)粒（150 ng/mL）6 μL，Nde I限制性內(nèi)切酶1 μL，BamH I限制性內(nèi)切酶1 μL，10XFast Digest Buffer 2 μL，加ddH2O至總體積20 μL，37 ℃水浴120 min后，1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，收集目的條帶所在膠體并利用膠回收試劑盒獲得酶切后的pET-15b（Nde I/BamH I）;

3）連接Bst Fragment和pET-15b（Nde I/BamH I）. 連接體系及反應(yīng)條件為：pET-15b（Nde I/BamH I）2 μL，Bst Fragement 6 μL，T4 DNA Ligase（5 U/mL）1μL，10 × T4 DNA Ligase buffer 1 μL，加ddH2O至總體積為10 μL，22 ℃連接過夜，備用.

4）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與鑒定. 取一管DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞（1 001 μL）置于冰上溶解，待感受態(tài)完全溶解后，加入3 μL的連接片段，用拇指輕彈混勻，冰上放置30 min，42 ℃水浴鍋中熱激90 s，冰上放置2 min，加入150 μL LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中37 ℃，以220 r/min 的轉(zhuǎn)速搖菌45 min;短暫離心后，涂布LB平板（氨芐青霉素濃度為0.1 mg/mL），倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜（12～16 h）;次日挑取單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中（氨芐青霉素濃度為0.1 mg/mL），置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌過夜（12～16 h）;次日收集菌體提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Nde I，BamH I進(jìn)行酶切鑒定，測序正確后即獲得了重組質(zhì)粒pET-15b-Bst Fragment plasmid，保存質(zhì)粒與菌種于-80 ℃冰箱. pET-15b-Bst Fragment plasmid結(jié)構(gòu)示意圖（圖1（a））.

1.3.2? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶的表達(dá)

1）Bst DNA聚合酶的表達(dá). 將表達(dá)載體pET-15b-Bst Fragment plasmid轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rostta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板（氨芐青霉素濃度為0.1 mg/mL、氯霉素濃度為0.1 mg/mL），倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜（12～16 h），隨機(jī)挑選一個(gè)單菌落，接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中（氨芐青霉素濃度為0.1 mg/mL、氯霉素濃度為0.1 mg/mL），置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌4～6 h，將菌液加到200 mL的LB液體培養(yǎng)基中（氨芐青霉素濃度為0.1 mg/mL、氯霉素濃度為0.1 mg/mL），置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌過夜（12～16 h），取少量菌液檢測OD600值，并調(diào)整OD600值至0.8～1，取100 mL菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑（終濃度為0.8 mM），剩余100 mL菌液加相同體積的ddH2O，兩者均置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌6 h，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min分別收集菌體，用15 mL Binding Buffer（20 mM Na3PO4，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH為 7.5）重懸菌體，超聲40 min（超6 s，停9 s）破碎菌體，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清于50 mL離心管中，兩者均取少量用于對照（即分別為誘導(dǎo)前蛋白樣品、誘導(dǎo)后蛋白樣品），向誘導(dǎo)后蛋白上清中加入50 μLHis-Tag親和鎳珠，置于4 ℃冰箱中旋轉(zhuǎn)孵育3 h，以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集鎳珠，用PBS洗兩次后，加入500 μL Elution Buffer置于4 ℃冰箱中旋轉(zhuǎn)孵育2 h，以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清，并轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL EP管內(nèi)，即獲得純化后蛋白樣品，樣品測定濃度后保存于-80 ℃冰箱;

2）Western Bloting 檢測蛋白表達(dá). 將空白Rosseta（DE3）蛋白裂解液和導(dǎo)入了Pet-15b-Bst Fragement plasmid的Rosseta（DE3）蛋白裂解液分別取等量進(jìn)行高溫變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電壓為80 V，電泳30 min后調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳90 min，100 V恒壓下轉(zhuǎn)膜1 h，然后在將PDVF膜放入適量封閉液中，確保封閉液可以充分覆蓋PDVF膜，置于水平搖床上室溫孵育2 h，由于重組蛋白帶上了His-tag，所以SDS-PAGE電泳結(jié)束后，用TBST洗膜3次（每次5 min）后，用Anti-His抗體（1 ∶ 1 000）室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次（每次5 min）后，用Anti-mouse抗體（1 ∶ 2 000）室溫孵育2 h，洗膜后進(jìn)行曝光檢測，觀察條帶位置.

