虎杖MYB轉(zhuǎn)錄因子PcMYB2基因的克隆與原核表達(dá)

李曉筱， 徐俊雄， 劉 嬋， 王巖巖， 伍 翔， 覃建兵， 柳忠玉

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025)

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，即髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物)轉(zhuǎn)錄因子是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境因子的應(yīng)答[1-2]，還對(duì)細(xì)胞分化、器官的形成、植物抗病具有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。苯丙烷類物質(zhì)在植物中普遍存在，包括黃酮醇、木質(zhì)素、花青素、原花青素、單寧等，MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)苯丙烷類代謝起重要的調(diào)控作用[4]。

虎杖(PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.)是蓼科多年生草本植物，其根或根莖入藥，傳統(tǒng)中醫(yī)臨床用于治療肝膽疾病、肺熱咳嗽、瘡癰腫毒以及燙傷燒傷、急性細(xì)菌性痢疾與各類炎癥?；⒄雀o富含的白藜蘆醇、類黃酮等藥效成分都由苯丙烷類代謝途徑得到[5]。目前，對(duì)虎杖苯丙烷類代謝的研究多集中在結(jié)構(gòu)基因上，例如白藜蘆醇合成酶基因PcRS[6]、查爾酮合成酶基因PcCHS[7]等。而MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)虎杖苯丙烷類代謝的調(diào)控作用鮮有報(bào)道。

筆者所在課題組前期已經(jīng)從虎杖葉片中克隆到1個(gè)類黃酮代謝相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄抑制因子PcMYB1[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究又從虎杖葉片中克隆了1個(gè)新的MYB轉(zhuǎn)錄因子PcMYB2，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建PcMYB2基因的原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)，為豐富MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2017年1月至2018年2月在長江大學(xué)進(jìn)行?；⒄戎仓攴N植于長江大學(xué)苗圃?？俁NA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Tiangen公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、pMD18-T載體購自TaKaRa公司。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(RACE為cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù))購自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 虎杖葉片總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 用Trizol法提取虎杖葉片總RNA，用cDNA第1鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 MYB基因保守區(qū)域片段的獲得 通過分析已公布的苯丙烷類代謝相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列和氨基酸序列，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物MYBf2和MYBr2(表1)。以虎杖葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)，PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取若干單菌落進(jìn)行PCR檢測，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 cDNA的3′端和5′端擴(kuò)增 3′RACE和5′RACE第1鏈的合成按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。根據(jù)MYB基因的保守區(qū)域測序結(jié)果設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE引物(表1)，PCR擴(kuò)增并回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR檢測篩選陽性克隆并測序。

1.2.4PcMYB2全長cDNA拼接及生物信息學(xué)分析 將獲得的MYB保守區(qū)域片段和兩端序列進(jìn)行拼接，獲得PcMYB2基因的cDNA全長序列。將PcMYB2序列在NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中用BLAST工具進(jìn)行同源分析；利用開放閱讀框(open reading frame，ORF)finder軟件分析開放閱讀框；利用Protparam軟件分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；采用SWISS-MODELSOPMA進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；利用軟件Clustalx 2.1和MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用作同源性和進(jìn)化樹分析的序列均來源于GenBank，具體情況列于表2。

表1 基因特異引物序列

表2 多重序列比較和進(jìn)化分析所用MYB蛋白

1.2.5PcMYB2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)原核表達(dá)載體和PcMYB2基因cDNA序列信息，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物YORFf2和YORFr2擴(kuò)增該基因ORF。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。用NcoⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR回收產(chǎn)物和原核表達(dá)載體，用T4DNA連接酶連接回收純化的目的片段和切開的載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切以及測序鑒定后獲得的陽性克隆即為重組原核表達(dá)載體，將其命名為pET20b-PcMYB2。

