腫瘤細胞來源的外泌體對NK細胞活性的影響

崔雅楠 張傳霞 金浩范

(吉林大學白求恩第一醫(yī)院 1腫瘤中心，吉林 長春 130012；2轉(zhuǎn)化醫(yī)學院國際細胞治療中心)

外泌體(exosome)是活的細胞經(jīng)過一系列“內(nèi)吞-融合-外排”等復雜的調(diào)控過程形成的有膜結(jié)構的小囊泡，直徑30～150 nm，密度1.13～1.21 g/ml，存在于各種體液中，包括血液、尿液、腦脊液及母乳等。剛開始的時候，人們以為外泌體是細胞排泄廢物的一種方式，外泌體的功能并未受到重視〔1〕。直到2013年諾貝爾生理和醫(yī)學獎頒給了三位科學家，表彰他們在細胞內(nèi)部囊泡(外泌體等)的運輸調(diào)控機制方面的重大發(fā)現(xiàn)，這引起了更多研究人員對外泌體的興趣，使外泌體的研究達到了空前的熱度。隨著分子技術的發(fā)展，人們漸漸認識到外泌體在細胞間物質(zhì)交換和信息傳遞中的重要作用。近年來，國內(nèi)外針對外泌體與腫瘤關系的研究主要集中在其促進腫瘤發(fā)生發(fā)展和抑制免疫系統(tǒng)兩個方面。癌癥來源的外泌體通過促進腫瘤細胞生長、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等多種方式參與腫瘤的診斷與治療。外泌體也涉及腫瘤的免疫逃逸過程，它們可以影響免疫抑制細胞的分化和激活，調(diào)節(jié)抗原呈遞，并誘導相關效應細胞的凋亡。自然殺傷(NK)細胞作為人體的重要免疫細胞，其殺傷活性不受主要組織相容性復合體(MHC)限制，不依賴于抗體，能快速溶解某些腫瘤細胞進而發(fā)揮抗腫瘤作用，因此NK細胞抗癌功能的開發(fā)與應用是近年來癌癥研究的重點內(nèi)容。根據(jù)相關文獻報道，腫瘤來源的外泌體(TEXs)具有抑制NK細胞活性的作用〔2〕，本文將對此做簡要綜述。

1 TEXs的生物學特性

1.1組成 與大部分細胞產(chǎn)生的外泌體一樣，TEXs也是由蛋白質(zhì)、核酸及少部分脂類物質(zhì)構成。其中蛋白質(zhì)占據(jù)了很大部分，以參與外泌體本身基本結(jié)構構成的蛋白質(zhì)和不同腫瘤細胞來源的特異性蛋白質(zhì)為主，前者常見有多泡小體(MVB)相關蛋白、凋亡相關基因-2相互作用蛋白(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)及四糖蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等，已被廣泛用作外泌體標志物，用以檢測及鑒別外泌體；后者與所覆蓋的具體腫瘤類型有關，常見的有自殺相關基因配體(FasL)、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等腫瘤抗原和免疫抑制蛋白。

除蛋白質(zhì)外，TEXs還含有大量的mRNA和miRNA。這些核糖核酸類物質(zhì)可以通過轉(zhuǎn)運作用于靶細胞影響其基因表達，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此TEXs攜帶的不同mRNA和miRNA與癌癥的早期診斷及治療密切相關。例如，神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生的外泌體可以通過調(diào)節(jié)miR-1587作用于靶基因刺激腫瘤細胞增殖，相關研究也表明腦脊液中的外泌體含有的特異性RNA可以作為診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的特異性標志物，在判斷腫瘤分期及預后方面發(fā)揮重要作用〔3〕；P53突變的結(jié)腸癌細胞可以在腫瘤微環(huán)境中選擇性釋放富含miR-1246的外泌體，通過促進巨噬細胞的攝取轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤激活狀態(tài)，進而導致腫瘤細胞遷移，使TP53突變的結(jié)腸癌患者預后不佳〔4〕。這些發(fā)揮重要功能的核酸類物質(zhì)，在外泌體中種類較多、含量豐富，與癌癥細胞的自我調(diào)控息息相關，現(xiàn)已成為近年來研究的熱點〔5〕。此外，外泌體包含的脂質(zhì)成分主要來源于細胞的質(zhì)膜，在某些生物學過程中也起到一定的調(diào)控作用〔6〕。

