乙酰肝素酶靶向治療心肌梗死的前景

曹洪帥 馬俊彪 韓軒茂

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙 包頭 014040)

乙酰肝素酶(HPSE)是一種內(nèi)切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一可以切割細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素側(cè)鏈的酶，參加細(xì)胞外重塑。HPSE涉及多種生理過(guò)程如胚胎植入，組織修復(fù)和炎癥過(guò)程；病理致病過(guò)程主要包括腫瘤的進(jìn)展和腎臟疾病。HPSE在多種惡性腫瘤病理發(fā)展過(guò)程中呈現(xiàn)高表達(dá)、高活性狀態(tài)，有可能成為一個(gè)抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)〔1〕。本文探討HPSE在心肌缺血再灌注(I/R)損傷發(fā)病中的作用，及可能的分子機(jī)制，為今后心肌梗死的監(jiān)測(cè)、治療及預(yù)后評(píng)估開辟新方向，具有重要的基礎(chǔ)及臨床意義。

1 HPSE的認(rèn)識(shí)

硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖(HSPGs)在血管生物學(xué)中的廣泛發(fā)生，1999年Vlodavsky等〔2〕通過(guò)提純HPSE分離得到HPSE基因，該基因通過(guò)肝素結(jié)合型堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的活化，誘導(dǎo)血管生成。HSPGs通過(guò)聯(lián)合結(jié)構(gòu)、生化及其調(diào)控等不同機(jī)制發(fā)揮多重功能作用，通過(guò)與其他大分子如層黏蛋白、纖維蛋白和膠原Ⅰ、Ⅳ相互作用，有助于細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的結(jié)構(gòu)完整性、自我排列及不可溶性，可密切調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，參加細(xì)胞外重塑。HPSE mRNA編碼65 kD前體酶，經(jīng)翻譯后切割成非共價(jià)締合以形成活性HPSE的8 kD和50 kD亞基。HPSE結(jié)構(gòu)中含有酶的活性位點(diǎn)和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，及HPSE分泌和信號(hào)傳導(dǎo)功能至關(guān)重要的C-末端結(jié)構(gòu)域。HS的生物合成在高爾基體系中進(jìn)行，HS鏈的合成和修飾需要一系列酶的活性，但哺乳動(dòng)物HS的降解主要由一種酶——HPSE進(jìn)行，其將HS側(cè)鏈切割成10～20糖單位的片段。隨后的研究表明，HPSE參與各種病癥如癌癥，慢性炎癥，動(dòng)脈粥樣硬化和腎功能障礙等的發(fā)病與進(jìn)展〔3〕。這些研究最有價(jià)值的成果就是，HPSE從一種不太了解功能的模糊酶發(fā)展成為一些腫瘤疾病的藥物靶點(diǎn)，為腫瘤疾病的治療及預(yù)后評(píng)估開辟新方向，拓寬了HPSE抑制劑在其他領(lǐng)域的臨床應(yīng)用范圍，具有重要的基礎(chǔ)及臨床意義。