1.2.6 重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達(dá) 利用軟件E.coliCodon Usage Analyzer 2.1對(duì)PcMYB2序列進(jìn)行稀有密碼子分析。選擇能提供稀有密碼子的E.coliRosetta(DE3)菌株作為宿主菌。將測序正確的重組質(zhì)粒pET20b-PcMYB2轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coliRosetta(DE3)，得到重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。次日以1%量接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃ 培養(yǎng)至D600 nm約為0.5時(shí)，吸出1 mL菌液作對(duì)照，其余加入異丙基硫代半乳糖苷(簡稱IPTG，終濃度為 0.5 mmol/L)，誘導(dǎo)3 h后，收集1 mL菌液，將收集的菌液于 4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入200 μL PBS(磷酸緩沖鹽溶液)，充分混勻后加入50 μL 5×SDS(十二烷基硫酸鈉)上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，4 ℃冷卻。取15 μL樣品上樣，用12% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色，最后成像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖PcMYB2基因的cDNA全長的獲得及序列分析

提取虎杖葉片總RNA用于RT-PCR，利用簡并引物MYBf2和MYBr2，以cDNA為模板擴(kuò)增MYB基因保守區(qū)域，挑選陽性克隆測序得到1個(gè)長189 bp的保守區(qū)域片段(圖1-A)。設(shè)計(jì)特異引物3′GSP3和3′GSP4，參照試劑盒說明書進(jìn)行3′RACE，擴(kuò)增得到1個(gè)長568 bp的帶有多聚A尾巴的片段(圖1-B)。設(shè)計(jì)特異引物5′GSP3和5′GSP4，參照試劑盒說明書進(jìn)行5′RACE，擴(kuò)增得到1個(gè)長849 bp的片段(圖1-C)。將獲得的兩端序列與保守區(qū)域片段序列進(jìn)行拼接得到1個(gè)長938 bp的cDNA序列，命名該基因?yàn)镻cMYB2(GenBank登錄號(hào)為MG020557)。

序列分析表明，PcMYB2基因的5′端有長度為102 bp的非編碼區(qū)，3′端有長度為98 bp的非編碼區(qū)，ORF由738個(gè)核苷酸組成，編碼1個(gè)含有245個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG(圖2劃線部分)，終止密碼子為TAG(圖2)。利用ExPASy的軟件Protparam預(yù)測PcMYB2編碼蛋白的理化性質(zhì)，推測該蛋白分子式為C1 228H1890N354O376S9，總原子數(shù)為 3 857個(gè)，分子質(zhì)量為27.917 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為5.8。帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為30個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為35個(gè)。采用SWISS-MODELSOPMA進(jìn)行PcMYB2的編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，PcMYB2的編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占35.51%，β-轉(zhuǎn)角占12.65%，延伸鏈占12.24%，無規(guī)則卷曲占39.59%。

2.2 虎杖PcMYB2蛋白的同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用Blast進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，虎杖PcMYB2蛋白與苜蓿MtPAR(HQ337434)、擬南芥AtMYB5(AT3G13540)、葡萄VvMYB5a(AY555190)、柿子DkMYB4(AB503701)、葡萄VvMYBPA1(AM259485)、擬南芥AtMYB123(At5g35550)、柿子DkMYB2(AB503699)的氨基酸序列一致性較高，相似性分別為72%、72%、72%、68%、68%、66%、62%。

為研究PcMYB2蛋白與其他MYB蛋白的進(jìn)化關(guān)系，選取其他物種參與原花青素和花青素代謝的MYB轉(zhuǎn)錄因子序列構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)化樹可明顯分為2個(gè)分支(圖3)。參與花青素調(diào)控的擬南芥AtMYB75、擬南芥AtMYB113、矮牽牛PhAN2、葡萄VvMYBA1等序列聚為1支。而PcMYB2與參與原花青素調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子聚在另外1個(gè)分支上，該分支上有擬南芥AtMYB5、葡萄VvMYB5a、柿子DkMYB4、葡萄VvMYBPA1、擬南芥AtMYB123、柿子DkMYB2、苜蓿MtPAR。因此推測虎杖PcMYB2的功能可能與原花青素合成有關(guān)。

