低水平激光照射對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響

周蘇波，范潔

作者單位： 315000寧波，中國人民解放軍第113醫(yī)院（周蘇波）；寧波市第九醫(yī)院（范潔）

近年研究表明，變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種由Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)引起的鼻黏膜慢性非感染性疾病[1]。其中，肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在該病的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。因此，有學(xué)者提出氧化應(yīng)激可能是AR的發(fā)病機(jī)制之一[2-5]。與此同時(shí)，大量的基礎(chǔ)和臨床研究表明，低水平激光（LLL）照射可以有效緩解AR的典型癥狀，降低鼻黏膜的充血水腫，并減少其復(fù)發(fā)，但具體的作用機(jī)制不明[6]。有研究表明，LLL是通過其非熱的光化學(xué)效應(yīng)[7]，發(fā)揮其減輕炎癥反應(yīng)，緩解疼痛，促進(jìn)組織修復(fù)和再生的治療功能[8]。其中，線粒體的吸收光譜和臨床使用的 LLL波長接近[9]，因此線粒體可能是LLL發(fā)生光化學(xué)效應(yīng)的主要受體。本實(shí)驗(yàn)利用 SD大鼠構(gòu)建AR動(dòng)物模型，對(duì)比LLL照射與否對(duì)大鼠AR典型癥狀，外周血中免疫球蛋白 E（IgE）、白介素-4（IL-4）和干擾素-（IFN-）的含量，鼻黏膜的病理反應(yīng)及鼻黏膜線粒體呼吸控制率（RCR）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和三磷酸腺苷（ATP）含量的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 5周齡SPF級(jí)SD大鼠（寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：0102017）60只，體質(zhì)量180～220g，雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)飲食飼養(yǎng)。使用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)等分為3組，即健康組（H組）、AR組（A組）、AR+LLL照射組（L組），每組20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 半導(dǎo)體激光治療儀（國械注準(zhǔn)：20173244263，曼迪森MDC-1000-IP上海），超純水制成機(jī)（CSR-4-10，愛斯泰克，北京），恒溫水浴鍋（東臺(tái)電器廠，中國），離心機(jī)（東臺(tái)電器廠，中國）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 卵清蛋白（OVA）（Ⅴ級(jí)，Sigma，美國），氫氧化鋁（博奧生物，北京），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖液（Sigma，美國），SOD檢測試劑盒（Bio-Vision，美國），MDA檢測試劑盒（Bio-Vision，美國），ATP含量測試盒（Bio-Vision，美國），組織線粒體分離試劑盒（杰美基因醫(yī)藥，上海），RCR定量檢測試劑盒（杰美基因醫(yī)藥，上海）。

1.3 AR建模及激光照射

1.3.1 基礎(chǔ)致敏 A組和L組動(dòng)物使用以O(shè)VA為致敏原，Al（OH）3為佐劑的1ml混懸液（0.3 mg OVA+30 mg Al（OH）3+0.9%氯化鈉注射液）進(jìn)行腹腔注射（每2天1次，共7次），以達(dá)到基礎(chǔ)致敏的作用。H組則使用等量 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射2周。

1.3.2 鼻腔激發(fā) A組和L組在基礎(chǔ)致敏結(jié)束后隔 1d，使用 OVA（2%，50 l，1 次/d，7次）對(duì)大鼠雙側(cè)鼻孔進(jìn)行滴鼻，以達(dá)到鼻腔激發(fā)的作用。激發(fā)后0～30min內(nèi)，觀察并記錄大鼠典型的過敏癥狀（搔鼻、流涕、噴嚏）評(píng)分，其中1～2次的輕度搔鼻，記1分；劇烈搔鼻，記2分。1～3個(gè)噴嚏，記1分；4～10個(gè)噴嚏，記2分；11個(gè)以上的噴嚏，記3分。流涕至鼻孔，記1分；流涕超過前鼻孔，記2分；滿臉流涕，記3分。當(dāng)總分＞5分時(shí)，判斷為建模成功。H組則給予等量0.9%氯化鈉注射液滴鼻1周。

1.3.3 激發(fā)維持及激光照射 A組和L組大鼠建模成功后，繼續(xù)使用OVA（2%，50 l，2次/周，2周）對(duì)大鼠雙側(cè)鼻孔進(jìn)行滴鼻，以維持激發(fā)狀態(tài)。H組則使用等量0.9%氯化鈉注射液滴鼻2周。L組大鼠則在建模成功后，立即使用鎵鋁砷激光（650 nm，250 MV，1000 mJ，8 min/次，1次/d，2周）對(duì)每只大鼠雙側(cè)鼻孔進(jìn)行照射。

1.4 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，觀察每只大鼠半小時(shí)內(nèi)（8∶00～8∶30 am）典型的過敏癥狀，按照AR典型過敏癥狀評(píng)分并記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠脫頸處死，立即經(jīng)眼球各取血5ml，離心（3000r/min，15min）取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行規(guī)范操作，獲得吸光度值A(chǔ)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IgE、IL-4和IFN-的濃度。

1.5 鼻中隔黏膜HE染色 取各組大鼠單側(cè)鼻中隔黏膜，甲醛固定脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅染色（HE染色），觀察各組黏膜的病理改變。