3）考馬斯亮藍(lán)染色檢測純化效果. 將誘導(dǎo)前蛋

白樣品、誘導(dǎo)后蛋白樣品及純化后蛋白樣品分別測定濃度后，取等量蛋白量進(jìn)行高溫變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，先電泳80 V，30 min后調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳90 min，切下膠體放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上室溫孵育2 h，至膠體完全染成藍(lán)色，然后將膠體放入脫色液中，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠，置于水平搖床上室溫孵育，期間更換脫色液2～4次，直至完全脫去藍(lán)色背景顏色，結(jié)束后參照Marker觀察蛋白條帶位置及亮度，以判斷誘導(dǎo)效果、純化后蛋白的大小及濃度是否達(dá)到預(yù)期.

1.3.3? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶的純化

根據(jù)上述確認(rèn)的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取菌液加入4瓶500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，每瓶加入50 μL菌液，置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌過夜（12～16 h），取菌液檢測OD600值，調(diào)整OD600值至0.8～1，加入IPTG誘導(dǎo)劑（終濃度0.8 mM），置于搖床中37 ℃，以220 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌6 h，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速，離心20 min收集菌體（分4個(gè)50 mL離心管進(jìn)行離心），每管加入30 mL Binding Buffer（20mM Na3PO4，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 為7.5）重懸菌體，超聲40 min（超6 s，停9 s）破碎菌體，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清于50 mL離心管中，向上清中加入100 μLHis-Tag親和鎳珠，置于4 ℃冰箱中旋轉(zhuǎn)孵育3 h，以800 r/min的轉(zhuǎn)速，離心5 min收集鎳珠，鎳珠用PBS洗兩次后，加入1mL Elution Buffer后置于4 ℃冰箱中旋轉(zhuǎn)孵育2 h，以800 r/min的轉(zhuǎn)速，離心5 min收集上清，轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL EP管內(nèi)，即獲得純化后蛋白樣品，樣品測定濃度后小管分裝保存于-80 ℃冰箱;

1.3.4? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶的活性鑒定

1）重組蛋白Bst DNA聚合酶等溫?cái)U(kuò)增活性鑒定. 取4個(gè)PCR管，編號1～4，按照表2所示體系依次向每管中加入各成分，再按照表3中的實(shí)驗(yàn)設(shè)置向各組中加入余下的成分，其中內(nèi)外引物對序列如表1所示. FOXM1 CDNA濃度為200 pg/μL，每管取1μL，用ddH2O補(bǔ)齊至反應(yīng)體系總體積為20 μL，充分混勻各管，將1～4號管同時(shí)置于65 ℃水浴50 min后，80 ℃水浴2 min終止反應(yīng). 取每管反應(yīng)產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將膠體置于紫外光下觀察并拍照;剩余反應(yīng)產(chǎn)物加入2 μL SYBR Green I染料，混勻并短暫離心，在紫外光照射下觀察每管顏色，以此判定是否擴(kuò)增成功.

2）重組蛋白Bst DNA聚合酶等溫?cái)U(kuò)增條件初步優(yōu)化. 根據(jù)對有關(guān)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的文獻(xiàn)及研究，總結(jié)得出影響等溫?cái)U(kuò)增效果的幾個(gè)關(guān)鍵因素及范圍，據(jù)此分別設(shè)置K+濃度梯度，（NH4）2SO4濃度梯度，不同pH值條件來檢驗(yàn)自制Bst DNA聚合酶的擴(kuò)增效果，以達(dá)到優(yōu)化Bst DNA聚合酶反應(yīng)體系的目的. 除設(shè)置的各個(gè)不同成分梯度外，其他體系成分及實(shí)驗(yàn)條件均與1.3.4節(jié)中1）的描述保持一致，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.3.5? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶檢測特定病原體