促進(jìn)原花青素合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子的C端差異很大，根據(jù)C端功能基序的不同，目前已知的促進(jìn)原花青素合成的MYB可分為4個(gè)組[9]。第1組MYB轉(zhuǎn)錄因子的C端具有DDxF[S/P]SFL[N/D]SLIN[E/D]保守序列。第2組MYB轉(zhuǎn)錄因子的C端包括V[H/Y][L/N]PKPxR、[S/T]L[E/D]KLY[E/D]EY[L/F]QLL和LD[S/Y]FAxSLL[I/V]保守序列。第3組MYB轉(zhuǎn)錄因子的C端具有V[I/V]R[T/P][K/R]A[I/L/V][R/K]C保守序列。第4組MYB轉(zhuǎn)錄因子MtPAR的C端不具有特定的保守序列。進(jìn)化樹分析表明，本研究中的虎杖PcMYB2與MtPAR的進(jìn)化距離最近，同屬于第4組(圖3)。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，虎杖PcMYB2蛋白與其他MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守區(qū)域主要集中在N端，虎杖PcMYB2蛋白在N端具有2個(gè)典型的MYB DNA結(jié)合域，即R2、R3結(jié)構(gòu)域，為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖4)。PcMYB2蛋白符合R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的特征，并且在PcMYB2蛋白N端的R3結(jié)構(gòu)域中包含1個(gè)能與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序。但是PcMYB2蛋白的C端不具有特定的保守序列。

2.3 原核表達(dá)載體pET20b-PcMYB2的構(gòu)建

將PcMYB2基因的ORF區(qū)域(738 bp)構(gòu)建到載體pET20b中，獲得原核表達(dá)載體pET20b-PcMYB2。對(duì)原核表達(dá)載體pET20b-PcMYB2進(jìn)行菌液PCR鑒定，獲得1條 738 bp 左右的特異性片段(圖5-A)。將原核表達(dá)載體 pET20b-PcMYB2用NcoⅠ和XhoⅠ酶切，切出大小約為 738 bp 的片段，該片段為PcMYB2基因的ORF片段，如圖5-B的箭頭所示。同時(shí)測序結(jié)果表明，連入表達(dá)載體pET20b中的PcMYB2基因ORF片段與目的序列一致，未出現(xiàn)堿基突變和移碼現(xiàn)象。利用軟件E.coliCodon Usage Analyzer 2.1對(duì)PcMYB2基因ORF片段序列進(jìn)行稀有密碼子分析，結(jié)果表明，PcMYB2基因ORF片段序列的稀有密碼子占26%，因此選擇能提供稀有密碼子的E.coliRosetta(DE3)菌株作為宿主菌。將pET20b-PcMYB2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)E.coliRosetta(DE3)后，得到重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)。

2.4 重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)

PcMYB2基因的ORF由245個(gè)氨基酸組成，理論蛋白分子質(zhì)量為27.917 ku， 融合 His-Tag (組氨酸標(biāo)簽)后理論分子質(zhì)量為 28.74 ku。由12% SDS-PAGE結(jié)果(圖6)可知，與未誘導(dǎo)的重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)相比，IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)出現(xiàn)特異條帶，特異條帶的大小與理論值相符，而空載體pET20b/Rosetta(DE3)菌種誘導(dǎo)前后均無特異條帶表達(dá)。結(jié)果表明，重組菌pET20b-PcMYB2/Rosetta(DE3)已成功表達(dá)目的蛋白PcMYB2，如圖6箭頭所示。

3 結(jié)論與討論

已有的研究表明，苜蓿MtPAR、擬南芥AtMYB5、葡萄VvMYBPA1、擬南芥AtMYB123等均屬于調(diào)控原花青素合成的轉(zhuǎn)錄激活因子[10]，本研究的虎杖PcMYB2與這些MYB聚為1支，推測PcMYB2可能是參與虎杖原花青素合成的轉(zhuǎn)錄激活因子。