1.2功能 從已知的研究結(jié)果來看，TEXs由于成分不同、生物學特性的差異，分別從抑制和激活兩方面對腫瘤起雙重調(diào)控作用。

一方面，TEXs可通過多種途徑誘導有效的抗腫瘤效應，激活免疫反應，促進腫瘤細胞凋亡等。如我國學者發(fā)現(xiàn)肝癌來源的外泌體可以將其特異性抗原傳遞給樹突細胞誘發(fā)CD8+T細胞介導的殺瘤效應，為腫瘤的免疫治療提供了新思路〔7〕。有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞來源的外泌體可作為天然載體將CRISPR/Cas9質(zhì)粒傳遞給癌癥細胞，進而抑制poly(ADP-核糖)聚合酶1的表達，誘導癌細胞的凋亡〔8〕。關于胰腺癌細胞分泌的外泌體研究較多，早期實驗發(fā)現(xiàn)它可以通過增加細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax的含量、降低抗凋亡基因Bcl-2的表達，誘導多途徑的細胞凋亡，如(PI3K/Akt)信號傳導通路及Notch-1依賴的細胞凋亡途徑〔9〕。近年來相關蛋白組學試驗表明，胰腺癌來源的外泌體分泌的細胞膜表面含有大量的網(wǎng)蛋白，在細胞模型及動物試驗中均證實該類蛋白可以抑制癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移〔10〕。

雖然不斷有研究發(fā)現(xiàn)TEXs具有一定的抗腫瘤潛能，但另一方面，更多的證據(jù)提示TEXs對預后不佳的晚期腫瘤發(fā)揮了免疫抑制作用，促進了腫瘤的進展，甚至與癌癥細胞耐藥性密切相關。例如：相關研究表明肝細胞癌(HCC)來源的外泌體通過傳遞14-3-3ζ蛋白至腫瘤浸潤性T細胞(TIL)，抑制了TIL活化、增殖及抗瘤效應〔11〕；此外，肝癌來源的外泌體通過miR-1247-3p靶向特殊調(diào)控基因，誘導癌癥相關的成纖維細胞活化，使腫瘤微環(huán)境分泌大量炎癥因子促進腫瘤轉(zhuǎn)移〔12〕；急性髓細胞白血病(AML)的外泌體可以下調(diào)骨髓造血干細胞的功能，這是通過促進抑制正常造血因子DKK1的表達實現(xiàn)的，它幫助建立適合惡性細胞成長繁衍的骨髓微環(huán)境促進白血病的進展〔13〕；在化療耐藥方面，乳腺癌細胞分泌的外泌體通過具有獨特的90 kD形式的血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)激活促進腫瘤血管生成，且這種外泌體相關的VEGF與VEGF的靶向藥物貝伐單抗的結(jié)合能力差，進而引起貝伐單抗藥物的耐藥〔14〕。

隨著實驗技術水平的提高及外泌體提純技術的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明腫瘤的產(chǎn)生、侵襲和遷移與外泌體的關系十分密切。在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)過程中，外泌體的物質(zhì)交換與信息傳遞功能在癌癥細胞和免疫細胞中發(fā)揮了雙重作用。

2 TEXs對NK細胞功能的影響

NK細胞的發(fā)現(xiàn)距今已有40多年，它是機體固有免疫重要的毒性細胞，近年來隨著腫瘤精準治療的提出及免疫治療的興起，NK細胞因其殺傷活性不受MHC的限制、不依賴抗體的特點而倍受學者關注與研究。NK細胞具有抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)的功能，此外，在某些情況下，NK細胞與自身免疫性疾病和超敏反應的發(fā)生也有一定的關聯(lián)。作為機體抵御腫瘤和病原體的第一道防線，TEXs對NK細胞功能的改變及其機制值得深入研究。