1）檢測肺炎支原體. 參考肺炎支原體與肺炎衣

原體的相關(guān)檢測專利[23-24]，將實(shí)驗(yàn)室已有肺炎支原體基因組DNA按10倍遞增稀釋105、104、103、102、10 copies/μL 5個(gè)梯度. 取稀釋后的基因組DNA各1 μL，及表4中對應(yīng)的內(nèi)外引物對，按表2設(shè)計(jì)的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行混合，最后加入Bst DNA聚合酶，將反應(yīng)混合物分別置于65 ℃水浴50 min后，80 ℃水浴2 min終止反應(yīng). 取5 μL LAMP產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，將實(shí)驗(yàn)室保存的幾種不同病原體的基因組DNA分別稀釋到105 copies/μL，各取1 μL，加入擴(kuò)增肺炎支原體DNA的內(nèi)外引物對，按表2設(shè)計(jì)的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行混合，最后加入Bst DNA聚合酶，將反應(yīng)混合物分別置于65 ℃水浴50 min后，80 ℃水浴2 min終止反應(yīng). 取5 μL LAMP產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測.

2）檢測肺炎衣原體. 按上述同樣的方法檢測肺炎衣原體，只需將模板和引物更換成表5中肺炎衣原體基因組DNA和對應(yīng)的內(nèi)外引物對.

2? ?結(jié)? ?果

2.1? ?重組質(zhì)粒pET-15b-Bst Fragment plasmid的構(gòu)建

按照1.3.1節(jié)所描述的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，上端條帶位于2 500 bp與3 000 bp之間，與pUC-SP載體大小相符，下端條帶位于1 500 bp與2 000 bp之間，與Bst Fragment大小吻合，如圖1（b）所示，1、2號樣品（為重復(fù)實(shí)驗(yàn)）均符合結(jié)果. 重組質(zhì)粒pET-15b-Bst Fragment plasmid經(jīng)Nde I，BamH I限制性內(nèi)切酶處理，電泳結(jié)果顯示，上端條帶位于4 000 bp與6 000 bp之間，與pET-15b載體大小相符，下端條帶位于1 500 bp與2 000 bp之間，與Bst Fragment大小吻合，如圖1（c）所示，1～4號樣品（為重復(fù)實(shí)驗(yàn)）均符合結(jié)果，測序結(jié)果顯示送檢序列與Bst Fragement序列比對結(jié)果完全重合，綜上表明重組質(zhì)粒pET-15b-Bst Fragment plasmid構(gòu)建成功.

2.2? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶的表達(dá)與純化

按照1.3.2節(jié)中2）的實(shí)驗(yàn)設(shè)置與方法步驟，將重組質(zhì)粒pET-15b-Bst Fragment plasmid轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌Rostta（DE3）中進(jìn)行蛋白表達(dá)后，用Western Bloting 方法檢測重組蛋白是否正確表達(dá). 如圖2（a）所示（樣品1：導(dǎo)入了pET-15b-Bst Fragement plasmid的Rosseta（DE3）蛋白裂解液;樣品2：空白Rosseta（DE3）蛋白裂解液），樣品1出現(xiàn)清晰條帶，而樣品2無條帶，且條帶大小與Bst DNA聚合酶大小相符，再結(jié)合之前的測序結(jié)果，可以確定重組蛋白表達(dá)正確.

按照1.3.2節(jié)中3）的實(shí)驗(yàn)步驟，將重組質(zhì)粒pET-15b-Bst Fragment plasmid轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌Rostta（DE3）中進(jìn)行蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)，提取并純化Bst DNA聚合酶，優(yōu)化純化條件，最終確定純化方案，考馬斯亮藍(lán)染色確定蛋白條帶的位置及純化效果. 如圖2（b）所示（Lane1：Marker;Lane2：not-induced sample;Lane3： induced sample;Lane4：Purified sample 1;Lane5：Purified sample 2;蛋白上樣量均為10 μg），考染后SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化后的目的蛋白位于50 kD與70 kD之間，與重組蛋白Bst DNA聚合酶的大小（約為67 kD）相符，綜上表明所得的純化后蛋白為Bst DNA聚合酶，之后按照1.3.3節(jié)中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行Bst DNA聚合酶的純化.

