核酸純化裝置研制與教學(xué)實(shí)踐

李 欣, 趙玉紅, 石建黨, 衡 濱, 李小菊, 張偉英, 張金紅, 趙立青

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 天津 300071)

實(shí)驗(yàn)設(shè)備作為開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)的載體,一直是高校實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的重點(diǎn)內(nèi)容[1-2]。當(dāng)前,市售的儀器設(shè)備五花八門,通常具有外形美觀、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn),但在設(shè)計(jì)上往往因兼顧通用性而無法與教學(xué)實(shí)際緊密結(jié)合,難以滿足專業(yè)基礎(chǔ)教學(xué)的具體需求[3-4]。另外,外購設(shè)備一般價(jià)格較高,功能復(fù)雜,也因此而造成維修不便[5]。為此,各高校積極開展實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備自行設(shè)計(jì)和研制活動,這不僅是對實(shí)驗(yàn)教學(xué)硬件建設(shè)的有力補(bǔ)充,同時(shí)在更新實(shí)驗(yàn)教學(xué)手段,促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革,提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量和增強(qiáng)師生實(shí)踐創(chuàng)新能力等方面都起到不可或缺的作用[6-7]。

我校一直以來都大力支持教師和實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員自主研發(fā)制作實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器,并自2017年開始設(shè)立了自制實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器設(shè)備項(xiàng)目基金。我們充分結(jié)合實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)際和教學(xué)對象特點(diǎn),自行設(shè)計(jì)制作了一款核酸純化裝置，并成功應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué),取得了良好的實(shí)踐效果。

1 技術(shù)背景

分子生物學(xué)是由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)等多種學(xué)科相互滲透產(chǎn)生的學(xué)科[8],是以生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸等)為研究對象的基礎(chǔ)學(xué)科,其發(fā)展迅速,前沿性強(qiáng),應(yīng)用廣泛,現(xiàn)已成為生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行深入研究不可或缺的重要工具[9]。分子生物學(xué)又是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科,因此所涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)眾多,小量核酸純化技術(shù)就是其中一種。

小量核酸的純化是生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容中經(jīng)常涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù),主要包括質(zhì)粒DNA的小量提取、DNA瓊脂糖凝膠中目的條帶的回收、PCR或酶切產(chǎn)物純化和細(xì)胞或組織總RNA的提取等。目前的純化操作大多選用相應(yīng)的商品化試劑盒進(jìn)行,而其中最關(guān)鍵的步驟則是核酸在制備管(見圖1)內(nèi)吸附膜上的吸附結(jié)合和反復(fù)洗滌,通常采取多次離心的方法來實(shí)現(xiàn)。

圖1 制備管結(jié)構(gòu)

但在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用離心法進(jìn)行核酸的吸附與洗滌存在以下弊端：

(1) 離心后的液體盛接于制備管外部的套管中,這些廢棄液體很可能因操作不慎從制備管下管口進(jìn)入而造成管內(nèi)吸附膜上核酸的污染；

(2) 離心機(jī)本身在使用上有著諸多要求,待離心的樣品管需要嚴(yán)格配平并對稱放置,而且離心法吸附和洗滌核酸通常需要較高的轉(zhuǎn)速,如果學(xué)生操作不當(dāng)則會威脅到儀器安全，甚至人身安全；

(3) 在受眾面廣的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,因離心耗時(shí)較長且離心機(jī)數(shù)量有限,往往會造成學(xué)生等待儀器和扎堆操作的現(xiàn)象。

除離心法以外,還可以將制備管的下管口接入真空歧管,再連接真空泵、緩沖瓶和泵管等,以實(shí)現(xiàn)對制備管內(nèi)液體的抽出。但該裝置并非一體化設(shè)備,使用麻煩,成本高,占用空間大,且真空歧管本身不易進(jìn)行清洗和維護(hù)。另外,市售真空歧管大多具有數(shù)10個(gè)緊密排列的制備管插孔,在教學(xué)中多人使用時(shí)無法保證良好的氣密性和足夠的操作空間。因此,該裝置并不適用于使用者眾多的實(shí)驗(yàn)教學(xué),無法滿足教學(xué)工作中的實(shí)際需求。

2 裝置結(jié)構(gòu)

本裝置的設(shè)計(jì)目的就是針對上述問題,提供一種能夠代替離心法和真空歧管的一體化設(shè)備,用以提高小量核酸吸附和洗滌的操作效率。該裝置的技術(shù)核心是選擇具有較高泵頭轉(zhuǎn)速的蠕動泵,通過其轉(zhuǎn)子交替擠壓、釋放泵管,在管內(nèi)形成一定的負(fù)壓進(jìn)行抽液。主要技術(shù)路線是將蠕動泵進(jìn)水端通過規(guī)格匹配的泵管與等徑四通接頭連接,四通接頭剩余的3個(gè)接口分別通過泵管與等徑三通接頭連接,以最終實(shí)現(xiàn)將單管路分成6個(gè)管路。6個(gè)管路的泵管分別與6個(gè)三通閥(見圖2)的引流口銜接。該三通閥具有2個(gè)接口,其中與引流口相對的接口作為制備管下管口的插口；另一個(gè)與引流口垂直的接口用于連接外接吸液管,2個(gè)接口的不同功能可通過三通閥開關(guān)進(jìn)行切換。

圖2 三通閥結(jié)構(gòu)

