黃花石蓮總黃酮超聲輔助提取及抗氧化活性研究*

李瑤佳 王 君 毛 攀 伍仕杰 江文世*

（西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615000）

黃花石蓮 （Sinocrassulaindica var.Luteorubra）屬于石蓮的一個(gè)變種，是景天科（crassulaceae）多年生無毛草本植物。在我國，黃花石蓮主要生長在云南貢山地區(qū)海拔3 300 m～3 700 m的巖石隙中以及四川西南山區(qū)。黃花石蓮中含有黃酮（flavonoids）、黃菲素（flavidin）、D-葡萄糖（D-glucose）、鼠李糖（rhamnose）、L-阿拉伯糖（L-arabinose）等種類繁多的化合物。其葉片可煮湯食用，也可入藥使用，具有滋陰益氣、散瘀消腫、控制血糖等功效。黃酮類化合物是一類具有苯環(huán)和羥基結(jié)構(gòu)化合物的總稱，具有止咳、抑菌、消炎、抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病等方面的作用。黃酮類物質(zhì)易溶于丙酮、水、乙酸乙酯、乙醇等極性較大的溶劑中。植物中的總黃酮通常采用乙醇或丙酮提取。本文以黃花石蓮的葉為原料，采用超聲輔助提取黃花石蓮中總黃酮，研究乙醇、丙酮和丙酮-乙醇作為提取溶劑對(duì)黃花石蓮總黃酮的提取率，并通過正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，測定不同質(zhì)量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液對(duì)1，1-苯基-2-苦肼基（DPPH·）自由基、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，旨在為更好地開發(fā)利用黃花石蓮中黃酮類化合物提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

黃花石蓮采自四川省西昌市禮州鎮(zhèn)；焦性沒食子酸、水楊酸、七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、過氧化氫、鹽酸、冰乙酸、甲醇、無水乙醇、丙酮，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；無水三氯化鋁，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美科技生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），分析純，上海瑞永生物科技有限公司；乙酸鉀、抗壞血酸，分析純，天津市光復(fù)化工研究所；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV 5800PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；KH-250SPV雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HR-04多功能粉碎機(jī)，上海哈瑞斯電器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市英峪華科儀器廠；DHG-9140B智能型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海成順儀器儀表有限公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，河南蘭帆科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃花石蓮樣品制備

黃花石蓮葉→挑選→自來水洗→超純水洗→烘箱干燥→粉碎→過篩→樣品。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

總黃酮含量測定參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T1295-2007的方法。分別吸取0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，加入1 mL 0.1 mol/L的AlCl3溶液和1 mL 1 mol/L的乙酸鉀溶液，用體積濃度70%的甲醇定容至刻度，得到蘆丁質(zhì)量濃度分別為 0 mg/mL、0.021 mg/mL、0.042 mg/mL、0.063 mg/mL、0.084 mg/mL的溶液，靜置30 min，用分光光度計(jì)在419 nm處測定溶液的吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。線性回歸方程為：y=29.61x+0.052；R2=0.999。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 不同溶劑對(duì)黃花石蓮總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取1.000 g黃花石蓮樣品于錐形瓶中，用不同的溶劑（乙醇、丙酮、丙酮-乙醇）提取，提取溶液體積濃度為75%、超聲溫度為50℃、超聲時(shí)間30 min、料液比為1 g∶30 mL，重復(fù)3次，隨帶試劑空白。

1.3.4 丙酮-乙醇對(duì)黃花石蓮中總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取1.000 g黃花石蓮樣品于錐形瓶中，加入一定體積比、體積濃度的丙酮-乙醇混合提取液，在一定時(shí)間和溫度條件下進(jìn)行超聲提取，減壓抽濾，收集濾液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用丙酮-乙醇混合溶液定容至50 mL，重復(fù)3次，隨帶試劑空白?？傸S酮提取率按下列公式計(jì)算：

式中：C——待測溶液的吸光度值帶入回歸方程計(jì)算得到的總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——待測溶液的體積，mL；

