白血病小鼠模型的建立與應(yīng)用進(jìn)展

馬暢，郭健敏，謝松強(qiáng)，楊威*

(1. 廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260； 2. 河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475000； 3. 廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510990)

1 白血病的分類和發(fā)病機(jī)制

急性白血病是由造血干/祖細(xì)胞在分化過(guò)程的不同階段發(fā)生分化阻滯、凋亡障礙、惡性增殖而引起的一組異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，分為急性淋巴細(xì)胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)兩大類。隨著深入的研究發(fā)現(xiàn)急性白血病的發(fā)病機(jī)制有多種因素，基因重組、突變、DNA甲基化和組蛋白修飾等都具有重要影響。目前對(duì)于一些信號(hào)通路的研究更加明確ALL的發(fā)病機(jī)制，如BCR-ABL1、JAK/STAT、Notch信號(hào)通路、FLT3-TKD 途徑及MLL 基因重排、PTEN抑瘤基因等與ALL發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)。AML 的主要發(fā)病機(jī)制包括融合基因、信號(hào)通路、白血病干細(xì)胞以及骨髓微環(huán)境的改變等，如MLL(KMT2A)-AF9 (MLLT3)、PML-RARαAML1 (RUNX1)-ETO(RUNX1T1)融合基因和Wnt/β-catenin、PI3-K/Akt/m TOR、NF-κB、JAK/STAT信號(hào)通路等，在造血細(xì)胞的增殖、分化、凋亡方面起著關(guān)鍵的作用。

慢性白血病分為慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)。CML的特征是費(fèi)城染色體陽(yáng)性(Ph+)髓樣細(xì)胞的積累，Ph+細(xì)胞通過(guò)染色體9和22長(zhǎng)臂之間的相互易位發(fā)生，形成BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL融合蛋白編碼的P210融合蛋白是導(dǎo)致CML發(fā)生和進(jìn)展的根本原因，也是重要的治療靶點(diǎn)，當(dāng)P210融合蛋白與ATP結(jié)合后，激活了RAS-MAPK、JAK/STAT、PI3K/AKT等信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快、凋亡受到抑制等，從而引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。CLL是以成熟B淋巴細(xì)胞增殖為特點(diǎn)，發(fā)病機(jī)制與CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫調(diào)節(jié)失衡、mi RNAs基因的失調(diào)以及BCR、NF-κB、NOTCH、Wnt/β-catenin 等一些信號(hào)通路的表達(dá)異常等有關(guān)。

2 小鼠白血病模型的分類

2.1 自發(fā)性小鼠白血病

某些品系小鼠在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)自發(fā)性產(chǎn)生白血病。如6 ～ 9月齡AK小鼠的白血病發(fā)病率可達(dá)60% ～ 90%，多為胸腺來(lái)源的淋巴細(xì)胞白血病。C58小鼠在6個(gè)月后發(fā)病率85%以上，多為淋巴細(xì)胞白血病。

2.2 誘發(fā)性小鼠白血病

2.2.1 病毒誘發(fā)

有多種病毒可誘發(fā)白血病，如HTLV-1病毒和Friend病毒。Tezuka等[1]用HTLV-1感染IBMI-huNOG小鼠(一種新型的人源化小鼠，利用IBMI方法將人干細(xì)胞直接移植到NOD/Shi-SCID/IL-2Rγc NULL小鼠的骨髓腔內(nèi))，接種后4 ～ 6周，其成人T細(xì)胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)樣癥狀開始表現(xiàn)，包括肝脾腫大、HTLV-1感染T細(xì)胞的克隆增殖、外周血涂片有白血病細(xì)胞的出現(xiàn)，表明HTLV-1感染的IBMI-huNOG小鼠產(chǎn)生了成人T細(xì)胞白血病。許思苗等[2]利用含MLL-AF9的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠骨髓c-Kit+細(xì)胞，體外培養(yǎng)后經(jīng)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)，于6 ～ 12周出現(xiàn)白血病樣體征，肝、脾組織切片、外周和骨髓血涂片均顯示有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，小鼠發(fā)生髓系白血病。

2.2.2 化學(xué)致癌劑誘發(fā)