2 HPSE對(duì)疾病的影響

鑒于HS的功能多樣性，HPSE的降解深刻影響著重要的病理生理過(guò)程，包括腫瘤發(fā)展，新生血管形成和炎癥，糖尿病及腎臟疾病的進(jìn)展。肝素酶介導(dǎo)的降解和隨后的腎小球細(xì)胞中HS的重塑是腎小球疾病發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。血管是一種高度活躍的結(jié)構(gòu)，其形態(tài)可以在系統(tǒng)和局部變化下做出快速調(diào)節(jié)適應(yīng)并維持血管功能。在一些病灶中如再狹窄、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化，這種正常有益的適應(yīng)可能對(duì)整體功能有害。HPSE依賴對(duì)動(dòng)脈結(jié)構(gòu)力學(xué)和修復(fù)的酶學(xué)的獨(dú)立作用密切調(diào)節(jié)血管內(nèi)支架術(shù)后的動(dòng)脈順應(yīng)性和新生內(nèi)膜增生。此外，HPSE促進(jìn)血管損傷后的血栓形成，并有助于人類頸動(dòng)脈粥樣硬化中的促凝血狀態(tài)。重要的是，HPSE與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān)，包括對(duì)不穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)變穩(wěn)定。因此，急性心肌梗死患者血漿中HPSE水平明顯升高，有可能作為急性心臟病診斷標(biāo)記和潛在的藥物治療靶點(diǎn)〔4〕。HPSE誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生機(jī)制尚未完全明了，但包括toll樣受體(TLRs)，TLRs是I型轉(zhuǎn)膜蛋白的一個(gè)家族，結(jié)合一系列細(xì)菌產(chǎn)物，通過(guò)核因子(NF)-κB激活促炎性介質(zhì)〔5〕。HPSE誘導(dǎo)細(xì)胞因子似乎涉及TLR-2、TLR-4、和NF-κB。HPSE經(jīng)TLR激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)：許多研究顯示，炎癥在冠狀動(dòng)脈疾病中起關(guān)鍵作用?；罨拿庖呒?xì)胞在斑塊破裂處密集存在，產(chǎn)生大量的炎癥分子和蛋白水解酶，促使穩(wěn)定斑塊向易損、不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化〔6〕。HPSE，NF-κB和熱休克蛋白(Hsp)70基因表達(dá)參與三硝基苯磺酸(TNBS) 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，代表腸道抗炎藥物的藥理學(xué)靶點(diǎn)〔7〕。

HPSE表達(dá)在正常上皮細(xì)胞中是罕見(jiàn)的，但通常在腫瘤中誘導(dǎo)，在各種類型的癌癥(包括宮頸癌)中升高，與預(yù)后不良相關(guān)。異種移植小鼠模型用于研究體內(nèi)HPSE輻射調(diào)節(jié)劑的作用，輻射后的集落形成測(cè)定以比較對(duì)照HPSE敲低和HPSE過(guò)表達(dá)HeLa細(xì)胞之間的輻射響應(yīng)。檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1，堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的mRNA和蛋白水平作為HIF1通路活性的指標(biāo)。研究結(jié)果表明，HPSE是體內(nèi)和體外輻射反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)劑〔8〕。

在糖尿病，心臟對(duì)產(chǎn)生能量的脂肪酸(FA)具有單一依賴性，通過(guò)分解循環(huán)甘油三酸酯的冠狀動(dòng)脈脂蛋白脂肪酶(LPL)來(lái)實(shí)現(xiàn)。冠狀動(dòng)脈LPL源于心肌細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到血管腔，該酶需要從肌細(xì)胞表面HSPGs中釋放出來(lái)，這是慢性高血糖后需要持續(xù)的活性。有研究表明，在肝素酶過(guò)表達(dá)(HPA-tg)的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)HPSE可以改善葡萄糖體內(nèi)平衡。除了胰島組成和結(jié)構(gòu)的變化之外，HPSE過(guò)量表達(dá)與增加的葡萄糖刺激的胰島素分泌和高胰高血糖素血癥有關(guān)。引人注目的是，與野生型相比，在給予單次高劑量鏈脲佐菌素(STZ)的動(dòng)物使胰島B細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致相關(guān)的高血糖嚴(yán)重和快速發(fā)展的模型中，HPA-tg小鼠顯著降低血糖，揭示使用HPSE在糖尿病管理中的可行性機(jī)會(huì)〔9〕。

3 HPSE的調(diào)控表達(dá)

3.1調(diào)控相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3.1.1絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，尤其是在細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程中，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同作用部位。MAPK被激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，使一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化，改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的狀態(tài)。另外，它也可以使一些其他的酶發(fā)生磷酸化，活性發(fā)生改變。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在的重要MAPK亞家族主要包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)，c-Jun N-末端激酶/應(yīng)激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38MAPK。

