腺病毒載體用于動(dòng)脈粥樣硬化基因治療的研究進(jìn)展

王琳 張珂欣 劉艷穩(wěn) 冷吉燕 秦俊杰

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

除了大約20年前進(jìn)行的一項(xiàng)關(guān)于低密度脂蛋白受體基因預(yù)防家族性高膽固醇血癥患者早期動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)實(shí)驗(yàn)〔1〕，目前對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的基因治療仍然停留在臨床前階段。潛在的動(dòng)脈粥樣硬化基因治療包括操縱血漿脂蛋白通過(guò)基因轉(zhuǎn)移到肝臟和直接基因轉(zhuǎn)移到血管壁防止或逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化病變生長(zhǎng)。本文將探討腺病毒載體用于動(dòng)脈粥樣硬化基因治療的研究進(jìn)展。

1 腺病毒介導(dǎo)的靜脈移植治療動(dòng)脈粥樣硬化

多年以來(lái)，心血管疾病一直是導(dǎo)致死亡、殘疾的最主要原因，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心臟病〔2,3〕。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率和死亡率最主要原因是累及冠狀動(dòng)脈，其中內(nèi)膜脂質(zhì)和炎性細(xì)胞的積累導(dǎo)致管腔狹窄、血流減少、血栓性閉塞，并伴有胸痛、心肌梗死、心力衰竭和猝死等相關(guān)癥狀〔4〕。盡管經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(如血管成形術(shù)和支架植入)取得了進(jìn)展，但冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)仍然是治療嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈疾病的主要方法〔5～7〕。因此，各個(gè)國(guó)家每年均仍有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的CABG手術(shù)〔8〕。然而，構(gòu)建CABG的大隱靜脈段的高閉塞率卻限制了CABG的長(zhǎng)期益處。CABG靜脈移植通暢率1年估計(jì)為80%，10年估計(jì)為50%〔9，10〕。

目前用于預(yù)防移植靜脈粥樣硬化的藥物主要為降脂藥物，以他汀類(lèi)藥物為代表〔11〕。他汀類(lèi)藥物在絕大多數(shù)CABG受者中都有應(yīng)用，然而，沒(méi)有證據(jù)表明廣泛使用他汀類(lèi)藥物會(huì)增加靜脈移植的通暢率，也有證據(jù)表明通暢率正在下降〔12〕。此外，他汀類(lèi)藥物治療僅在一定程度上是有效的：他汀類(lèi)藥物誘導(dǎo)低密度脂蛋白膽固醇降低到<100 mg/dl，可增加移植血管通暢；然而，進(jìn)一步降低到<70 mg/dl，則沒(méi)有額外的好處〔13〕。移植靜脈粥樣硬化可通過(guò)動(dòng)脈旁路移植而避免，如左胸內(nèi)動(dòng)脈10年通暢率>95%。然而，任何一個(gè)CABG患者只有一個(gè)左側(cè)胸內(nèi)動(dòng)脈，但幾乎所有的CABG患者都需要超過(guò)1個(gè)旁路血管。與僅使用左胸內(nèi)動(dòng)脈和靜脈移植相比，使用左胸內(nèi)動(dòng)脈和右胸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)行旁路移植術(shù)并不能改善心血管結(jié)果，而且與胸骨傷口感染顯著增加有關(guān)〔14〕。橈動(dòng)脈偶爾也被用作CABG導(dǎo)管；然而，他們的長(zhǎng)期通暢率和相關(guān)的臨床結(jié)果并不優(yōu)于靜脈移植〔15〕。

如今，很多專(zhuān)家提出了基因療法，作為一種很有前途的方法預(yù)防靜脈移植物粥樣硬化〔16，17〕?；蛑委熿o脈移植物粥樣硬化將包括在移植物本身中表達(dá)一種治療性基因，該基因被選擇用于防止脂質(zhì)積聚、炎癥或血管重構(gòu)，這些因素被證實(shí)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化快速發(fā)展的原因〔18〕。然而，動(dòng)脈粥樣硬化的基因治療進(jìn)展長(zhǎng)期受到轉(zhuǎn)基因持久表達(dá)需要的限制，而這一點(diǎn)可能是預(yù)防疾病進(jìn)展發(fā)展的必要條件。最近有報(bào)道表明，用輔助病毒依賴(lài)型腺病毒載體(HDAd)轉(zhuǎn)導(dǎo)的兔靜脈移植至少在24 w內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因表達(dá)，4 w后穩(wěn)定表達(dá)〔19〕。用同樣HDAd轉(zhuǎn)導(dǎo)的家兔動(dòng)脈達(dá)到轉(zhuǎn)基因表達(dá)至少需要48 w，穩(wěn)定表達(dá)仍需4 w〔20〕。因?yàn)镠DAd似乎能夠介導(dǎo)血管中轉(zhuǎn)基因的持久表達(dá)，所以HDAd是一種很有前途的載體，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于血管移植物粥樣硬化的基因治療。

2 腺病毒載體介導(dǎo)的前胸腺素-α基因轉(zhuǎn)染抑制動(dòng)脈粥樣硬化

氧化應(yīng)激是由于抗氧化劑減少或活性氧(ROS)過(guò)量生成造成的，被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙的發(fā)病機(jī)制和動(dòng)脈粥樣硬化起始與進(jìn)展的主要機(jī)制。清除血管內(nèi)ROS并抑制一氧化氮(NO)降解的防御機(jī)制包括酶促過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以及非酶促低分子團(tuán)。NO是主要的血管擴(kuò)張劑，是通過(guò)內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)合成的。超氧化物通過(guò)與血管NO反應(yīng)或減少血管NO生物利用度來(lái)促進(jìn)細(xì)胞損傷。由于超氧化物的血管水平受SOD調(diào)控，因此，SOD基因在心血管疾病中的作用具有重要意義。

