可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1、2及其配體等因素在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫中的作用

劉 萍,朱小華

(中南大學湘雅二醫(yī)院眼科,長沙 410011;*通訊作者,E-mail:liuhandongdd@sina.com)

視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞屬于視網(wǎng)膜血管性疾病之一,好發(fā)于中老年人群,主要發(fā)病原因為視網(wǎng)膜靜脈系統(tǒng)形成血栓所導致視網(wǎng)膜血管性異常[1-3]。視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者的并發(fā)癥中以黃斑水腫最為常見,嚴重可導致患者喪失視力。1989年,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被首次分離提純,研究發(fā)現(xiàn)其在新生血管的形成過程中扮演重要角色,可通過結(jié)合其特異性受體,對病理及生理狀態(tài)下的血管生成產(chǎn)生影響[4,5]。隨著研究的不斷深入,研究人員指出,VEGF及其受體家族除了參與新生血管形成過程外,還與機體神經(jīng)功能、心肌缺血以及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理過程及病理的發(fā)生發(fā)展相關[6-8]。近年來,康柏西普、貝伐單抗以及雷珠單抗等多種VEGF抑制劑已經(jīng)逐漸應用于腫瘤的治療中并取得較好的臨床效果,為此,本研究以視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫患者為研究對象,通過探討可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(sVEGFR-1)、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-2(sVEGFR-2)與該疾病發(fā)生發(fā)展的相關性,旨在為視網(wǎng)膜新生血管相關疾病的臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017-06～2017-12我院就診的視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者30例為病例組(n=30),選取同期入院體檢的健康人員30例作為對照組(n=30)。根據(jù)黃斑水腫程度及范圍將30例病例組受試者分為局限性黃斑水腫組(n=10)、彌漫性黃斑水腫組(n=10)、黃斑囊樣水腫組(n=10)。入組標準:①符合視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞診斷標準,且伴黃斑水腫者;②年齡20-45歲,性別不拘;③未曾接受過眼內(nèi)手術(shù)及眼底激光治療者;④未曾接受過玻璃體腔內(nèi)注射者;⑤臨床資料完整者。排除標準:①其他疾病引起的黃斑水腫患者;②大面積無灌注區(qū)及黃斑缺血患者;③存在青光眼病史患者;④嚴重精神類疾病患者。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,且受試者均已簽署書面知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 受試者的分組 根據(jù)黃斑水腫程度及范圍將30例視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者分為局限性黃斑水腫組(n=10)、彌漫性黃斑水腫組(n=10)、黃斑囊樣水腫組(n=10)。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)法測定血清sVEGFR-1、sVEGFR-2 mRNA水平 PCR擴增條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;65 ℃ 45 s;80 ℃ 5 s,循環(huán)39次。溶解曲線:75-95 ℃,增量0.5 ℃,5 s。每次反應均需要設置陰性對照,內(nèi)參為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。內(nèi)參擴增條件為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;80 ℃ 5 s;循環(huán)39次。溶解曲線:75-95 ℃,增量0.5 ℃,5 s。全部引物由TaKaRa公司設計并合成,sVEGFR-1、sVEGFR-2的物序列見表1;應熒光定量PCR儀(型號:BIO-RADCFX96,美國)進行測定,并采用計算機軟件對樣本的熒光強度進行分析(見表1)。

表1 sVEGFR-1、sVEGFR-2的引物序列Table 1 Primer sequences of sVEGFR-1 and sVEGFR-2

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表達水平 抽取受試者晨起空腹狀態(tài)下的肘靜脈血2 ml,室溫條件下靜置1 h,采用低溫高速離心機以12 000×g的轉(zhuǎn)速條件離心15 min,取上層血清,保存于-70 ℃條件下。采用ELISA法測定血清中sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白水平,操作步驟嚴格按照說明書進行,ELISA試劑盒購自美國R&D System公司。全部待測樣本均設置3個復孔并于同一批次進行測定,最終濃度為三次測定的平均值,批內(nèi)變異不超過5%,全部檢測均由經(jīng)驗豐富的專人進行檢測。

1.2.4 觀察指標 ①比較局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組三組受試者性別、年齡等基線資料。②比較病例組、對照組受試者血清sVEGFR-1和sVEGFR-2的mRNA與蛋白表達水平。③局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組三組受試者血清sVEGFR-1 mRNA和sVEGFR-2 mRNA與蛋白表達水平。④采用Logistic多因素回歸分析視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫與其血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達水平的相關性。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 三組受試者基線資料

局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組患者的眼底影像學見圖1。局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組、黃斑囊樣水腫組三組受試者年齡、性別等基線資料無顯著差異(P>0.05,見表2),故可排除上述因素對研究結(jié)果造成的影響,數(shù)據(jù)具有可比性。

表2 三組受試者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data between three groups of subjects

2.2 病例組、對照組受試者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2的mRNA水平以及蛋白表達水平比較

病例組受試者血清sVEGFR-1 mRNA水平和sVEGFR-1蛋白明顯高于對照組、血清sVEGFR-2 mRNA水平和sVEGFR-2蛋白明顯高于對照組,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 病例組、對照組受試者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2的mRNA及蛋白水平比較Table 3 Comparison of mRNA and protein levels of serum sVEGFR-1 and sVEGFR-2 in case group and control

2.3 三組受試者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA水平以及sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表達水平

黃斑囊樣水腫組受試者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA以及sVEGFR-1、sVEGFR-2蛋白表達水平明顯高于局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組,彌漫性黃斑水腫組受試者明顯高于局限性黃斑水腫組,三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表4)。

