認(rèn)識非洲豬瘟及其窗口期檢測的重要意義

鐘建舟

（寧鄉(xiāng)市東湖塘鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合管理服務(wù)中心，湖南 寧鄉(xiāng) 410612）

非 洲 豬 瘟(African Swine Fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)引起的一種豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病,嚴(yán)重危害著全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。我國將非洲豬瘟列為一類動物疫病，是烈性外來疫病，其強(qiáng)毒力毒株對生豬致病率高，致死率100%。自2018年8月3日遼寧省沈陽市沈北新區(qū)發(fā)生第1 起疫情以來，截至2019年4 月23 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)公布的疫情共129起，疫情累計(jì)捕殺生豬達(dá)到102 萬頭，我國除了港澳臺的31 個省區(qū)市已經(jīng)全部發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情[1]。面對如此嚴(yán)峻的疫情形勢，早發(fā)現(xiàn)早診斷ASFV 感染生豬，可以為廣大養(yǎng)豬場防控非洲豬瘟疫情贏得先機(jī)。

1 非洲豬瘟病毒特點(diǎn)和臨床癥狀

1.1 病毒特性及疫苗研發(fā)瓶頸

ASFV 是非洲豬瘟病毒屬中一種大顆粒、有囊膜的病毒，直徑175 ～215 nm，核衣殼蛋白呈20 面體對稱，直徑180 nm，基因組由單分子線狀雙股DNA 組成，長度為170 ～190 kb。DNA 分子具有共價(jià)的閉合末端、反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，編碼200 多種蛋白質(zhì)[2]。感染ASFV 后會造成家豬和一些野豬種暴發(fā)出血性疾病。在遺傳學(xué)上，該病毒是一種復(fù)雜的雙股DNA 病毒，包含用于致病、免疫逃逸和細(xì)胞過程調(diào)制的一系列基因。根據(jù)p72 基因的部分序列，科技人員已發(fā)現(xiàn)此病毒有23 個基因型。

ASFV 體積龐大，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抗原種類繁多，已經(jīng)失去了成為高效疫苗的基礎(chǔ)條件。在非洲豬瘟的預(yù)防和治療方面，縱使世界各國的科學(xué)家孜孜不倦地努力并花費(fèi)巨資開展研究，仍然收效甚微，國際上勉強(qiáng)推出的試驗(yàn)性疫苗也最終被證實(shí)有害無益。

1.2 病毒傳播和臨床癥狀

ASFV 可以通過與感染動物——家豬或者野豬——直接接觸傳播，或者通過來自感染動物的污染物或生肉的間接接觸傳播，抑或是通過節(jié)肢動物媒介，尤其是鈍緣蜱屬的軟蜱間接傳播。ASFV 在蛋白質(zhì)環(huán)境中高度穩(wěn)定，且對高溫的抵抗力相當(dāng)強(qiáng)，需要在60 ℃下經(jīng)過20 min 才能失活。ASFV 在家豬之間的傳播主要通過上呼吸道感染發(fā)生，因?yàn)橐延醒芯孔C明家豬可以通過它的所有分泌物和排泄物排出有感染性的病毒，ASFV 在感染家豬的口鼻液中濃度尤其高。被病毒感染的豬死亡后，ASFV 在死豬的血液和組織中能夠持續(xù)存活非常長的時(shí)間，因此，給豬飼喂生的泔水會導(dǎo)致ASF 的傳播。病死豬剖檢后的污染擴(kuò)散、感染豬群打架后的流血和感染后的便血可能會成為ASFV感染的新路徑?？諝鈧鞑ネ緩揭言趧游锔呙芏蕊曫B(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中被證實(shí)。

在我國ASF 屬于“糞口傳播”的疾病，放任大量的病豬進(jìn)入屠宰廠污染環(huán)境、污染泔水、污染飼料，一旦源頭治理失守，ASFV 便隨著帶毒仔豬、污染豬肉和污染飼料流通向各地，勢必使非洲豬瘟疫情將成燎原之勢。

ASF 臨床病變可以通過多種途徑表現(xiàn)，從無征兆的死亡(最急性型，死亡率約100%)到無癥狀感染；然而，ASFV 的大多數(shù)分離株會使家豬出現(xiàn)急性出血熱，并引發(fā)近100%的死亡率。研究發(fā)現(xiàn)所有年齡段的豬對ASFV 感染均表現(xiàn)出相同的易感性，這與經(jīng)典豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)不同——幼齡豬更易感CSFV。ASFV 急性感染是由強(qiáng)毒株造成的，其典型的特征性癥狀表現(xiàn)為高熱、食欲減退、昏睡、虛弱、臥地不起、腹瀉和/或便秘、腹痛、出血癥、呼吸困難、流涕和流淚以及妊娠母畜的流產(chǎn)[3]。感染ASFV 的豬只死亡時(shí)間通常出現(xiàn)在臨床癥狀出現(xiàn)后的7～10 d。根據(jù)ASFV毒株的毒力，急性感染通常是無該病區(qū)域開始暴發(fā)疫情時(shí)的主要形式；然而，該病一旦發(fā)生，通常會發(fā)展成為長期持續(xù)存在的亞急性臨床型。中等毒力的ASFV 毒株會引發(fā)亞急性感染(通常幼齡豬表現(xiàn)出高死亡率，年齡較大的豬死亡率較低)，臨床癥狀通常包括流產(chǎn)、發(fā)熱、短暫性出血，在3 ～4 周內(nèi)死亡或恢復(fù)。慢性感染的豬死亡率非常低，病豬以間歇熱或低熱、食欲減退和精神沉郁為特征；在某些情況下，會引發(fā)致死性感染。感染維持?jǐn)?shù)月的病豬，如病毒儲庫、亞臨床癥狀或慢性感染的豬，可能對疾病在流行地區(qū)持續(xù)存在起一定作用。

