紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙的標準不確定度

趙娟

（寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院，寧夏銀川 750001）

甙亦稱為苷，是一種廣泛存在于植物中的化合物，其中淫羊藿苷是黃酮類化合物含量最高的淫羊藿單體分離化合物[1]。淫羊藿苷具有抗衰老、抗氧化、抗抑郁等藥理作用，在婦科疾病方面也有潛在的價值[2]，羊胎盤膠囊是為女性研制的有抗衰老，抗色斑功效的保健食品，目前，紫外分光光度法是測定羊胎盤膠囊中總甙含量的地方標準方法。該方法于2017年發(fā)布，2018年實施。本試驗以研究紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中的總甙為例子，依據標準JJF10591.1-2012《測量不確定度評定與表示》[3]，列出總甙計算公式為數學模型，對本實驗全部實驗過程中所引入的不確定度的分量，逐個進行測量以及評定，為最終標準不確定度的評定提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用設備、溶液、試劑

紫外分光光度計（日本島津）；BS224電子天平（賽多利斯科學儀器公司）；高速離心機（黑龍江龍澤科技發(fā)展有限公司）；超聲振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司）。

淫羊藿苷對照品溶液，購自：中國藥品生物制品檢定所；羊胎盤膠囊，購自寧夏自然生物科技有限公司；甲醇（分析純）；無水乙醇（分析純）；乙醚（分析純）；實驗過程所用水均為RO水。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取經五氧化二磷干燥器或減壓干燥24h的淫羊藿苷對照品10mg，用甲醇溶解定容至10.0mL，即得每毫升含淫羊藿苷1.0mg標準溶液，吸取上述對照品溶液1.0mL，用甲醇定容至10.0 mL，即得0.1mg/mL淫羊藿苷對照品的使用液。精密吸取淫羊藿苷對照品使用液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5mL和4.0mL分別至于10mL容量瓶中，以70%乙醇，定容。則標準曲線絕對含量分別為0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.35 mg和0.40 mg。搖勻后用紫外分光光度計在270 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

1.3 實驗方法

取試樣至少30粒（約1 g/粒）的內容物于干凈容器中，混勻后待測。準確稱取混勻后的試樣0.50 g，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙醚振搖3 min。4 000 r/min離心5 min，棄去上層乙醚，如此反復3次除去干擾雜質；揮干試樣中的乙醚后，加入50 mL70%乙醇放入超聲波震蕩器中震蕩提取40 min，冷卻后定容至50.0 mL過濾。吸取濾液1.0 mL用70%乙醇定容至10.0 mL，搖勻，即得試液。取上述試液在270 nm波長處測定其吸光度，以70%乙醇為空白對照測定。

1.4 數學模型的建立

羊胎盤膠囊中總甙含量的測定根據DB64/T1515-2017《羊胎盤膠囊中總甙含量測定 紫外分光光度法》：

式中：X為試樣中總甙（以淫羊藿甙計）含量，g/100 g；C為試樣供試品從標準曲線中查得的含量，mg；m為試樣質量，g。

1.5 產生不確定度的各個分量

有多個因素隨機影響羊胎盤膠囊中總甙含量，主要包括以下兩個方面。（1）紫外分光光度計與定容體積的隨機系統(tǒng)性誤差、天平的穩(wěn)定性、樣品制備中的均勻度、實驗個體的差別、實驗環(huán)境的改變以及回收率的不確定性等因素所引入的測量不確定度。（2）稱量淫羊藿苷對照品、標準溶液的稀釋和定容、測定樣品總甙含量（隨機變化）的重復性及曲線的不確定度等因素所引入的測量不確定度。

2 結果與分析

2.1 標準對照品溶液不確定度

2.1.1 稱量過程引入的不確定度

標準對照品的稱樣量為0.01 g，標準中天平要求的最小分度為0.01 g。標準JJG 1036-2008《電子天平檢定規(guī)程》中規(guī)定，此精度的天平在-10～50 000 mg范圍稱量，其MPE為±0.5e(e=1.0 mg)，兩次稱量：空瓶mtare、樣品msamp，所得為對照品質量，線性MPE（天平）為矩形分布[4]，天平稱量中兩次的MPE引入的不確定度