NK細胞的殺傷效應與免疫清除功能的發(fā)揮由它表達的各種受體分子和相應配體之間的關系所決定，其活性取決于細胞表面的活化性受體和抑制性受體之間的平衡〔15〕。NK細胞的識別和殺傷效應機制主要有自身天然的細胞毒性、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)及NK細胞通過釋放顆粒酶和穿孔素等細胞毒顆粒，活化NK細胞表達的FasL配體和TRAIL分子誘導細胞發(fā)生凋亡等。NK細胞也可以通過產(chǎn)生除了顆粒酶和穿孔素外的細胞因子(如IFN、TNF、IL-1、IL-5、IL-8、IL-10等)及NK細胞受體家族，常見如免疫球蛋白超家族(KIR和KAR)、C型凝集素受體家族(NKG2D)等對NK細胞活性進行調(diào)控。NK細胞的功能也與其不同亞群(如CD56lim和CD56bright)相關。

癌癥患者的NK細胞介導低水平的抗腫瘤活性和低含量的激活受體，如NKp30、NKp46、NKG2C和NKG2D，相關研究表明該現(xiàn)象與TEXs密切相關〔16〕。

據(jù)報道，前列腺癌細胞來源的外泌體通過下調(diào)NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞的受體NKG2D的表達，抑制免疫細胞的殺瘤效應，誘導免疫逃逸進而促進腫瘤細胞的生長和遷移〔17〕。經(jīng)檢測，由AML患者的血清中分離出來的外泌體富含大量的CD33、CD34、CD117和TGF-β1，它們抑制NKG2D受體的表達和誘導Smad磷酸化，進而影響了NK細胞活性，當中和TGF-β1時，這種抑制情況就消失不見了〔18〕。由此我們推測，AML細胞來源的外泌體相關的TGF-β1會下調(diào)NK細胞活性，對NK細胞功能有抑制作用，甚至對其他血液腫瘤及實體瘤也存在該機制可能。

腫瘤衍生的外泌體可以通過降低機體免疫力，改變腫瘤微環(huán)境，進而誘導腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；相反，免疫細胞來源的外泌體可以通過增強機體免疫力對抗腫瘤。在一項較新的實驗〔19〕中，研究者將神經(jīng)母細胞瘤患者的腫瘤細胞擴張后在體內(nèi)分離出的NK細胞來源的外泌體，并在此基礎上對其進行體外培養(yǎng)進而探索其腫瘤本身的效能。發(fā)現(xiàn)暴露于神經(jīng)母細胞瘤的NK細胞來源的外泌體能夠表達CD56、NKG2D和KIR2DL2受體，對比正常細胞來源的NK細胞分泌的外泌體，前者對神經(jīng)母細胞瘤的細胞毒性作用更大。韓國慶北國立大學醫(yī)學院研究組探討了NK細胞來源的外泌體在體內(nèi)外對黑素瘤的抗瘤效應。該研究發(fā)現(xiàn)，對正常細胞沒有影響的NK細胞來源外泌體對黑色素瘤細胞具有細胞毒性。在體外，通過FasL抑制劑可以減輕NK細胞來源外泌體對黑色素瘤細胞的殺傷效應，誘導黑色素瘤的凋亡。在體內(nèi)，研究人員通過建立小鼠模型，發(fā)現(xiàn)外泌體處理組的腫瘤顯著小于對照組，證實了NK細胞外泌體的腫瘤抑制作用，該研究為腫瘤免疫治療提供了新思路〔20〕。

3 結(jié) 語

在TEXs的相關研究中，既往的研究多數(shù)是探索癌癥細胞釋放的外泌體對腫瘤本身的影響，但較少了解其對免疫功能尤其是NK細胞的影響。NK細胞作為機體免疫的重要屏障，其功能的研究與活性的調(diào)控對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關重要。在細胞水平上證明TEXs對NK細胞活性的影響，何種成分，蛋白質(zhì)、核酸還是脂質(zhì)，何種作用機制導致的TEXs對NK細胞活性的改變更值得進一步的研究。可以預見，隨著外泌體蛋白組學及基因組學的發(fā)展、提純技術的提高，人們對外泌體，乃至整個細胞囊泡系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機制及腫瘤細胞與NK細胞之間的調(diào)控將進一步深入闡述，外泌體的臨床應用將具有更廣闊的空間和更良好的前景。