四株細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株16Sr DNA序列分析及生產(chǎn)性能比較研究

鄒小周， 曹張軍， 陳 琳， 洪 楓*

（東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海201620）

細(xì)菌纖維素（bacterial nanocellulose，BNC）是由微生物合成的高純纖維素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為β-1,4-糖苷鍵連接吡喃葡萄糖單體形成的直鏈多糖[1]。不同于植物纖維素，細(xì)菌纖維素具有更高的純度，不含半纖維素和木質(zhì)素[1]；纖維直徑遠(yuǎn)小于植物纖維素，由此產(chǎn)生的大比表面積使其具有極佳的持水能力[2]。此外，細(xì)菌纖維素具有高聚合度、高結(jié)晶度和較好的機(jī)械性能[3-4]，在食品[5]、造紙[6]、紡織[7]等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1,3]。作為一種無毒、高持水率的天然水凝膠材料，細(xì)菌纖維素還可用于傷口敷料[4,8]和藥物緩釋物[9]等領(lǐng)域。細(xì)菌纖維素的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原，有一定的相似性，因此具有很好的生物相容性[10]。近年來，細(xì)菌纖維素在小口徑人工血管[11-12]、骨組織工程支架等新興研究領(lǐng)域受到了研究者們的青睞。綜上所述，作為一種高附加值產(chǎn)品，細(xì)菌纖維素具有廣泛的應(yīng)用前景和可觀的商業(yè)價(jià)值[13]。

細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)菌株主要分布在醋桿菌屬（Acetobacter）、固氮菌屬（Azotobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、疊球菌屬（Sarcina）等多個(gè)菌屬當(dāng)中[1]。其中研究最為廣泛、產(chǎn)量最高的菌屬是木葡糖醋桿菌屬（Komagataeibacter xylinus）[1]（原名Gluconacetobacter xylinus，Acetobacter xylinus）。生產(chǎn)菌株不同，不僅纖維素產(chǎn)量不同，所產(chǎn)纖維素的性質(zhì)也存在一定的差異。

本研究對實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2和DHU-HL-Z3三株BNC生產(chǎn)菌與已廣泛報(bào)道的K. xylinus ATCC 23770菌株進(jìn)行比較，通過研究發(fā)酵過程中糖耗速率、活細(xì)胞增長及BNC產(chǎn)量方面的差異，并對 BNC產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、結(jié)晶度和力學(xué)性能等方面的測試分析，比較菌種基本生產(chǎn)性能的差異。通過16SrDNA測序確定三個(gè)菌株所屬的種屬，并與已報(bào)道的多株BNC生產(chǎn)菌株進(jìn)行比對，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，探索菌種親緣關(guān)系與菌種生產(chǎn)特性之間的關(guān)系。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將為菌株的合理利用以及進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種和藥品

菌種K. xylinus ATCC 23770購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫（American Type Culture Collection）。DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2、DHU-HL-Z3為實(shí)驗(yàn)室篩選保藏菌種。培養(yǎng)基主要成分為葡萄糖（分析純）、蛋白胨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、酵母粉（英國 Oxoid）。

1.2 16SrDNA 測序和系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立

在冰上建立PCR體系，10×擴(kuò)增緩沖溶液5.0 μL，dNTP引物1 μL，上下游引物（10～20 pmol）各2 μL，TaqDNA聚合酶（10 U/μL）1 μL，加超純水至50 μL。模板為長在平板固體培養(yǎng)基中的菌種單菌落，用接種針挑取少量充分溶解在PCR體系中。上述體系中的上游引物為BSF8/20，序列為5?-AGA GTT TGA TCC TGG CTA AG-3?；下游引物為 BSR1542/20, 序列為 5?-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3?。