D——溶液的稀釋倍數(shù)；

m——樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、丙酮-乙醇體積比、混合提取溶液體積濃度對(duì)黃花石蓮總黃酮提取率的影響。①超聲時(shí)間采用20 min、30 min、40 min、50 min、60 min的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲溫度為50℃、料液比為1 g∶30 mL、丙酮-乙醇體積比為1∶3、混合提取溶液濃度為75%；②超聲溫度采用30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲時(shí)間為30 min、料液比為1 g∶30 mL、丙酮-乙醇體積比為1∶3、混合提取溶液體積濃度為75%；③料液比采用1 g∶30 mL、1 g∶35 mL、1 g∶40 mL、1 g∶45 mL、1 g∶50 mL的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲時(shí)間為30 min、超聲溫度為50℃、丙酮-乙醇體積比為1∶3、混合提取溶液體積濃度為75%；④丙酮-乙醇體積比采用 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲時(shí)間為30 min、超聲溫度為50℃、料液比為1 g∶30 mL、混合提取溶液體積濃度為75%；⑤混合提取溶液體積濃度采用75%、80%、85%、90%、95%的條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲時(shí)間為30 min、超聲溫度為50℃、料液比為1 g∶30 mL、丙酮-乙醇體積比為1∶3。

1.3.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲溫度、料液比、丙酮-乙醇配比、混合溶液濃度，做L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1，并采用方差分析來研究4個(gè)因素對(duì)黃花石蓮總黃酮提取率影響的顯著性水平。

表1 正交優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 黃花石蓮總黃酮抗氧化活性測定

將超聲輔助提取得到的總黃酮提取液分別配置 為 0.059 mg/mL、 0.118 mg/mL、 0.177 mg/mL、0.236 mg/mL、0.295 mg/mL和0.354 mg/mL 6個(gè)不同質(zhì)量濃度，研究其抗氧化能力。

參照文獻(xiàn)的方法測定黃花石蓮總黃酮溶液清除DPPH·的能力。取6支10 mL比色管加入1 mL不同質(zhì)量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液，再分別加入2.5 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混合反應(yīng)30 min，在波長517 nm處用分光光度計(jì)測定吸光度值，記為Di；超純水代替樣品溶液測定的吸光度值，記為Dc；無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液測定的吸光度值，記為Db，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。黃花石蓮中總黃酮對(duì)DPPH·清除率計(jì)算公式為：

1.3.7.2 黃花石蓮中總黃酮清除·OH的測定

參照文獻(xiàn)的方法測定黃花石蓮總黃酮溶液清除·OH的能力。取6支10 mL比色管，加入1 mL不同質(zhì)量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液，再分別加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液各2 mL，用超純水定容至刻度，37℃水浴反應(yīng)30 min，在波長510 nm處用分光光度計(jì)測定吸光度值，記為DX，超純水代替H2O2溶液測定的吸光度值，記為DX0，超純水代替樣品溶液測定的吸光度值，記為D0，同時(shí)，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照。黃花石蓮總黃酮對(duì)·OH清除率計(jì)算公式為：

1.3.7.3 黃花石蓮總黃酮清除O2-·的測定

參照文獻(xiàn)的方法測定黃花石蓮總黃酮溶液清除O2-·的能力。取6支10 mL比色管分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的黃花石蓮總黃酮提取液、4.5 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH=8.2）混勻，于 25 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，取出后加入25℃預(yù)熱好的鄰苯三酚溶液（3 mmol/L）0.3 mL，以 0.3 mL鹽酸（10 mmol/L）代替作參比，混勻后迅速在波長為325 nm處測定吸光度，每隔30 s測定一次，總共測定5 min。計(jì)算黃花石蓮總黃酮溶液的吸光度隨時(shí)間的變化率，記為Fx；用超純水代替樣品溶液，按同樣方法測定吸光度，計(jì)算空白液的吸光度隨時(shí)間的變化率，記為F0。黃花石蓮總黃酮對(duì)O2-·清除率計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同提取溶劑對(duì)提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，不同提取溶劑對(duì)總黃酮的提取率從大到小依次為丙酮-乙醇＞乙醇＞丙酮，提取率分別為1.207%、1.195%和1.250%。因此，選擇丙酮-乙醇混合溶液作為提取溶劑，來進(jìn)行下一步總黃酮提取率的研究。