近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，HPSE可以通過(guò)影響MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡化與侵襲過(guò)程。Nadir〔10〕發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在HPSE過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，由于HPSE過(guò)表達(dá)導(dǎo)致MAPK被激活，激活MAPK后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，使發(fā)生磷酸化，改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的狀態(tài)。另外，它也可以使一些其他的酶發(fā)生磷酸化、活性發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲因子的增強(qiáng)。說(shuō)明可以通過(guò)抑制HPSE的表達(dá)從而阻斷MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為抑制腫瘤細(xì)胞的惡化與侵襲提供新的方向。

3.1.2磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑 PI3K不僅有抗凋亡作用而且是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。HPSE過(guò)表達(dá)后，PI3K通過(guò)其p85亞單位與活化的受體結(jié)合，使其p110亞單位被受體磷酸化而活化。PI3K可催化三磷酸肌醇(PIP3)的產(chǎn)生。PIP3產(chǎn)生后，通過(guò)結(jié)合蛋白激酶(PK)B的PH結(jié)構(gòu)域，將其錨定于質(zhì)膜而活化。PKB是原癌基因c-Akt的產(chǎn)物，故又稱為Akt。PKB可磷酸化多種蛋白，最終結(jié)果就是組織細(xì)胞凋亡，引起血管生成，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。破壞HPSE C-末端結(jié)構(gòu)域或抑制HPSE的表達(dá)均可以降低Akt的磷酸化水平，起到抑制腫瘤病情進(jìn)展的作用。

3.2HPSE的調(diào)控 腫瘤缺氧時(shí)，可以激活HPSE，HPSE高表達(dá)過(guò)程或參與了對(duì)其活性的調(diào)控。HPSE的生理活性與環(huán)境pH密切相關(guān)，最佳表達(dá)活性pH為5.5～5.8，這時(shí)HPSE發(fā)揮其酶活性，結(jié)合HS。當(dāng)pH>7.0時(shí)，HPSE的酶活性被其黏附活性所取代，無(wú)法發(fā)揮酶切作用。當(dāng)pH下降，如炎癥時(shí)，HPSE則可發(fā)揮其酶活性，裂解它所連接的HSPG，釋放白細(xì)胞，并促發(fā)炎癥反應(yīng)〔11〕。

HPSE啟動(dòng)子區(qū)域富含GC結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合相關(guān)的調(diào)控因子調(diào)節(jié)HPSE的表達(dá)。另外HPSE還存在甲基化位點(diǎn)，啟動(dòng)子的甲基化可以抑制HPSE的表達(dá)，而DNA的去甲基化可以上調(diào)HPSE的表達(dá)水平。簡(jiǎn)言之，HPSE的表達(dá)調(diào)控在轉(zhuǎn)錄水平主要通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和甲基化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

凡可以與HPSE啟動(dòng)子區(qū)所含的核心基序GGGCGG結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，都可以調(diào)控HPSE的表達(dá)，其中早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因(EGR1)，轉(zhuǎn)錄因子Sp1，NF-κB，E-twenty six轉(zhuǎn)錄因子(ETs)家族因子 (ETs1 和 ETs2) 等對(duì)HPSE的表達(dá)起正向調(diào)節(jié)作用，此外還包括由雌二醇和葡萄糖通路所誘導(dǎo)的部分轉(zhuǎn)錄因子；而抑癌基因 p53 和 DNA 甲基化可抑制HPSE的轉(zhuǎn)錄，是HPSE表達(dá)的負(fù)向調(diào)控因子。

近年來(lái)在Hao等〔12〕研究中，首次報(bào)道肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)調(diào)節(jié)HPSE表達(dá)以促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)HGF和HPSE在58例胃癌患者中顯著表達(dá)。 而且HGF和HPSE的高表達(dá)與TNM期，侵襲深度和預(yù)后差呈正相關(guān)。在MKN74細(xì)胞中，外源性HGF在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯著增加HPSE表達(dá)。