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白(Keap)1和核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2是氧化應(yīng)激的重要細(xì)胞傳感器。在無(wú)應(yīng)激細(xì)胞中，Nrf2通過(guò)與抑制蛋白Keap1結(jié)合被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，然后通過(guò)蛋白酶體系統(tǒng)被降解。在暴露于親電性與氧化應(yīng)激下，Nrf2從Keap1中釋放，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與Maf形成雜二聚體，并與抗氧化反應(yīng)元件(AREs)結(jié)合，調(diào)控ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)。之前有研究表明，前胸腺素α(ProT)能夠?qū)rf2從Nrf2-Keap1抑制復(fù)合物中釋放出來(lái)，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激保護(hù)基因的表達(dá)。ProT是一種高酸性的小蛋白質(zhì)，分布在多種組織的細(xì)胞核中，在哺乳動(dòng)物中高度保存。許多研究〔21，22〕都顯示了ProT的免疫調(diào)節(jié)功能，包括增強(qiáng)人類(lèi)主要組織相容性抗原(MHC)Ⅱ類(lèi)表面抗原在抗原遞呈細(xì)胞上的表達(dá)及人類(lèi)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此外，ProT可能對(duì)轉(zhuǎn)錄有更廣泛的影響，它影響特定轉(zhuǎn)錄因子的活性，包括雌激素受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Stat)3。

在一些研究〔23〕中，人們使用表達(dá)ProT(指定AdProT)的腺病毒檢測(cè)ProT基因轉(zhuǎn)染對(duì)抗氧化基因表達(dá)的影響，從而研究ProT介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞在體外和體內(nèi)氧化損傷的保護(hù)作用。

3 腺病毒載體介導(dǎo)的鞘磷脂合成酶2增加動(dòng)脈粥樣硬化損傷

鞘磷脂(SM)參與了許多重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞膜的形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)代謝，這些都與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展有關(guān)。SM是主要的磷脂之一。血漿膜SM和SM/(PC)比值是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；此外，這些脂質(zhì)在人類(lèi)和動(dòng)物模型的動(dòng)脈粥樣瘤中積累。先前的研究〔24〕表明，從人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化病灶中提取的低密度脂蛋白(LDL)富含SM，載脂蛋白(Apo)E基因敲除小鼠的血漿SM水平比野生型小鼠高4倍，這可能在一定程度上解釋了這些小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的增加。血膽固醇高的家兔的極低密度脂蛋白(VLDL)中SM水平增加了5倍。作為SPT的抑制劑(SM生物合成途徑的第一關(guān)鍵酶)，肉豆蔻素的使用顯著降低了ApoE 敲除小鼠的血漿SM水平和動(dòng)脈粥樣硬化病變。這些數(shù)據(jù)表明，升高的血漿SM水平可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。鞘磷酸酶(SMS)是SM生物合成的最后一種酶，具有SMS1和SMS2兩種亞型。有實(shí)驗(yàn)表明，SMS1和SMS2的過(guò)表達(dá)增加了小鼠的脂蛋白動(dòng)脈粥樣硬化潛能，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。動(dòng)脈粥樣硬化是由動(dòng)脈粥樣硬化性脂蛋白與動(dòng)脈壁相互作用引起的，許多過(guò)程都與早期的動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。其中，脂蛋白的保留和聚集是關(guān)鍵步驟。近年來(lái)有研究〔25〕生成含有人類(lèi)SMS2 cDNA和綠色熒光蛋白(GFP)cDNA的重組腺病毒載體，并將重組腺病毒載體靜脈輸注給ApoE基因敲除小鼠，結(jié)果表明，SMS2過(guò)表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化形成中發(fā)揮一定的作用，并且提供了直接的形態(tài)學(xué)證據(jù)，表明SMS活性升高可以促進(jìn)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。

4 前蛋白轉(zhuǎn)化酶/枯草桿菌蛋白酶9型編碼重組腺相關(guān)病毒載體誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成

動(dòng)脈粥樣硬化可通過(guò)生殖系基因工程在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致高膽固醇血癥，但這類(lèi)模型局限于少數(shù)物種和菌株，很難與涉及基因操縱或變異的其他強(qiáng)大技術(shù)相結(jié)合。為了建立無(wú)種系遺傳工程的動(dòng)脈粥樣硬化的誘導(dǎo)方法，近年來(lái)有研究將設(shè)計(jì)重組腺相關(guān)的病毒載體用于編碼功能獲得性前蛋白轉(zhuǎn)化酶/枯草桿菌蛋白酶9型突變體，并給予小鼠靜脈注射載體，然后進(jìn)行高脂飲食喂養(yǎng)。結(jié)果表明：?jiǎn)我蛔⑸淝暗鞍邹D(zhuǎn)化酶/枯草桿菌蛋白酶9型編碼重組腺相關(guān)病毒載體是一種快速、通用的動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化誘導(dǎo)方法〔26〕。這種方法對(duì)于高通量或涉及遺傳技術(shù)、毒株或與現(xiàn)有的基因工程模型不能很好結(jié)合的物種的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚱鸬街匾饔谩?/p>

近些年來(lái)，腺病毒載體在動(dòng)脈粥樣硬化基因治療的應(yīng)用上確實(shí)取得了顯著的進(jìn)展。隨著對(duì)腺病毒分子生物學(xué)研究的進(jìn)一步深入及人們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的全面了解，在未來(lái)必將有滿(mǎn)足需要的腺病毒載體引入臨床，為心血管系統(tǒng)疾病的治療提供新思路。