雖然花青素和原花青素都受MYB調(diào)控，但原花青素的調(diào)控比花青素要復(fù)雜。調(diào)控花青素合成的VvMYBA1[11]、PhAN2[12]、AtMYB75[13]、AtMYB113[14]等序列C端都具有保守KPRPR[S/T]F序列。而調(diào)控原花青素合成的MYB的C端差異很大，根據(jù)C端保守基序的不同MYB可分為4個(gè)組，保守基序不同導(dǎo)致功能也發(fā)生了分化[9]。例如，擬南芥AtMYB5、AtMYB123由于C端保守基序不同而分屬于2個(gè)不同的組。AtMYB123特異調(diào)控?cái)M南芥種皮中原花青素的生物合成[15]，而AtMYB5不僅調(diào)控原花青素合成，還參與調(diào)控種皮發(fā)育和毛狀體的形成[16]。來自于葡萄的VvMYBPAl[17]、VvMYBPA2[18]、VvMYB5a[19]和VvMYB5b[20]分屬于3個(gè)不同的組，其中VvMYBPA1、VvMYBPA2在漿果成熟時(shí)特異調(diào)控原花青素合成，但是VvMYB5a和VvMYB5b對(duì)原花青素和花青素合成均起調(diào)控作用。苜蓿中也有類似報(bào)道，苜蓿MtPAR[21]、MtMYB5和MtMYB14[22]分屬于3個(gè)組，其中MtPAR特異調(diào)控苜蓿種皮中原花青素合成，而MtMYB5和MtMYB14對(duì)苜蓿原花青素和黏液質(zhì)都有調(diào)控作用。此外，桃PpMYB7調(diào)控原花青素合成，但該序列與前人報(bào)道的4組MYB轉(zhuǎn)錄因子皆不相同[23]。綜上所述，不同組MYB轉(zhuǎn)錄因子之間在序列、表達(dá)、功能上已產(chǎn)生分化，表明植物原花青素合成調(diào)控的復(fù)雜性。本研究的虎杖PcMYB2與苜蓿MtPAR的進(jìn)化距離最近，同屬于第4組，在C端都不具有保守基序，在N端的R3結(jié)構(gòu)域中都包含1個(gè)能與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序。MYB轉(zhuǎn)錄因子往往通過[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序與bHLH蛋白互作，才能充分發(fā)揮調(diào)控原花青素合成的作用[15，24]。雖然PcMYB2與MtPAR具有類似的序列特點(diǎn)，但PcMYB2表達(dá)特性、調(diào)控模式及功能等，還需要通過進(jìn)一步轉(zhuǎn)化模式植物加以研究。

本研究中的PcMYB2基因(GenBank登錄號(hào)為MG020557)與前期獲得的PcMYB1基因[8]相比較，核酸序列相似性僅為61%，氨基酸序列一致性低于50%；PcMYB1蛋白屬于Sg4亞家族，是一個(gè)類黃酮代謝的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而本研究的PcMYB2蛋白可能是參與原花青素合成的轉(zhuǎn)錄激活因子，推測PcMYB1和PcMYB2蛋白在苯丙烷代謝中具有不同的功能。稀有密碼子的存在往往影響真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)[25]，為解決此問題，本研究選擇能提供稀有密碼子的Rosetta(DE3)菌株作為宿主菌，并成功表達(dá)PcMYB2蛋白。后續(xù)將純化該蛋白用于體外凝膠遷移(EMSA)試驗(yàn)，從而鑒定PcMYB2蛋白與元件的作用情況，有利于進(jìn)一步研究PcMYB2蛋白的生物學(xué)功能。

本研究從虎杖葉片中成功克隆了1個(gè)R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子PcMYB2基因，PcMYB2基因含有長為738 bp的開放讀碼框，編碼245個(gè)氨基酸殘基。PcMYB2蛋白與苜蓿參與原花青素調(diào)控的MtPAR聚為一組。PcMYB2蛋白的N端R3結(jié)構(gòu)域中包含1個(gè)能與bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R基序。本研究構(gòu)建了PcMYB2基因的原核表達(dá)載體pET20b-PcMYB2，并在大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta(DE3)中成功表達(dá)。