MicroRNAs(miRNAs) 是一類保守的非編碼單鏈 RNA，約8～25 個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶基因 mRNA 互補(bǔ)位點(diǎn)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA-558在HPSE啟動(dòng)子中識(shí)別出其互補(bǔ)位點(diǎn)，以降低SMAD家族成員SMAD 4在Argonaute 1-依賴性方式的結(jié)合。有實(shí)驗(yàn)表明〔13〕，miR-558通過(guò)減弱SMAD4介導(dǎo)的HPSE表達(dá)抑制來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的體外和體內(nèi)腫瘤發(fā)生和侵襲性。在臨床胃癌標(biāo)本中，miR-558的上調(diào)和SMAD4的下調(diào)與HPSE表達(dá)呈正相關(guān)。

4 HPSE在I/R模型中的影響

盡管HPSE聚糖在血管生物學(xué)中的廣泛發(fā)生和影響，但HPSE在血管壁疾病中的意義被低估。有研究顯示，血液和動(dòng)脈組織HPSE過(guò)度表達(dá)，在急性冠脈綜合征(ACS)發(fā)病中起雙重作用，協(xié)同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血管內(nèi)血栓形成〔3〕。幾項(xiàng)研究表明，HPSE的過(guò)度表達(dá)及其對(duì)HSPGs的破壞可能是許多與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的原因，特別是導(dǎo)致慢性腎臟疾病，動(dòng)脈粥樣硬化和ACS〔14〕。

心肌I/R損傷是指缺血心肌在恢復(fù)灌注以后，病情反而加重，引起的心肌超微結(jié)構(gòu)的不可逆性改變，造成心肌功能、代謝及電生理方面的進(jìn)一步損傷。心肌I/R損傷常見(jiàn)的機(jī)制有Ca2+超載、氧化應(yīng)激、凋亡與自噬等，一些微小RNA及TLRs等也參與其中，這些機(jī)制相互聯(lián)系，相互作用。心肌纖維化，又稱為心肌鈣化，是由中、重度的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續(xù)性和(或)反復(fù)加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的結(jié)果，導(dǎo)致逐漸發(fā)展為心力衰竭。

有資料顯示〔15〕，I/R是急性腎衰竭和延遲移植功能的重要原因，可通過(guò)激活腎小管細(xì)胞的上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)而誘導(dǎo)慢性腎損傷，HPSE在其中可能具有重要的作用。在WT和HPA-tg小鼠中誘導(dǎo)急性缺血。將WT和HPA-tg小鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg，皮下注射)麻醉，并置于受控加熱(溫度調(diào)節(jié))臺(tái)上，保持體溫在37℃。暴露右側(cè)和左側(cè)腎動(dòng)脈并夾持30 min，在此期間腎臟保持溫暖和潮濕。然后取出夾子，觀察腎臟血流返回，并縫合腹壁切口。使小鼠在溫暖的籠中恢復(fù)48和72 h，并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得血液樣品以測(cè)量肌酸酐。所有小鼠通過(guò)吸入CO2然后頸脫位處死。收獲腎并稱重。除了腎動(dòng)脈夾緊之外，進(jìn)行相同操作的假手術(shù)小鼠作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)I/R在動(dòng)物模型中引起HPSE上調(diào)，過(guò)表達(dá)HPSE的小鼠活化EMT，與野生型相比，HPA-tg動(dòng)物對(duì)腎功能損傷更敏感。總的來(lái)說(shuō)，研究結(jié)果表明HPSE是I/R誘導(dǎo)EMT的發(fā)展的關(guān)鍵因素，其抑制可能代表一種新的有價(jià)值的治療方法，以最小化預(yù)防纖維化。