一些化學(xué)物質(zhì)可以誘發(fā)白血病，如經(jīng)常接觸苯及其衍生物的人群白血病發(fā)生率高于一般人群。苯可導(dǎo)致白血病和各種血液疾病的血液毒性。Sun等[3]應(yīng)用苯誘發(fā)雄性C3H/He小鼠產(chǎn)生血液毒性，4周后體重出現(xiàn)明顯差異，小鼠紅細(xì)胞、白細(xì)胞等均發(fā)生改變。Khan等[4]用1∶10稀釋苯溶液(氯仿/2-丙醇[50/50]v/v)靜脈注射0.2 mL，每2 d一次，連續(xù)給藥3周，成功誘導(dǎo)Wister大鼠白血病。

2.2.3 放射輻射誘發(fā)

一些射線的照射可誘發(fā)小鼠白血病，如 γ射線、X射線。Kawakatsu等[5]連續(xù)5 d用1 Gy γ射線輻射C57BL/6小鼠，引起造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的損傷，易導(dǎo)致惡性血液疾病的產(chǎn)生。Hasegawa等[6]用1.2 Gy /周的X射線照射4周齡、過(guò)度表達(dá)人HF基因(hHF-tg)的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型(WT)小鼠連續(xù)4周(總劑量為4.8 Gy)，與WT小鼠相比，80% hHF-tg小鼠發(fā)生胸腺淋巴瘤/白血病，具有更高發(fā)病率和更早的發(fā)作時(shí)間。

2.2.4 基因敲除產(chǎn)生

通過(guò)基因工程的方法使小鼠體內(nèi)某種基因功能缺失，改變小鼠細(xì)胞遺傳性獲得的小鼠白血病模型。Li等[7]在小鼠t (8；21)AML模型中進(jìn)行了體內(nèi) microRNA (Mir)-126功能喪失的研究，通過(guò)連續(xù)骨髓移植試驗(yàn)顯示Mir-126的過(guò)度表達(dá)和基因敲除都會(huì)與t(8；21)融合基因協(xié)同作用，從而促進(jìn)白血病的發(fā)生。

2.2.5 可移植性白血病

建立可移植性白血病模型可以有多種途徑，例如皮下注射、腹腔注射及尾靜脈注射等，其中尾靜脈注射與人類白血病血行播散方式一致，受到較多研究者的采用。可移植性白血病的方法移植成功率高，不能自發(fā)痊愈，需要借助外界因素，因此該模型在白血病實(shí)驗(yàn)研究和抗癌藥物篩選等領(lǐng)域具有廣泛用途。Song等[8]利用BALB/c小鼠建立同種異體骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)的模型，來(lái)評(píng)估間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在BMT治療惡性血液病中的潛在應(yīng)用價(jià)值。他們通過(guò)7-Gy(60Co，80 cGy/min)劑量的全身照射6 h后移植A20 B淋巴瘤細(xì)胞和供體BM細(xì)胞，成功誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤白血病的發(fā)展。

3 模型所用小鼠品系的應(yīng)用

3.1 近交系小鼠模型

3.1.1 L615小鼠

L615小鼠在抗癌藥物研究中應(yīng)用廣泛。肖燕妮等[9]利用L615小鼠探討CRIF1基因?qū)615白血病細(xì)胞小鼠體內(nèi)增殖的影響。通過(guò)向小鼠腹腔注射無(wú)血清L615細(xì)胞(5×106個(gè)/只)，小鼠出現(xiàn)脫毛、潰瘍等癥狀，白血病細(xì)胞、肝、脾指數(shù)也顯著增加，抑制白血病細(xì)胞CRIF1基因表達(dá)后，加快了白血病的發(fā)生發(fā)展。鄧怡等[10]利用L615小鼠建立L615細(xì)胞低瘤負(fù)荷的白血病微小殘留病(minimal residual disease，MRD)小鼠模型，觀察間隙連接蛋白43修飾人臍血源基質(zhì)細(xì)胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells，hUCBDSCs)體外對(duì)L615小鼠白血病細(xì)胞株凋亡以及體內(nèi)對(duì)MRD小鼠疾病進(jìn)展的影響，成功構(gòu)建L615細(xì)胞低瘤負(fù)荷的MRD小鼠模型，為清除殘留白血病細(xì)胞提供了新思路和方法。