2.3? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶的活性鑒定

按照1.3.4節(jié)中1）的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)重組蛋白Bst DNA聚合酶等溫?cái)U(kuò)增活性. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如圖3所示，1、2為陰性擴(kuò)增，3、4為陽性擴(kuò)增，表明純化后的Bst DNA聚合酶具備等溫?cái)U(kuò)增活性.

按照1.3.4節(jié)中2）的實(shí)驗(yàn)步驟初步優(yōu)化擴(kuò)增條件，以提高自制Bst DNA聚合酶用于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的穩(wěn)定性和特異性. 結(jié)果如圖4所示，在60 mM K+、30 mM （NH4）2SO4、pH值為9.0的條件下，自制的Bst DNA 聚合酶的擴(kuò)增活性最優(yōu).

2.4? ?重組蛋白Bst DNA聚合酶檢測病原體

利用實(shí)驗(yàn)室已獲得的肺炎支原體和肺炎衣原體DNA樣本，并利用熒光定量PCR計(jì)算出拷貝數(shù)，參照相關(guān)專利[23-24]，檢測Bst DNA聚合酶是否能用于快速準(zhǔn)確檢測肺炎支原體、肺炎衣原體. 按照1.3.5節(jié)中的實(shí)驗(yàn)方法，圖5（a）（c）顯示，兩種病原體均在102 copies時(shí)就可以用Bst DNA聚合酶擴(kuò)增成功，表明Bst DNA聚合酶檢測到能在低濃度的病原體，具有良好的靈敏度;圖5（b）（d）顯示，在引物一致且特異性好的條件下，只有加入與引物相匹配的的病原體DNA才會出現(xiàn)陽性擴(kuò)增結(jié)果，當(dāng)病原體與體系設(shè)置的引物不匹配時(shí)則不會出現(xiàn)陽性擴(kuò)增結(jié)果，表明利用Bst DNA聚合酶能夠在病原體拷貝數(shù)相對較低（105 copies）的情況下特異性地檢測出病原體DNA，降低了假陽性的風(fēng)險(xiǎn)，表明Bst DNA聚合酶具有良好的特異性.

3? ?結(jié)? ?論

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)經(jīng)過近20年的發(fā)展，已經(jīng)日趨成熟，由于其設(shè)備簡單、操作方便、結(jié)果可視等優(yōu)點(diǎn)正廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測、病原微生物的檢驗(yàn)檢疫，食品檢疫等各個(gè)領(lǐng)域. Bst DNA 聚合酶有著較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、鏈置換活性及聚合酶活性，是等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵工具酶，但由于專利限制，導(dǎo)致其價(jià)格偏高，不利于開展廣泛科研與實(shí)際應(yīng)用. 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Bst Fragment的原核表達(dá)質(zhì)粒，并利用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)和His-Tag親和純化手段，獲得了成本低，活性高，特異性強(qiáng)的Bst DNA 聚合酶. 下一步實(shí)驗(yàn)將嘗試其他純化手段，以進(jìn)一步提高Bst DNA 聚合酶的純度.

肺炎衣原體肺炎、肺炎支原體肺炎的臨床癥狀及X線表現(xiàn)均無特異性，難以和其他非典型肺炎相區(qū)別，故其確診有賴于實(shí)驗(yàn)室診斷. 實(shí)驗(yàn)室檢測方法有很多，包括直接涂片和培養(yǎng)法、免疫熒光直接抗原檢測法、補(bǔ)體結(jié)合抗體檢測、核酸擴(kuò)增檢測法和血清檢測法等，本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室已提取并處理的肺炎支原體、肺炎衣原體DNA，利用已發(fā)表的專利方法，驗(yàn)證了Bst DNA聚合酶可以用于快速準(zhǔn)確檢測肺炎支原體、肺炎衣原體，且靈敏度和特異性俱佳，為肺炎支原體、肺炎衣原體的基層臨床檢測降低了成本，同時(shí)也為等溫核酸檢測技術(shù)在基層醫(yī)療領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供了可能性.

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