5 HPSE的靶向治療進(jìn)展

綜上，HPSE的表達(dá)與腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移有著密不可分的聯(lián)系，理論上通過(guò)抑制HPSE的活性可以降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性和侵襲力，為臨床上，控制腫瘤的轉(zhuǎn)移開辟新的途徑?；谛蛄蟹治?，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和誘變分析，通過(guò)研究HPSE水解五糖底物磺達(dá)肝素的光譜，表明HPSE以保留配體的形式水解其底物，因此HPSE被確定為保留糖苷酶〔16〕。目前，HPSE抑制劑的研究取得了突破性進(jìn)展〔17〕，主要來(lái)源于多糖化學(xué)修飾、高通量的天然產(chǎn)物，一方面可以降解HPSE，另一方面可以抑制HPSE的表達(dá)，尤其是HS類似物-PI88已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，且在研究階段志愿者身上呈現(xiàn)出較好的耐受性和療效。PI88不僅是HPSE的抑制劑，也是血管生成因子VEGF的阻抗因子，達(dá)到抗血管生成的目的，最終阻滯腫瘤的發(fā)展。

Singh等〔18〕使用APC Min+/-小鼠模型提供證據(jù)表明，HPSE下調(diào)了p21 WAF1/CIP1的表達(dá)，p21表達(dá)的下調(diào)增加了HPSE新出現(xiàn)的促致癌性質(zhì)的新特征。值得注意的是PG545是有效的HPSE抑制劑，該化合物有效降低細(xì)胞增殖，集落形成和腫瘤異種移植物生長(zhǎng)，與p21表達(dá)明顯增加相關(guān)。PG545有效誘導(dǎo)p21使其抗腫瘤作用表現(xiàn)樂(lè)觀。

隨著免疫學(xué)與分子生物學(xué)的快速發(fā)展，針對(duì)HPSE的免疫治療和基因治療研究也取得了顯著成果。HPSE 僅在腫瘤組織、淋巴組織中存在表達(dá)，提示我們可以研究一種廣譜的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗體拮抗HPSE達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。有研究表明，誘導(dǎo)多肽抗體生成可以有效地降低肝癌細(xì)胞的 HPSE 活性，從而降低了肝癌細(xì)胞的侵襲能力，為研究抗 HPSE 抗體和臨床使用的疫苗提供了新的理論依據(jù)。在基因治療水平方面，Parish等〔19〕發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶與活化的Jurkat T細(xì)胞中數(shù)百種基因和微RNA的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄區(qū)域相互作用，并且上調(diào)許多靶基因/微RNA。在分子水平上，通過(guò)影響去甲基化酶對(duì)轉(zhuǎn)錄活性基因的募集，核肝素酶似乎調(diào)節(jié)組蛋白3賴氨酸(H3K)4甲基化?？傮w上通過(guò)miRNA與HPSE啟動(dòng)因子的mRNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)信號(hào)通路，下調(diào)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，阻止腫瘤轉(zhuǎn)移。

6 展 望

目前，多數(shù)研究集中于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病人HPSE在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成與發(fā)展中的作用以及體內(nèi)HPSE表達(dá)水平對(duì)惡性腫瘤嚴(yán)重程度的影響。而心肌細(xì)胞凋亡和纖維化、心肌細(xì)胞肥大等心肌組織重構(gòu)方面的研究比較少，尤其是對(duì)于嚴(yán)重影響人類健康、具有較高的再住院率和致死率的心力衰竭在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中心肌細(xì)胞負(fù)性重構(gòu)的研究少有報(bào)道。我們借助乙酰肝素酶及其相關(guān)因子在白血病中表達(dá)水平的研究經(jīng)驗(yàn)〔20〕，采用多種研究方法，研究患者全身及血小板HPSE與心肌I/R的相關(guān)性；重點(diǎn)研究HPSE對(duì)心肌細(xì)胞的纖維化和凋亡的影響，探討HPSE在心肌I/R損傷發(fā)病中的作用，及可能的分子機(jī)制，為今后心力衰竭的監(jiān)測(cè)、治療及預(yù)后評(píng)估開辟新方向，拓寬在其他領(lǐng)域中，HPSE阻滯劑臨床應(yīng)用范圍，具有重要的基礎(chǔ)及臨床意義。