3.1.2 BALB/c小鼠

BALB/c小鼠起源于小家鼠Musmusculus，在癌癥治療和免疫學(xué)等研究中有著廣泛應(yīng)用。Chen等[11]研究鹽酸伊立替康(irinotecan hydrochloride)在早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用以及在白血病異種移植模型中的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。用5×106個(gè)HL-60細(xì)胞接種無(wú)胸腺BALB /c(nu/nu)裸鼠，成功建立研究早幼粒細(xì)胞白血病的BALB/c裸鼠模型。Tsou等[12]將1×105個(gè)的WEHI-3細(xì)胞腹腔注射BALB/c小鼠體內(nèi)，成功建立BALB/c小鼠模型，研究了體內(nèi)異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate，PEITC)對(duì)正常和白血病小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答的體內(nèi)作用。徐玉潔等[13]構(gòu)建BALB/c裸鼠人源化CML模型，用全身亞致死量照射預(yù)處理(sublethal irradiation，SLI預(yù)處理)初步成功建立了人源化BALB/c裸鼠CML模型，其白血病發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，建模成本低廉并且技術(shù)簡(jiǎn)單，為實(shí)驗(yàn)研究者們提供了良好的CML動(dòng)物模型。

3.1.3 C57BL/6小鼠

C57BL/6小鼠是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系之一。Wu等[14]取指數(shù)生長(zhǎng)的C 1498細(xì)胞(1×107個(gè)/只)懸浮于100 μL PBS中，然后皮下注射到4 h前已暴露于4 Gy清髓照射下的小鼠尾靜脈，成功建立C57BL/6小鼠模型。ALL是兒童期最常見的癌癥，雖然治療ALL的進(jìn)展已導(dǎo)致緩解率超過(guò)90%，但許多幸存者由于化療而遭受不良的神經(jīng)認(rèn)知和/或神經(jīng)行為影響。Alexander等[15]利用C57BL/6小鼠來(lái)研究甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)/阿糖胞苷(cytosine arabinoside，AraC)對(duì)青少年海馬認(rèn)知和樹突結(jié)構(gòu)的影響，提供治療ALL的青少年患者化療引起的認(rèn)知功能下降的見解。孫賀軍等[16]采用C57BL/6小鼠制備小鼠紅白血病模型，體外培養(yǎng)小鼠紅白血病細(xì)胞系FBL-3，經(jīng)尾靜脈注射接種C57BL/6小鼠，探討α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(alpha-galactosylceramide，α-Galcer)對(duì)紅白血病的影響，成功制備C57BL/6小鼠紅白血病模型。

3.2 突變系小鼠

3.2.1 Nude小鼠

Nude小鼠即裸鼠，無(wú)毛，先天性胸腺缺陷，T細(xì)胞功能接近于零，B細(xì)胞功能大致正常，NK細(xì)胞活性與鼠齡有關(guān)，廣泛用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)和毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究。Yang等[17]將1×106個(gè)HL-60細(xì)胞皮下注射入裸鼠的右后肢，成功構(gòu)建了裸鼠白血病模型，利用裸鼠白血病模型證明了發(fā)酵的樟芝培養(yǎng)物(antrodia camphorata，AC)對(duì)HL-60細(xì)胞體外周期停滯和體內(nèi)腫瘤消退是有效的。Wang等[18]通過(guò)皮下接種Kasumi-1細(xì)胞建立裸鼠模型，探討組蛋白去乙?；敢种苿┍焖?valproic acid，VPA)對(duì)AML體內(nèi)外血管生成的作用。

3.2.2 SCID小鼠

SCID小鼠為C.B-17的突變系(常染色體隱形突變)，該品系缺乏B、T細(xì)胞，淋巴細(xì)胞減少，具有正常的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及粒細(xì)胞。Wicklein等[19]利用兩株人白血病細(xì)胞系(EOL-1和K562)建立人慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病(chronic eosinophilic leukemia，CEL)和CML異種移植小鼠模型，小鼠分別靜脈內(nèi)注射2×106個(gè)EOL-1或K562細(xì)胞，兩種模型都能引起白血病細(xì)胞的大量器官浸潤(rùn)，血液中大量存在白血病細(xì)胞，成功建立CML和CEL異種移植小鼠模型。信紅亞等[20]選取5周齡的SCID小鼠，鼠尾靜脈注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HL-60 細(xì)胞 1×107個(gè)，其肝、脾、腎、外周淋巴結(jié)均腫大，病理組織切片和細(xì)胞涂片顯示有大量白細(xì)胞浸潤(rùn)，成功建立了HL-60/SCID小鼠人白血病模型。