將反應(yīng)體系放在PCR儀中，按照如下程序操作：94℃預(yù)變性4 min；94℃，30 s（變性），53℃，30 s（引物退火），72℃，90 s（引物延伸），循環(huán)32次；72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)有1 600 bp左右的條帶之后，將PCR產(chǎn)物送到上海生物工程公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用SerialCloner 軟件進(jìn)行處理，序列在BLAST網(wǎng)站上進(jìn)行比對，并選擇與菌株較為相近且已發(fā)表模型菌株進(jìn)行比對。將這些菌株的16SrDNA序列數(shù)據(jù)用Geneious軟件進(jìn)行處理，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菌種培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基（w/V）中含有 2.5%葡萄糖、0.5%胰蛋白胨、0.3%酵母粉，pH用硫酸調(diào)至5.0，115℃條件下滅菌30分鐘；固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基多加入0.2%的瓊脂。將菌種接入液體培養(yǎng)基，以180 r/min和30℃的條件進(jìn)行活化?；罨蟮木N在固體平板培養(yǎng)基上劃線，30℃下培養(yǎng)直至長出單菌落。

為比較不同菌種的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，規(guī)定發(fā)酵起始的活細(xì)胞濃度和葡萄糖濃度應(yīng)基本相同。在100 mL液體培養(yǎng)基中以單菌落接種，在180 r/min、30℃的條件下對菌種進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，監(jiān)測菌種的活細(xì)胞數(shù)目，當(dāng)活細(xì)胞數(shù)目達(dá)到規(guī)定值時(shí)，測定預(yù)培養(yǎng)液的葡萄糖濃度，用少量100 g/L的無菌葡萄糖液補(bǔ)糖至25 g/L。在無菌操作條件下，將30 mL補(bǔ)糖預(yù)培養(yǎng)液加入100 mL無菌錐形瓶中，每個(gè)菌種設(shè)置三個(gè)平行。在30℃的條件下靜態(tài)培養(yǎng)，分別在發(fā)酵第1、2、4、6、8和10天取樣，測活細(xì)胞數(shù)目、pH和殘?zhí)菨舛取?/p>

1.4 活細(xì)胞數(shù)目測定

用0.22 μL濾膜截留培養(yǎng)基中的游離細(xì)胞，將濾膜在0.85%NaCl溶液中進(jìn)行重懸。用BacLight live/dead熒光染色試劑盒（Invitrogen, 美國）對菌懸液進(jìn)行染色。通過測定菌懸液的熒光值，利用預(yù)先建立的熒光值―細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算活菌數(shù)目。

1.5 葡萄糖測定

用Accu-Chek Aviva血糖測試儀（Roche Diagnotics GmbH, 德國）測定液體樣品中的葡萄糖含量。預(yù)先建立標(biāo)線，樣品用pH為7.4的血糖儀緩沖溶液（含有8.65 mg/L NaCl，176.4 mg/L CaCl2·2H2O，182.9 mg/L MgCl2·6H2O和201.3 mg/L KCl）進(jìn)行稀釋，用血糖儀直接讀數(shù)，利用標(biāo)線計(jì)算葡萄糖濃度。

1.6 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量測定

發(fā)酵結(jié)束后將得到的纖維素膜用去離子水清洗后，放在預(yù)先恒重的坩堝中，在 80℃條件下預(yù)先烘干4 h，然后在105℃條件下烘干至恒重。細(xì)菌纖維素的質(zhì)量為坩堝帶樣品的恒重減去坩堝恒重。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（g/L）以及單位糖耗的細(xì)菌纖維素轉(zhuǎn)化率（g/g）的計(jì)算公式如式（1）、（2）所示。

1.7 拉力測試

在80℃水浴中先將細(xì)菌纖維素膜用1%NaOH溶液和去離子水循環(huán)清洗，直至洗水為中性。將細(xì)菌纖維素膜用手術(shù)剪刀剪成4 cm×1 cm的小條，每個(gè)樣品設(shè)置四個(gè)平行。用游標(biāo)卡尺測量四個(gè)細(xì)菌纖維素小條的厚度，每個(gè)小條測量三個(gè)位置的厚度取平均值。將準(zhǔn)備好的樣品用萬能材料測試機(jī)（H5K-S, Hounsfield分析儀器有限公司，英國）進(jìn)行拉力測試。測試環(huán)境為25℃恒溫，相對濕度大約50%。