表2 不同提取溶劑對(duì)總黃酮提取率的比較（x±s，n=3）

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防災(zāi)減災(zāi)工作對(duì)氣象的依賴程度越高，對(duì)農(nóng)業(yè)氣象工作者服務(wù)準(zhǔn)確度的要求就會(huì)越高。因此，應(yīng)結(jié)合我國實(shí)際來完善我國的氣象預(yù)報(bào)系統(tǒng)，而且基層氣象部門要對(duì)農(nóng)業(yè)氣象工作起到推進(jìn)作用。

試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2可知，超聲時(shí)間在20 min～60 min范圍內(nèi)，黃花石蓮中總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢，在50 min時(shí)，得到最高提取率為1.255%。結(jié)果表明，超聲時(shí)間對(duì)黃花石蓮總黃酮提取率有一定影響。超聲時(shí)間太短，提取液不能充分滲透進(jìn)植物細(xì)胞中將黃酮類化合物提取出來，提取率較低；超聲時(shí)間太長，黃酮類化合物穩(wěn)定性降低以及一些非黃酮類物質(zhì)溶出增加，與黃酮類化合物的溶解形成競爭性抑制，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇最佳超聲時(shí)間為50 min。

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖3可知，超聲溫度在30℃～70℃范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨溫度的升高而增加，在50℃時(shí)，得到最高提取率為1.232%，繼續(xù)升高溫度，總黃酮提取率逐漸下降。這是因?yàn)殡S著溫度升高，分子間的運(yùn)動(dòng)速度加快，黃酮類化合物在提取液中的溶解度逐漸增加，提取率增加。繼續(xù)升高溫度，總黃酮提取率降低，這是由于溫度太高，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞，乙醇和丙酮揮發(fā)，提取液濃度降低，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。因此，選擇40℃、50℃、60℃三個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖4可知，料液比在1g∶30mL～1 g∶50 mL范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨著料液比增大而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1 g∶40 mL時(shí)，繼續(xù)增加料液比，總黃酮提取率趨于穩(wěn)定，料液比為1 g∶50 mL時(shí)總黃酮提取率最大（1.258%）。料液比較低時(shí)，總黃酮不能充分溶解，增加料液比時(shí)可以提高總黃酮的溶出率；當(dāng)料液比過大時(shí)，提取液中的總黃酮濃度降低，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)外濃度差下降，滲透壓降低，影響總黃酮的溶出。而且料液比太大，后續(xù)溶劑蒸發(fā)和濃縮負(fù)荷太大，在保證提取效率的同時(shí)，應(yīng)盡量減少溶劑用量。因此，選擇1 g∶40 mL、1 g∶45 mL、1 g∶50 mL三個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.1.5 丙酮-乙醇體積比對(duì)提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見下頁圖5。

圖5 丙酮-乙醇配比對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖5可知，丙酮-乙醇體積比在1:1～1:5范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨著混合提取液中乙醇比例的增加而增加，在體積比1∶4時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高（1.324%），隨后隨著混合提取液中乙醇比例的增加而降低。這是由于當(dāng)混合提取液中乙醇比例的增加，總黃酮中溶于乙醇和丙酮的化合物被提取出來，提取率升高，但是當(dāng)乙醇比例增加到一定程度時(shí)，提取液中醇溶性物質(zhì)達(dá)到飽和，且由于混合提取液中丙酮的比例降低，黃酮類化合物中能溶于丙酮的一些化合物也不能全部溶解，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇1∶3、1∶4、1∶5三個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.1.6 丙酮-乙醇混合溶液體積濃度對(duì)提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 混合溶液濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖6可知，丙酮-乙醇混合溶液體積濃度在75%～95%范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨著混合溶液濃度的增加而增加，當(dāng)混合溶液體積濃度為85%時(shí)，總黃酮提取率最大（1.384%），隨著混合溶液體積濃度的繼續(xù)增加，總黃酮提取率降低。這是由于混合溶液體積濃度增大，溶于丙酮-乙醇中的黃酮類化合物增加，提取率增加，當(dāng)混合溶液濃度增加到一定程度時(shí)，黃酮中溶于水的部分，溶出量降低，并且隨著混合溶液體積濃度繼續(xù)增加，一些脂溶性物質(zhì)會(huì)被提取出來，與黃酮類化合物的溶解形成競爭，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。因此，選擇混合溶液體積濃度為80%、85%、90%三個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果表3和方差分析結(jié)果表4可知，4種因素對(duì)黃花石蓮總黃酮提取率的影響由大到小為：混合提取液體積濃度＞超聲溫度＞丙酮-乙醇體積比＞料液比。其中超聲溫度、混合提取液體積濃度和丙酮-乙醇體積比對(duì)總黃酮提取率的影響達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），料液比對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著（P＞0.05）。通過極差分析和方差分析可以得出黃花石蓮中總黃酮提取的優(yōu)化工藝組合為A2B2C2D2，即：超聲時(shí)間50 min、超聲溫度50℃、丙酮-乙醇體積比為1∶4、丙酮-乙醇混合溶液體積濃度為85%、料液比1 g∶45 mL。在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)6次，黃花石蓮總黃酮的平均提取率為1.677%，RSD為1.17%，大于正交試驗(yàn)表3中的最高提取率1.509%，為最終優(yōu)化的黃花石蓮總黃酮提取條件。