1.3 窗口期檢測的重要意義

窗 口 期（Window Period）是指自感染開始至病毒抗原或抗體檢出之間的間隔期。病毒進(jìn)入機(jī)體后通過特殊免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，所以檢測病毒抗原的窗口期短于病毒抗體的窗口期。在窗口期內(nèi)雖然檢測不到血液中的ASFV，但豬只體內(nèi)已存在該病毒，通過消化道感染的ASFV 主要集中在口腔等黏膜組織內(nèi)，處于局部感染（local infection）階段，屬于局限性的隱性感染（silent infection）過程。窗口期的感染豬同樣具有傳染性，但傳染性不強(qiáng)。ASF 的窗口期平均為28 d，抓住窗口期的有利時(shí)機(jī)是目前凈化和控制ASF 的唯一必要手段[4]。

2 窗口期檢測非洲豬瘟的技術(shù)要點(diǎn)

2.1 檢測方法的選擇

由于病原窗口期短于抗體窗口期，所以我們選擇的是直接檢測ASFV。ASFV 檢測的方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法、熒光定量PCR 法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法和免疫層析膠體金快速檢測法，其中較成熟的是PCR 和熒光定量PCR 法。傳統(tǒng)PCR 法是用瓊脂糖凝膠電泳或者分光光度計(jì)測定核酸濃度，其結(jié)果不準(zhǔn)確而且易污染，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可以解決這些問題，它的準(zhǔn)確性好、靈敏度高且無污染，對一些傳染性疾病可進(jìn)行定量分析、病原微生物和病毒含量檢測，此項(xiàng)技術(shù)都是首選[5]。2019年6月11日，中國動物疫病預(yù)防控制中心發(fā)布了通過專家評審的ASF 現(xiàn)場快速檢測試劑名單的34 個產(chǎn)品中，有28 個采用熒光定量PCR 法。

2.2 檢測樣本的選擇

實(shí)踐中我們常采集口腔拭子和鼻腔拭子作為窗口期的檢測樣本，這2 種拭子的采集便于操作，只需要用棉簽在生豬口腔或鼻腔中來回旋轉(zhuǎn)，沾取口鼻分泌物后放入相應(yīng)保存液中即可。但是有報(bào)道稱新鮮分泌的唾液具有更大的檢測優(yōu)勢，其病毒含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于口腔拭子和鼻腔拭子，新鮮分泌的唾液中非洲豬瘟病毒CT 值比口鼻拭子中的非洲豬瘟病毒CT 值平均低5 左右[4]。這就意味著新鮮分泌的唾液病毒含量要比口鼻拭子高約32 倍。

2.3 檢測樣本的處理

處于窗口期的生豬具備較強(qiáng)的免疫能力，采集的拭子和新鮮唾液中有活性較高的酶，尤其是唾液中酶，當(dāng)病毒含量較低時(shí)很快就會被酶降解，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。抑制酶活性的保存液是至關(guān)重要的，同時(shí)低溫保存也能有效地抑制酶的活性。由于處于窗口期的樣本中ASFV 含量較低，有報(bào)道稱對生豬采樣之前進(jìn)行禁食12 h 處理可以獲得優(yōu)質(zhì)的樣本。研究證實(shí)，試管中的病毒在靜置或者離心狀態(tài)下，底部的ASFV 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于試管上清液中的病毒含量，所以建議在采集樣本時(shí)從試管底部取樣進(jìn)行檢測[4]。

2.4 檢測試劑盒的選擇

試劑盒最重要的是準(zhǔn)確性、敏感性、時(shí)效性和可重復(fù)性。因?yàn)榇翱谄跇悠凡《竞康?，對檢測試劑盒質(zhì)量要求更高，用戶在選擇時(shí)要嚴(yán)格篩選。國產(chǎn)的熒光定量PCR 試劑盒中分為兩類：磁珠法提取核酸后進(jìn)行PCR 檢測和免提取PCR 檢測。免提取PCR 檢測由于沒有純化過程，雜質(zhì)對擴(kuò)增反應(yīng)影響較大，在對窗口期樣品檢測時(shí)效果不佳。采用免疫層析膠體金快速檢測的快速檢測卡，雖然操作簡單快速，但是由于特異性不強(qiáng)，可信度較低，也不建議采用。

3 展望

非洲豬瘟進(jìn)入我國后，國家公布的檢測方法適用于已經(jīng)發(fā)病豬群的臨床檢測，科學(xué)的非洲豬瘟窗口期檢測對生豬生產(chǎn)和ASF 防控更具實(shí)踐意義，種公豬、母豬和調(diào)運(yùn)的仔豬應(yīng)該成為窗口期檢測的重點(diǎn)。窗口期的長短與檢測技術(shù)的靈敏度有關(guān)，靈敏度越高，檢測出ASFV的時(shí)間越早，有助于非洲豬瘟疫情的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早控制。隨著對ASFV 認(rèn)識的深入，相信在政府、科研人員和養(yǎng)豬從業(yè)者們的共同努力下，定能實(shí)現(xiàn)對非洲豬瘟的有效控制。