3.2.3 NOD/SCID小鼠

NOD/SCID小鼠是將SCID 小鼠和NOD/Lt回交而得到的，存在B、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和補(bǔ)體缺陷，在腫瘤研究、藥物篩選等領(lǐng)域具有廣闊的前景。文良雪等[21]研究人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株KCL22在NOD-SCID小鼠體內(nèi)致白血病的能力，取KCL22細(xì)胞1×107個(gè)，經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，四周后出現(xiàn)白血病樣體征，成功構(gòu)建NOD/SCID小鼠慢性粒細(xì)胞白血病移植瘤模型，為慢性粒細(xì)胞白血病血液移植瘤模型鼠的建立奠定基礎(chǔ)。Liu 等[22]通過(guò)NOD/SCID小鼠探討了糖酵解酶烯醇化酶2 (glycolytic enzyme enolase 2，ENO2)在ALL中的作用，NOD/SCID小鼠皮下注射5×106個(gè)Reh細(xì)胞，注射7 d后可見腫瘤發(fā)生，顯示ENO2可能為ALL提供潛在的治療策略。Zhang等[23]用人Mt-NPM1 OCI/AML3細(xì)胞系異種移植的NOD /SCID小鼠用做體內(nèi)模型來(lái)研究治療AML的新的藥物靶點(diǎn)。Lehmann等[24]采用NOD/SCID小鼠建立皮下移植和原位移植模型，證實(shí)了藥物聯(lián)合治療AML的優(yōu)異效果，為以后新藥聯(lián)合治療白血病的研究提供了動(dòng)物模型參考。

4 中醫(yī)藥對(duì)小鼠白血病模型的研究

近年來(lái)，中醫(yī)藥和中西醫(yī)結(jié)合治療白血病取得了顯著成就，中醫(yī)藥具有能夠減輕化療對(duì)患者機(jī)體的毒副作用、提高免疫力、減少白血病的復(fù)發(fā)等優(yōu)勢(shì)，在國(guó)內(nèi)外都有廣闊的發(fā)展前景。肖悅等[25]利用615系小鼠構(gòu)建L7212白血病模型，考察蟾酥對(duì)L7212白血病的療效和作用機(jī)制。蟾酥延長(zhǎng)了白血病小鼠的生存時(shí)間，降低了白血病細(xì)胞的比例，機(jī)體免疫功能提高，對(duì)白血病有一定的療效。徐春燕等[26]通過(guò)對(duì)NOD/SCID小鼠尾靜脈移植 2×107個(gè) K562 細(xì)胞，建立移植性人白血病NOD/SCID小鼠模型，探討當(dāng)歸多糖(Angelicasinensispolysaccharide，ASP)與AraC聯(lián)合注射對(duì)NOD/SCID小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的影響以及調(diào)控白血病細(xì)胞衰老的可能機(jī)制。顯示ASP 與 AraC聯(lián)用能促進(jìn)移植小鼠白血病細(xì)胞衰老，為臨床治療白血病提供了新思路。 AML1-ETO是AML中白血病發(fā)生的關(guān)鍵因子，AML1-ETO蛋白的降解能促進(jìn) AML患者的臨床治療，Zhou等[27]利用Kasumi-1細(xì)胞和C1498細(xì)胞分別構(gòu)建 Nude小鼠和C57小鼠白血病模型，研究厚樸酚(magnolol，HNK)對(duì)AML1-ETO蛋白的快速降解作用，HNK降低了異種移植小鼠模型中的致瘤性，并延長(zhǎng)了小鼠的存活時(shí)間，顯示HNK 是一種潛在針對(duì)AML1-ETO癌蛋白的抗白血病藥物。

5 結(jié)語(yǔ)

建立高效、準(zhǔn)確的小鼠白血病模型對(duì)臨床藥物的研發(fā)和篩選至關(guān)重要。小鼠模型因建立周期短，遺傳背景明確，可選擇移植細(xì)胞的種系豐富，可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)成為了國(guó)內(nèi)外研究者常用的白血病模型，具有十分廣闊的發(fā)展前景。小鼠雖然在遺傳學(xué)，生物學(xué)等許多方面與人類有相似之處，但在小鼠模型上用藥終究不能完全模擬人類構(gòu)造。相信隨著科技的發(fā)展和更深入的研究，人們將建立更完善的白血病模型。