表4 三組受試者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2 mRNA水平比較Table 4 Comparison of serum sVEGFR-1, sVEGFR-2 mRNA levels between three

2.4 血清sVEGFR-1、sVEGFR-2水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫的線性相關分析

線性相關分析結(jié)果顯示,血清sVEGFR-1蛋白、sVEGFR-2蛋白表達水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫顯著相關(P<0.05,見表5)。

表5 血清sVEGFR-1、sVEGFR-2水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫的相關性Table 5 Correlation between sVEGFR-1,sVEGFR-2 and retinal branch vein occlusion with macular edema

3 討論

視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者伴黃斑水腫可對血-視網(wǎng)膜屏障造成損傷,增加機體的血管滲透性,視網(wǎng)膜實質(zhì)層內(nèi)滲透進原本處于血漿中的多種蛋白,導致組織缺血缺氧,疾病進一步進展后會損傷視網(wǎng)膜光感受器細胞,且此種傷害是不可逆轉(zhuǎn)的,最終導致患者視功能的嚴重惡化甚至完全失明[9,10]。因此,探尋視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者伴黃斑水腫的影響因素,從而采取有針對性的防治措施改善患者視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)、促進其黃斑水腫的吸收尤為重要。近年來,研究人員提出VEGF在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,因視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者是由于血液回流所導致的視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài),患者視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中VEGF表達水平增加,對新生血管形成產(chǎn)生影響,從而使得視網(wǎng)膜血管的通透性增加,存在視網(wǎng)膜下的滲液最終可引發(fā)黃斑水腫[11-13]。

作為重要的血管內(nèi)皮細胞促血管生長因子,VEGF的作用包括增加小靜脈、微靜脈的通透性,并對血管內(nèi)皮細胞的增殖、分裂以及Ca2+在細胞質(zhì)內(nèi)的聚集過程進行促進[14,15]。常見的VEGF受體(VEGFR)主要包括下列三種:VEGFR-1、VEGFR-2以及VEGFR-3,三者同為酪氨酸激酶受體,其中VEGFR-1、VEGFR-2及其相結(jié)合的受體可對VEGF的活性進行控制,通過對其受體的自身磷酸化過程進行誘導,使得相關信號轉(zhuǎn)導通路被激活最終發(fā)揮生物學活性。sVEGFR-1主要分泌于胎盤合體滋養(yǎng)細胞,由VEGFR-1胞外域剪接而成,具有可分泌性,且對VEGF有高度的親和力,與sVEGFR-2同為VEGF跨膜受體的可溶形式。sVEGFR-1僅具有胞外配體結(jié)合區(qū),缺乏跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū),不具備酪氨酸激酶活性[16]。但由于sVEGFR-1還可與VEGFR-1、VEGFR-2相結(jié)合,即sVEGFR-1能夠?qū)EGF起到拮抗作用并對其生物學活性進行阻斷，sVEGFR-1與VEGF結(jié)合后可抑制VEGF促血管生長的作用[17];sVEGFR-2屬于VEGF的酪氨酸激酶受體,在血管形成中扮演著主要信號傳遞體的作用,sVEGFR-2的趨化作用及促有絲分裂活性十分明顯,活化后能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細胞發(fā)生分裂、增殖與遷移[18]。sVEGFR-1在先兆子癇、冠狀動脈慢血流、糖尿病周圍神經(jīng)病變等多種疾病患者體內(nèi)表達異常[19,20],而在視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫方面未見報道。本文研究發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA含量及其蛋白表達水平明顯高于健康人群,通過Logistic多因素回歸分析發(fā)現(xiàn),血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達水平與視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴發(fā)黃斑水腫顯著相關。

視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞伴黃斑水腫嚴重程度的影響因素主要包括以下幾方面:發(fā)病年齡、發(fā)生部位、靜脈阻塞的類型、黃斑靜脈引流影響情況等,患者視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞的部位與嚴重程度直接影響到患者視力的預后。視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者血-視網(wǎng)膜內(nèi)外屏障受損,當病變累及至黃斑區(qū)時,細胞外液積在黃斑區(qū)視網(wǎng)膜內(nèi)核層以及Henle纖維間存在,外觀為多囊樣;同時回流的視網(wǎng)膜內(nèi)層液體障礙會造成Müller細胞發(fā)生腫脹。當黃斑水腫存在較長時間后,可損傷患者黃斑部的解剖結(jié)構(gòu)。相對于彌漫性黃斑水腫及黃斑囊樣水腫患者,局限性黃斑水腫患者中心凹處P1波振幅密度更高,提示由此可以看出,相較于局限性黃斑水腫與彌漫性黃斑水腫,黃斑囊樣水腫最為嚴重,且對視功能的損傷最大。本研究中,黃斑囊樣水腫組受試者血清sVEGFR-1 mRNA、sVEGFR-2 mRNA、蛋白表達水平明顯高于局限性黃斑水腫組、彌漫性黃斑水腫組,彌漫性黃斑水腫組明顯高于局限性黃斑水腫組,提示視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞患者所伴發(fā)的黃斑水腫程度越嚴重,其血清VEGF濃度越高,sVEGFR-1、sVEGFR-2表達水平越高。

綜上所述,視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞黃斑水腫患者血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達水平明顯升高,且患者黃斑水腫程度越嚴重,其血清sVEGFR-1、sVEGFR-2表達水平越高。