外觀上,該裝置為一體化設(shè)備,蠕動泵、泵管、多通接頭固定于儀器機(jī)箱內(nèi)部,6個(gè)三通閥通過引流口垂直固定于機(jī)箱上表面,并且2個(gè)三通閥一組,二者連線靠近并平行于機(jī)箱上表面的某一邊緣。制備管插口豎直向上,吸液管接口朝向機(jī)箱外側(cè)并與該三通閥鄰近的機(jī)箱上表面邊緣垂直,使外接吸液管自然下垂,并通過機(jī)箱外側(cè)壁上的固定卡扣收納。機(jī)箱后面具有排水孔,用以將蠕動泵出水端通過泵管引出。機(jī)箱正面具有電源開關(guān),后面具有電源接口。整個(gè)裝置外觀見圖3。

圖3 裝置外觀

3 裝置功能

該裝置提供了6個(gè)核酸制備管插口,通過蠕動泵從制備管下管口自動抽液,以實(shí)現(xiàn)在數(shù)10 s內(nèi)快速完成小量核酸的吸附與洗滌操作,不僅能夠大大提高核酸純化過程的操作效率,而且制備管中的液體在蠕動泵的作用下即抽即排,廢液不會污染制備管。每個(gè)插口分別由三通閥開關(guān)控制，以保證多個(gè)插口非同步抽液時(shí)管路中良好的氣密性和不同制備管在操作時(shí)的相互獨(dú)立性。另外,每個(gè)插口旁還連有外接吸液管,可通過三通閥開關(guān)與插口進(jìn)行功能切換,便于儀器中管路的清洗,同時(shí)還可以用于不同實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)“吸液—棄液”操作,有利于將該裝置的應(yīng)用范圍進(jìn)一步推廣。

4 教學(xué)實(shí)踐

4.1 服務(wù)內(nèi)容與效果

該自制儀器設(shè)備主要是為提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)中核酸純化的操作效率而設(shè)計(jì),現(xiàn)已面向本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的多門實(shí)驗(yàn)課程服務(wù),主要包括分別面向本院大二和大三年級伯苓班、生物科學(xué)和生物技術(shù)專業(yè)開設(shè)的兩門64學(xué)時(shí)基礎(chǔ)必修課程——生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),所涉及的具體實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有“目的基因的純化與回收”“載體pGEX-4T-2的制備”“目的基因/載體酶切片段的回收”以及“質(zhì)粒DNA的提取和酶切鑒定”等。除基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)外,該裝置也應(yīng)用于綜合開放類實(shí)驗(yàn)教學(xué),如在“實(shí)時(shí)定量PCR分析IPTG對啟動子活性的調(diào)節(jié)作用”這一綜合性實(shí)驗(yàn)中,需要采用試劑盒法提取大腸桿菌總RNA,該過程中涉及的多次RNA吸附和洗滌步驟就可以通過本裝置輕松完成。另外,該儀器設(shè)備還可以實(shí)現(xiàn)自動“吸液—棄液”,這一常規(guī)操作功能可廣泛應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)課程和教學(xué)內(nèi)容當(dāng)中。

通過近一年的教學(xué)實(shí)踐,該實(shí)驗(yàn)裝置受到了廣大師生的高度認(rèn)可與評價(jià),將該自制儀器應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的反饋效果良好。

4.2 實(shí)踐意義

相比離心法,該裝置具有快速高效、操作簡單、無污染及安全隱患等優(yōu)點(diǎn)；相比真空歧管,該裝置為一體化設(shè)備,無需組裝,且體積小,成本低,易清潔。該裝置能夠大大提高學(xué)生純化操作速度,且便于多人非同步操作,不僅可有效緩解學(xué)生因長時(shí)間等待和扎堆使用儀器而導(dǎo)致的課堂擁擠現(xiàn)象,還能避免因?qū)W生操作不當(dāng)而造成的樣品污染，甚至安全問題,提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率和實(shí)驗(yàn)成功率,因而具有較高的實(shí)用價(jià)值。

自制儀器設(shè)備是由教師根據(jù)教學(xué)實(shí)際需要和學(xué)生學(xué)習(xí)特點(diǎn)而設(shè)計(jì)和制造,相比外購儀器,在實(shí)踐教學(xué)中具有更強(qiáng)的創(chuàng)新性、實(shí)用性和針對性[11-12],更受學(xué)生歡迎。同時(shí),在裝置的設(shè)計(jì)與制作過程中通常需要涉獵多個(gè)領(lǐng)域,這就要求教師不斷學(xué)習(xí)新技術(shù)新知識為自己充電,并把所學(xué)內(nèi)容融會貫通,極大地鍛煉了師資隊(duì)伍的科學(xué)研究、教學(xué)研究和創(chuàng)新實(shí)踐能力,提高了教師的綜合業(yè)務(wù)水平[1,13],為進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量,促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與學(xué)科間的交叉融合奠定了良好的基礎(chǔ)[14]。

5 結(jié)語

自制實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器大多是為解決或者填補(bǔ)現(xiàn)有設(shè)備某些功能的欠缺或不足,以便更好地貼合實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求而自行設(shè)計(jì)或改進(jìn)而成的[15]。在我校的大力支持和倡導(dǎo)下,生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)并制作了核酸純化裝置。該裝置作為不同于真空歧管的一體化設(shè)備,不僅消除了以往教學(xué)實(shí)踐中采用離心法純化核酸所存在的問題和隱患,更具有操作簡便、安全高效、小巧精致、易于維護(hù)等優(yōu)點(diǎn)。目前,該裝置已經(jīng)成功應(yīng)用于多門實(shí)驗(yàn)課程中,受到師生的一致好評。以該裝置為代表的自制實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器不僅是對商品化設(shè)備的有力補(bǔ)充,對于進(jìn)一步加快和促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革,不斷提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平以及鼓勵廣大師生踴躍創(chuàng)新，更是起到積極的推動作用[16]。