PCR技術(shù)在中藥檢驗(yàn)中的應(yīng)用

崔璐 鄭振秋

（臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東臨沂 276000）

1 前言

歷過多年發(fā)展， 我國(guó)中藥學(xué)已經(jīng)取得了較大成就。但在中藥市場(chǎng)仍存在混偽品的情況，人們應(yīng)通過先進(jìn)的PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，促進(jìn)我國(guó)中藥學(xué)的健康發(fā)展。

2 PCR技術(shù)的概念

PCR技術(shù)是指基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一項(xiàng)可擴(kuò)充特定DNA（脫氧核糖核酸）片段的技術(shù)，隸屬于分子生物學(xué)。這項(xiàng)技術(shù)的最大特點(diǎn)是可以有效擴(kuò)充微量DNA。在現(xiàn)實(shí)生活中，這項(xiàng)技術(shù)發(fā)揮著十分重要的作用。從生物化石或人體遺骸甚至是中藥中，都僅需提取少量的DNA，然后借用此技術(shù)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)充，就可以得到用于后期比對(duì)的樣本。

3 中藥檢驗(yàn)的意義

在醫(yī)學(xué)方面，品質(zhì)優(yōu)良的藥材可以促進(jìn)病人早日恢復(fù)身體健康，而混偽藥材的藥效較差，會(huì)對(duì)病人的身體造成負(fù)面影響。除此以外，這些混偽藥材還會(huì)影響藥品研發(fā)、醫(yī)療科研等方面，長(zhǎng)此以往，不僅會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失，還有可能延誤病人的病情發(fā)展。當(dāng)前造成中藥質(zhì)量參差不齊、 易出現(xiàn)混偽品的主要原因有：（1）人為因素，出現(xiàn)誤買、誤用等行為；（2）外觀、名稱相近的藥影響使用者的判斷；（3）受到經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，不法分子故意售假。

中藥的質(zhì)量會(huì)直接對(duì)藥量的使用及藥效產(chǎn)生影響。 所以，在明確所需的中藥品種后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行仔細(xì)檢測(cè)，避免使用混偽品。

4 以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物檢驗(yàn)技術(shù)

4.1 PCR-RFLP 技術(shù)（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)）

這項(xiàng)技術(shù)不僅可以檢驗(yàn)出不同的中藥種屬，還可以依據(jù)現(xiàn)今的市場(chǎng)行情，對(duì)藥材的摻偽程度進(jìn)行半定量檢驗(yàn)。 張文娟等[1]就借助該技術(shù)研發(fā)出了可以檢測(cè)川貝母中的添加偽品的半定量方法。具體操作方法是：首先，提取川貝母粉中的DNA；然后，按照相應(yīng)的體積比例，在其中加入占比各異的偽品DNA，將其視為模板；其次，輔以這種技術(shù)經(jīng)過凝膠電泳后，使用軟件對(duì)結(jié)果中的條帶強(qiáng)弱進(jìn)行分析， 最終得出摻偽量。

4.2 RAPD 技術(shù)（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 技術(shù)）

這項(xiàng)技術(shù)操作起來十分便捷， 不僅可以采用多態(tài)性的方式對(duì)未知序列的基因組進(jìn)行分析， 還可以對(duì)DNA 分子進(jìn)行標(biāo)記。 該技術(shù)借助隨機(jī)引物擴(kuò)增，能找到許多的多態(tài)性DNA 片段用作標(biāo)記，彌補(bǔ)RFLP技術(shù)的缺陷，對(duì)其不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)的重復(fù)順序進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而補(bǔ)償其圖譜中的缺失。當(dāng)這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于中藥檢驗(yàn)時(shí)，可以對(duì)動(dòng)植物類的生藥材進(jìn)行代替品、易混物的檢驗(yàn)。不過，這項(xiàng)技術(shù)的缺陷在于擁有較弱的重復(fù)性與穩(wěn)定性，這也導(dǎo)致了它在應(yīng)用時(shí)的局限性。人們可以提取較高質(zhì)量的DNA 基因組，用以規(guī)避擴(kuò)增多態(tài)DNA 技術(shù)所帶來的缺陷，對(duì)引起RAPD 的反應(yīng)因素進(jìn)行改善，從而保證整體的穩(wěn)定性。例如，通過對(duì)3 種不同種類的麥冬DNA 基因組進(jìn)行RAPD分析，然后針對(duì)其中的特異性分子進(jìn)行特殊標(biāo)記[2]，再對(duì)這些標(biāo)記進(jìn)行克隆與測(cè)序，以期發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致3 種麥冬有所差異的特異性PCR 引物，最終完成特異性檢驗(yàn)[3]。

4.3 位點(diǎn)特異性PCR技術(shù)