1.8 紅外譜圖

將上述清洗過的膜用液氮預(yù)凍后在凍干機(jī)中凍干48 h。得到的凍干膜樣品壓成片用傅里葉紅外光譜儀PerkinElmer Spectrum Two（PerkinElmer，美國）進(jìn)行紅外掃描，掃描范圍是 4 000～400 cm-1，步長為 4 cm-1。

1.9 X-射線廣角衍射測試

將凍干的細(xì)菌纖維素膜樣品用D/max-2550 PC X-射線衍射儀（Rigaku公司，日本）進(jìn)行X-射線廣角衍射測試（XRD），2θ角的范圍為3o～60o，掃描速度為10o/min。得到的結(jié)果經(jīng)過Jade軟件分析，根據(jù)圖譜和峰面積計(jì)算結(jié)晶度。

1.10 場發(fā)射掃描電鏡觀察

纖維素膜樣品經(jīng)過純化凍干，取橫斷面制樣。在S-4800場發(fā)射掃描電鏡下拍攝照片。分辨率1 nm，加速電壓15 kV。用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)纖維直徑，Origin軟件做纖維直徑正態(tài)分布統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 16SrDNA 序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖1為16SrDNA序列分析（a）瓊脂糖凝膠電泳（b）BNC生產(chǎn)菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

圖1 16SrDNA序列分析（a）瓊脂糖凝膠電泳，（b）BNC生產(chǎn)菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖1a為16SrDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在1 600 bp左右可見清晰的電泳條帶，將四個(gè)菌種兩個(gè)平行樣品中條帶較亮的一個(gè)樣品送往上海生工公司進(jìn)行基因測序。具體的基因序列由于版面限制此處不具體列出。如圖 1b，本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的 DHU-HL-Z3、DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2三個(gè)菌株均屬于Komagataeibacter。經(jīng)過信息收集，將已報(bào)道的BNC生產(chǎn)菌株與該三株菌進(jìn)行16SrDNA序列比對，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。16SrDNA為保守序列，經(jīng)過信息處理，生產(chǎn)BNC菌種16SrDNA序列相似度都很高，此處只選取若干典型菌株進(jìn)行情況說明。K. xylinus ATCC 23770菌株利用廉價(jià)碳源[14-15]降低細(xì)菌纖維素生產(chǎn)成本以及人工血管[16]等高附加值產(chǎn)物的開發(fā)等方面都有應(yīng)用研究。DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2與K. xylinus E25以及K. xylinus BPR 2001親緣性更為接近。Kubiak等對K. xylinus E25菌株進(jìn)行了全基因組測序[17]，發(fā)現(xiàn)了該菌株與抗性相關(guān)的質(zhì)粒和基因，為后續(xù)菌株的耐受性研究[18-19]提供了理論基礎(chǔ)。K. xylinus BPR 2001適合于動(dòng)態(tài)發(fā)酵，耐受剪切力，是液體深層攪拌發(fā)酵性能優(yōu)良的菌種[20]。親緣性較近的菌株在生長代謝和產(chǎn)物性質(zhì)上可能存在相似性，這一推論還需要更多菌種的相關(guān)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

2.2 菌種生產(chǎn)性能比較

四個(gè)菌株在發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度變化如圖1a所示，經(jīng)過9天的發(fā)酵周期，發(fā)酵初始培養(yǎng)基中的約25 g/L葡萄糖被全部利用。DHU-HL-Z3耗糖比其他三個(gè)菌株更快。在發(fā)酵第一天，DHU-HL-Z3已經(jīng)有明顯的糖耗，而其他三個(gè)菌種明顯處于延遲期，沒有明顯的糖耗。發(fā)酵第5天，DHU-HL-Z3已經(jīng)消耗完所有的葡萄糖，發(fā)酵第7天，K. xylinus ATCC23770 消耗完所有葡萄糖。DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2兩個(gè)菌株的糖耗較慢，到第9天消耗所有葡萄糖。雖然培養(yǎng)基的起始pH值都調(diào)為5.0，但是為達(dá)到特定的細(xì)胞濃度，四個(gè)菌種經(jīng)過不同時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)后，三個(gè)菌種的pH下降到3.5，只有ATCC 23770初始pH是4.0。在發(fā)酵過程當(dāng)中，培養(yǎng)基的pH值都有所下降，主要原因推測為產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株在耗糖同時(shí)會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸[1,21]。K. xylinus菌種在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的葡糖酸[22]，這種副產(chǎn)物導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH下降。