1.6 鼻黏膜RCR測定以及SOD、MDA和ATP含量的測定 所有大鼠，剪開雙側(cè)鼻腔，取剩余鼻黏膜組織200 mg。其中100mg按照組織線粒體分離試劑盒的使用說明書，在低溫環(huán)境下快速提取新鮮線粒體。同時(shí)，使用清洗完畢的電極組裝并連接電極室和控制盒，加入2 ml超純水和磁力轉(zhuǎn)子，20℃下預(yù)熱15min。按照試劑盒使用說明書進(jìn)行規(guī)范操作，并計(jì)算RCR。剩余100mg組織在離心管內(nèi)制備成組織勻漿，放入沸水浴箱中10 min，取出搖勻、離心（3 500 r/min，10min），取上清液。按照各種檢測試劑盒的使用說明，進(jìn)行規(guī)范操作，并測得鼻黏膜組織內(nèi)SOD、MDA和ATP的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組癥狀評(píng)分比較 3組搔鼻、噴嚏、流涕癥狀評(píng)分及總評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），H組和L組總評(píng)分均低于A組（均P＜0.05）。見表1。

2.2 3組外周血IgE、IL-4和IFN-比較3組IFN-水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），A組IgE和IL-4水平均顯著高于H組和L組（均P＜0.05），而H組和L組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3 鼻中隔黏膜HE染色 H組可見典型正常的鼻中隔黏膜組織結(jié)構(gòu)；A組可見大量炎性細(xì)胞浸潤；經(jīng)過激光照射后，L組中浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，上皮結(jié)構(gòu)出現(xiàn)恢復(fù)。見封三彩圖5。

周蘇波，范潔.低水平激光照射對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響（見正文第1615頁）

2.43組RCR、SOD、MDA和ATP水平比較 3組RCR、SOD、MDA和ATP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

3 討論

近年來，對(duì)于AR發(fā)病機(jī)制的研究表明，AR可分為速發(fā)相[10]和遲發(fā)相[11]兩個(gè)階段，速發(fā)相主要是由于再次接觸過敏源，由IgE介導(dǎo)激活肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，并釋放炎癥介質(zhì)，快速引發(fā)典型的鼻部癥狀。而遲發(fā)相則是由速發(fā)相炎癥介導(dǎo)，趨化、激活嗜酸粒細(xì)胞和Th2淋巴細(xì)胞，并分泌更多的炎癥因子，導(dǎo)致炎癥加劇，反復(fù)發(fā)作，最終導(dǎo)致組織重塑，進(jìn)入慢性期。

董明等[4]研究發(fā)現(xiàn)，AR大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞線粒體數(shù)量增多，形態(tài)出現(xiàn)異常，并呈現(xiàn)進(jìn)行性的損害。祁?yuàn)檴橻12]的研究表明變應(yīng)原激發(fā)6 h后，患者外周血單核細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ發(fā)生功能障礙，且該功能障礙與外周嗜酸性粒細(xì)胞增多有關(guān)，并參與了AR的發(fā)病過程。Canterorecasens等[5]研究則表明，AR患者呼出氣體中 NO含量明顯高于正常人。這些研究均表明，氧化應(yīng)激是AR重要的發(fā)病機(jī)制之一。

縱觀整個(gè)發(fā)病過程，IgE介導(dǎo)的速發(fā)相反應(yīng)可能是AR的起始病因；同時(shí)，炎癥引發(fā)的氧化應(yīng)激可能是進(jìn)一步促進(jìn)和加重炎癥反應(yīng)的原因。本研究結(jié)果顯示AR大鼠外周血IgE和IL-4含量顯著升高，IFN-含量卻未見明顯升高。提示再次接觸過敏原的確引發(fā)IgE的升高，以介導(dǎo)速發(fā)相反應(yīng)。同時(shí)，IL-4含量的升高，IFN-含量不變，則提示Th1和Th2免疫反應(yīng)的失衡，Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)。與此同時(shí)，鼻黏膜病理切片顯示大量炎癥細(xì)胞浸潤。另一方面，鼻黏膜上皮細(xì)胞中MDA含量顯著升高，SOD和ATP含量及RCR顯著降低。提示細(xì)胞受到ROS損傷，同時(shí)內(nèi)源性抗氧化能力降低，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性及呼吸作用效率降低[13]，導(dǎo)致實(shí)際生成的ATP含量降低。這些均提示鼻黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，這些損傷也必然引發(fā)更加持續(xù)、劇烈的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷相互促進(jìn)，進(jìn)而形成惡性循環(huán)。與此同時(shí)，LLL照射的L組相較于A組，鼻黏膜上皮細(xì)胞中 MDA含量顯著降低，而SOD和ATP含量以及RCR則顯著升高。提示LLL促進(jìn)了線粒體的氧化磷酸化功能，降低了ROS的生成和氧化應(yīng)激損傷。同時(shí)L組外周血IgE和IL-4含量也顯著降低，病理切片顯示炎癥反應(yīng)減弱。提示 LLL可能是通過激活線粒體，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低鼻黏膜的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療AR的作用。

表33 組RCR、SOD、MDA和ATP水平比較