這種技術(shù)別名擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)， 是一種以單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)為基礎(chǔ)的基因分型法，這種方法的顯著特征在于通過單個(gè)PCR 反應(yīng)即可檢測(cè)真?zhèn)?，操作過程十分快速。 黎潔文[4]首創(chuàng)了何首烏位點(diǎn)特異性PCR 的分子鑒別法， 具體操作流程是：（1）對(duì)何首烏、何首烏近緣種和混淆品ITS2 序列進(jìn)行變異分析，從中尋找表現(xiàn)出穩(wěn)定差異的變異位點(diǎn)，以此為背景，設(shè)立特異性引物；（2）確定引起PCR 反應(yīng)的各項(xiàng)因素；（3）使用平板凝膠電泳，并且突破性地采用了毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)特異性PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物。

4.4 ISSR 技術(shù)（分子標(biāo)記技術(shù)）

這種技術(shù)屬于新型的分子標(biāo)記技術(shù)，也被稱為錨定簡(jiǎn)單序列重復(fù)技術(shù)，其特征在于重復(fù)性好、具有較高的多態(tài)性。雖然此技術(shù)的發(fā)展時(shí)間較短，但是卻在中藥檢驗(yàn)方面得到了大量的推廣。 該項(xiàng)技術(shù)將錨定微衛(wèi)星DNA 看作引物，在使用PCR技術(shù)時(shí)，錨定引物可以使特定位點(diǎn)退火， 以使與其互補(bǔ)間隔較近的重復(fù)序列間DNA 片段得以實(shí)現(xiàn)PCR 擴(kuò)增。 相關(guān)人員可以借助ISSR 技術(shù)對(duì)雞血藤及其混偽品進(jìn)行檢驗(yàn)[5]，流程是：選出5 條ISSR 隨機(jī)引物，然后擴(kuò)增雞血藤和混偽品的重復(fù)序列間DNA 片段，此時(shí)二者的DNA 指紋圖譜顯現(xiàn)出了較多不同，可以以此作為檢測(cè)結(jié)果的依據(jù)， 這種方法也實(shí)現(xiàn)了雞血藤的分子水平級(jí)檢測(cè)。 除此之外，通過多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)也可以發(fā)現(xiàn)，ISSR 技術(shù)在檢驗(yàn)中的遺傳變異靈敏度方面明顯優(yōu)于RAPD 技術(shù)[6]。因此，ISSR 技術(shù)更適合分析不同居群雞血藤的遺傳多樣性。

5 PCR技術(shù)在中藥檢驗(yàn)中的缺陷

（1）分子生物難以被肉眼所見，所以需要以大量的實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，以此完成方法可行性實(shí)驗(yàn)。在此過程中，還要對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不斷優(yōu)化，并且，相關(guān)工作人員須具備過硬的專業(yè)技術(shù)。 （2）中藥的產(chǎn)地較多，種植方法有所差異；另外，在栽培時(shí)還可能會(huì)出現(xiàn)變異等特殊情況。 以上種種因素都會(huì)對(duì)標(biāo)記法的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性造成影響，所以，將PCR技術(shù)用于實(shí)際檢驗(yàn)前，需要借助大量實(shí)驗(yàn)品作為理論驗(yàn)證基礎(chǔ)。 （3）中藥檢驗(yàn)行業(yè)的未來發(fā)展特點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)，但現(xiàn)今所使用的多數(shù)分子標(biāo)記法仍以提取中藥DNA、進(jìn)行PCR 擴(kuò)增以及電泳檢測(cè)等步驟為前提，耗時(shí)較長(zhǎng)，難以適應(yīng)中藥檢驗(yàn)的未來發(fā)展趨勢(shì)。（4）某些中藥可能會(huì)存在次生代謝產(chǎn)物，進(jìn)而對(duì)DNA 的提取造成影響，或者某些經(jīng)過炮制的中藥，同樣也會(huì)不利于DNA 的提取。

6 PCR技術(shù)在中藥檢驗(yàn)方面的未來展望

伴隨著科技的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)憑借自身應(yīng)用范圍廣泛、多樣化的研究方向等優(yōu)勢(shì)，擁有著巨大的發(fā)展?jié)摿?。并且，這項(xiàng)技術(shù)在藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域中已經(jīng)得到了較多應(yīng)用，現(xiàn)在已經(jīng)有許多以PCR 為基礎(chǔ)的技術(shù)應(yīng)用于中藥檢驗(yàn)之中。與此同時(shí)，人們也應(yīng)努力改善上文所述的缺陷，以期推進(jìn)PCR技術(shù)在中藥檢驗(yàn)領(lǐng)域的發(fā)展。

7 結(jié)語

綜上所述，中藥對(duì)維護(hù)人們身體健康發(fā)揮著不容小覷的作用，但中藥市場(chǎng)還存在著售假以及藥材質(zhì)量各不相同的情況，應(yīng)依據(jù)中藥的不同特性選取不同方法進(jìn)行檢驗(yàn)。