圖2 發(fā)酵過程參數(shù)（a）葡萄糖濃度（b）pH（c）活細(xì)胞變化（d）細(xì)菌纖維素產(chǎn)量

在細(xì)菌纖維素的靜態(tài)發(fā)酵體系中，細(xì)菌纖維素膜會(huì)在培養(yǎng)基和空氣的交界面逐漸形成。體系中的活細(xì)胞大部分被包裹在生成的細(xì)菌纖維素素膜中，這部分活細(xì)胞不易測算和計(jì)數(shù)。用熒光染色的方法測定培養(yǎng)基中的游離活細(xì)胞數(shù)目，其結(jié)果如圖 2a所示。在發(fā)酵的第一天內(nèi)，四個(gè)菌株中的活細(xì)胞數(shù)目都沒有明顯的變化。在隨后的八天時(shí)間中，四個(gè)菌種的游離細(xì)胞顯現(xiàn)出明顯的變化差異。四個(gè)菌種中K. xylinus ATCC 23770的游離活細(xì)胞數(shù)目較多，增殖較快，在發(fā)酵第5天活細(xì)胞數(shù)目達(dá)到20.8×106cell/mL，之后游離活細(xì)胞的增長進(jìn)入穩(wěn)定期。DHU-HL-Z3的游離活細(xì)胞數(shù)目相對于K. xylinus. ATCC23770較少，發(fā)酵第7天活細(xì)胞數(shù)目達(dá)到16.8×106cell/mL，之后游離活細(xì)胞數(shù)目少量降低。DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2兩個(gè)菌種游離細(xì)胞數(shù)在發(fā)酵過程中沒有明顯變化，但是可以觀察到細(xì)菌纖維素膜的生成。

如圖2c所示，DHU-HL-Z1以及DHU-HL-Z2在發(fā)酵清液中的活細(xì)胞沒有明顯的增長，但與此同時(shí)BNC膜在逐漸增厚，說明這兩個(gè)菌株的活細(xì)胞主要分布在細(xì)菌纖維素膜中。菌株DHU-HL-Z3與K. xylinus ATCC 23770相似，在靜態(tài)發(fā)酵的上清液中可以觀測到明顯的活細(xì)胞增長，并可觀測到增長期和穩(wěn)定期，與前述兩個(gè)菌株有明顯的區(qū)別。活細(xì)胞分布的研究結(jié)果對于 BNC生產(chǎn)菌株的應(yīng)用和生產(chǎn)實(shí)踐具有一定的指導(dǎo)意義。譬如DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2兩個(gè)菌種在保種的過程中，應(yīng)注意其游離細(xì)胞較少，不能采用常規(guī)的微生物保種方式，而應(yīng)采用含有大量活細(xì)胞的細(xì)菌纖維素膜來進(jìn)行保種，避免用游離細(xì)胞保種導(dǎo)致菌種退化和死亡。如圖2d所示，經(jīng)過9天的發(fā)酵培養(yǎng)周期，DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（粗干重）分別為12.8 g/L和12.9 g/L，兩者的產(chǎn)量之間沒有明顯差異（p＞0.05）。這兩個(gè)菌種的產(chǎn)量明顯高于（p＜0.05）K. xylinus ATCC 23770的8.7 g/L。DHU-HL-Z3的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為14.8 g/L，明顯高于其他三個(gè)菌種（p＜0.05）。計(jì)算表明，DHU-HL-Z3菌種單位糖耗的細(xì)菌纖維素轉(zhuǎn)化率最高，為 0.59±0.02 g/g，隨之是DHU-HL-Z1 和 DHU-HL-Z2（分別為 0.52±0.01 和 0.49±0.01 g/g），最低的是 ATCC 23770（0.34±0.03 g/g）。