表4 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 黃花石蓮總黃酮的抗氧化活性

2.4.1 黃花石蓮總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力

試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 黃花石蓮總黃酮對(duì)DPPH·的清除率

由圖7可知，質(zhì)量濃度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范圍內(nèi)，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除能力隨著質(zhì)量濃度增大而增大。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.354 mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)到最大，為94.92%。與相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸相比，當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.118 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率低于抗壞血酸；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.118 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率高于抗壞血酸。黃花石蓮總黃酮對(duì)DPPH·最大清除率比抗壞血酸對(duì)DPPH·的最大清除率高3.18%。結(jié)果表明黃花石蓮總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH·的能力。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果（x±s，n=3）

2.4.2 黃花石蓮總黃酮對(duì)·OH的清除能力

試驗(yàn)結(jié)果見圖8。

圖8 黃花石蓮總黃酮對(duì)·OH的清除率

由圖8可知，質(zhì)量濃度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范圍內(nèi)，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對(duì)·OH的清除能力隨著質(zhì)量濃度增大而增大。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.354 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到最大，為23.96%。與相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸相比，黃花石蓮總黃酮對(duì)·OH的清除率均低于抗壞血酸，但也表現(xiàn)出一定的清除·OH能力。

2.4.3 黃花石蓮總黃酮對(duì)O2-·的清除能力

試驗(yàn)結(jié)果見圖9。

圖9 黃花石蓮總黃酮對(duì)O2-·的清除率

由圖9可知，質(zhì)量濃度在0.059mg/mL～0.354mg/mL范圍內(nèi)，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對(duì)O2-·的清除能力隨著質(zhì)量濃度增大而增大。當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為 0.354 mg/mL時(shí)，對(duì)O2-·的清除率最大，為18.91%。與相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸相比，黃花石蓮總黃酮對(duì)O2-·的最清除率均低于抗壞血酸，但也表現(xiàn)出一定的清除O2-·能力。

3 結(jié)論

丙酮-乙醇混合溶液作為提取劑對(duì)黃花石蓮總黃酮的提取率高于乙醇，而丙酮最低。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出影響黃花石蓮總黃酮提取率因素的大小為，混合提取液體積濃度＞超聲溫度＞丙酮-乙醇體積比＞料液比。其中超聲溫度、混合提取液體積濃度和丙酮-乙醇體積比對(duì)總黃酮提取率的影響達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），料液比對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著（P＞0.05）。提取工藝條件為：超聲時(shí)間50 min、超聲溫度50℃、丙酮-乙醇體積比為1∶4、丙酮-乙醇混合溶液體積濃度為85%，料液比1 g∶45mL。在優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)6次，得到黃花石蓮總黃酮的平均提取率為1.677%，RSD為1.17%。質(zhì)量濃度在0.059 mg/mL～0.354 mg/mL范圍內(nèi)，黃花石蓮總黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH·、·OH、和O2-·的清除能力，隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)黃花石蓮總黃酮質(zhì)量濃度為0.354 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·、·OH、和 O2-·的清除率最大，分別為94.92%、23.96%、18.91%。與相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸相比，其清除·OH和O2-·的能力均低于抗壞血酸，但是當(dāng)質(zhì)量濃度＞0.118 mg/mL時(shí)，其清除DPPH·的能力大于抗壞血酸。