得到：

2.1.2 溶液定容體積所引入的不確定度

定容體積為10 mL，定容于10 mL容量瓶中，10 mL容量瓶（單標線）的允許誤差為±0.020 mL，假定其為三角分布，則校準過程中導致的標準不確定度：

2.1.3 稀釋過程引入的不確定度

用5 mL的單標線吸管吸取5.0 mL 1.0 mg/mL對照品溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容，此溶液為淫羊藿苷對照品使用液，濃度0.1 mg/mL。再用5 mL分度吸管吸取淫羊藿苷對照品使用液0.5、1.0、2.0、3.0、3.5 mL 和 4.0 mL，定容至 10 mL，則標準曲線絕對含量分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.35 mg和 0.40 mg。

標準溶液配置的過程中所使用的玻璃量具，以JJC 196-2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》中要求的最大允差，以三角分布，k= 6，由此推出相對不確定度的各個分量[5]，見表1。

由上述數據合成的相對標準不確定度uCrel：

表1 標準溶液曲線配制中所使用的量具校準引入的不確定度

2.1.4 標準物質引入的不確定度

2.2 得出的樣品質量濃度時引入的不確定度（標準曲線校準以最小二乘法擬合）

淫羊藿苷對照品使用溶液標準系列，用紫外分光光度計測定得到相應的吸光度A，進行擬合（最小二乘法），得到其直線方程y=ax+b(a：斜率，b：截距)和標準曲線相關系數（r），見表2。

表2 最小二乘法擬合熒光強度值結果

本實驗過程進行了10次樣品測定液的平行測定，淫羊藿苷對照品使用溶液的平均質量濃度由直線方程求為X0=0.279 mg，則X0的標準不確定度

n為淫羊藿苷對照品使用溶液的測量次數，本例為18；

p為X0的測量次數，本例為10次。

2.3 樣品制備過程引入的不確定度

2.3.1 取樣

本實驗依照DB 64/T1515-2017《羊胎盤膠囊中總甙含量測定 紫外分光光度法》測定羊胎盤膠囊中總甙含量規(guī)定，隨機稱取充分混勻后的羊胎盤膠囊，我們認為樣品是在均勻、有充分代表性的情況下稱量，由此所引入的不確定度可以忽略不計。

2.3.2 稱重

用最小分度0.1 mg的電子天平稱取混勻后的樣品0.50 g，根據JJG 1036-2008《電子天平檢定規(guī)程》中的規(guī)定，該精度的天平在-10～50 000 mg稱量范圍,其MPE：±0.5e(e=1.0 mg)，兩次稱量：空瓶mtare、樣品msamp，所得為樣品質量， 線性MPE（天平）為矩形分布，天平稱量中兩次的MPE引入的不確定度

2.3.3 定容體積所引入的標準不確定度

定容體積為10 mL，定容于10 mL容量瓶中，10 mL容量瓶（單標線）的允許誤差：±0.020 mL，假定其為三角分布，則校準過程中導致的標準不確定度：

2.3.4 樣品制備過程引入的不確定度

2.4 本實驗所測量的重復性的相對標準不確定度

在實驗重復性條件的前提下，對羊胎盤膠囊中總甙含量進行10次獨立性實驗測試，其測量所得數據見表3。

表3 羊胎盤膠囊總甙含量獨立測定10次實驗數據

10次測定總甙含量（重復性條件下），其算數平均值為：

單次測量的標準偏差為：

3 所引入的不確定度分量

各不確定度分量見表4。

表4 羊胎盤膠囊總甙含量不確定度分量

4 合成標準不確定度

5 擴展不確定度

取包含因子k=2，被測量之值的大于95%可包含于此區(qū)間。則擴展不確定度：U(Y)=k×Uc(Y)=2×5.66=11.4 g/100 g，相對擴展不確定度：Urel(Y)=U(Y)/96.4×100%=11.8%

則用紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙含量，對兩份樣品平行測定取平均值()的報告，擴展不確定度：（96.4±11.4）mg/kg，k（包含因子）=2，相對擴展不確定度：11.8%

6 結論

本試驗采用紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙的含量，對標準物質的稱量、標準溶液的配制、標準曲線的擬合、測量的重復性等要素所引入的不確定度等因素的不確定度評定，得出紫外分光光度法測定羊胎盤膠囊中總甙含量方法擴展不確定度：（96.4±11.4）mg/kg，k（包含因子）=2。其中標準溶液的校準、樣品制備的過程、曲線最小二乘法擬合對不確定度影響比較大，在以后的試驗操作中可通過對樣品充分混勻，增加實驗測定的次數等方法來減少引入的不確定度。