2.3 細(xì)菌纖維素性能表征

如圖 3a所示，四個(gè)菌種產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素樣品在紅外圖譜中都顯示出纖維素的紅外特征峰，如1059 cm-1處的C-O伸縮振動(dòng)，1165 cm-1處的C-O-C 不對稱伸縮振動(dòng)，2900 cm-1左右的甲基，亞甲基和次甲基C-H伸縮振動(dòng)峰和3300 cm-1左右由纖維素中羥基O-H振動(dòng)引起的寬吸收峰[23-25]。

圖3 細(xì)菌纖維素性能表征（a）紅外譜圖（b）水凝膠膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（c）XRD測試

圖3b為四個(gè)菌種產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素水凝膠膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，其中DHU-HL-Z2 和DHU-HL-Z3的機(jī)械性能較優(yōu)，楊氏模量分別130和96 KPa。ATCC 23770和DHU-HL-Z1的機(jī)械性能比Z2和Z3的弱，楊氏模量分別為23和39 KPa。圖3c為四種BNC的廣角X-射線衍射曲線，在2θ角分別為14.2o、16.7o和22.4o的位置分別有代表（1ī0）、（110）和（200）晶面的衍射峰[23]。其中，DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2的結(jié)晶度較高，分別為87.64%和86.65%，這兩個(gè)菌種在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的親緣性較近。另外親緣性較近的兩個(gè)菌種DHU-HL-Z3和K. xylinus ATCC 23770的結(jié)晶度較低，分別為64.51%和62.34%。

圖4為四種BNC的場發(fā)射掃描電鏡照片及纖維直徑統(tǒng)計(jì)情況。從放大5 000倍的電鏡圖可知，BNC都呈現(xiàn)三維的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。放大20 000倍照片上可以觀察到單根的纖維以及纖維分支。隨機(jī)統(tǒng)計(jì)不同照片上的200根纖維，對纖維直徑做統(tǒng)計(jì)分析可知，纖維分布基本符合正態(tài)分布，偶爾出現(xiàn)的大于90～100 nm的纖維一般為兩根或多根成股纖維，在這些纖維的末端可以看到纖維分支。DHU-HL-Z2和 DHU-HL-Z3的纖維平均直徑分別為44 nm和37 nm，比DHU-HL-Z1和ATCC 23770的（48 nm和46 nm）略小。相反地，這兩個(gè)菌種的楊氏模量更大，纖維微觀結(jié)構(gòu)和宏觀力學(xué)性能之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

圖4 場發(fā)射掃描電鏡照片及纖維直徑分析

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室保藏的DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2和DHU-HL-Z3三個(gè)菌株比對照菌K. xylinus ATCC 23770具有更高的BNC產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，在BNC的研究和工業(yè)生產(chǎn)中具有較大的潛力。經(jīng)16SrDNA測序和建立多菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹研究，可知 DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2和 DHU-HL-Z3菌種均屬于木葡糖酸醋桿菌Komagataeibacter。四個(gè)菌株的BNC產(chǎn)物紅外圖譜都顯示了纖維素特征峰。靜態(tài)發(fā)酵時(shí)，親緣性較近的菌株Z1和Z2在培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)目比另兩個(gè)親緣性較近的菌株Z3和ATCC 23770的少，表明Z1和Z2的菌株保藏應(yīng)采用BNC膜而不是清液。在所產(chǎn)BNC性能方面，Z1和Z2兩個(gè)菌種的BNC產(chǎn)物具有更高的結(jié)晶度。Z2和Z3所產(chǎn)生的BNC的力學(xué)性能優(yōu)越，同時(shí)具有更小的纖維直徑。以上結(jié)果為這些產(chǎn)纖維素菌株的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了很好的工作基礎(chǔ)。