黏膜免疫及其在豬病防控中的應(yīng)用

李天芝，于新友，沈志強，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

約有80%以上病原微生物主要經(jīng)過呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑侵入動物機體引起感染[1]。黏膜是防御病原微生物的第一道屏障[2]，它可在病原微生物侵入機體前將其消滅，免其對機體造成損傷，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。黏膜免疫系統(tǒng)是由廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺體（唾液腺、淚腺、乳腺）處的淋巴組織組成的系統(tǒng)，主要包括3部分：1）黏膜相關(guān)淋巴組織，如腸黏膜相關(guān)淋巴組織、支氣管黏膜相關(guān)淋巴組織、泌尿生殖道黏膜相關(guān)淋巴組織、鼻咽黏膜相關(guān)性淋巴組織和眼結(jié)膜相關(guān)淋巴組織等[3]；2）致敏淋巴細(xì)胞散布途徑，主要是淋巴循環(huán)及血液循環(huán)；3）黏膜免疫效應(yīng)部位，即全身的黏膜組織，包括胃腸道、呼吸道、眼結(jié)膜、生殖道和多種分泌腺如乳腺、唾液腺、淚腺等組織。黏膜免疫是豬體免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[4]，50%以上的淋巴組織和 80% 的免疫細(xì)胞存在于黏膜，黏膜是豬最大的免疫系統(tǒng)。黏膜免疫自發(fā)現(xiàn)以來就受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為研究的熱點，黏膜免疫系統(tǒng)與傳統(tǒng)意義上的免疫系統(tǒng)不同，不僅能在黏膜局部發(fā)揮免疫功能，產(chǎn)生分泌型抗體，阻止了病原微生物從黏膜的入侵，還能通過“共同黏膜免疫系統(tǒng)”使整個機體黏膜系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護[5]，同時又能誘發(fā)全身性的體液免疫應(yīng)答[6]。黏膜局部的抗體比血清抗體出現(xiàn)得早、效價高，且維持的時間長，其抗體水平更能體現(xiàn)疫苗免疫保護情況。黏膜免疫產(chǎn)生的抗體主要以分泌型的IgA（sIgA）為主，還有分泌型的IgM（sIgM）、IgG等。隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)的疫苗注射免疫接種因存在費時費力、對豬的應(yīng)激大、操作繁瑣、容易導(dǎo)致交叉污染等問題，已經(jīng)不能完全適應(yīng)生產(chǎn)的需要。黏膜免疫可通過氣霧、口服等途徑接種，簡單易行、副作用較小，更重要的是可阻止病原在局部黏膜的定植，免疫效果好，不僅誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，也誘導(dǎo)全身性應(yīng)答等，因此越來越受到關(guān)注。文章主要介紹黏膜免疫及其在豬病防控中的應(yīng)用。

1 黏膜免疫抗體

1.1 黏膜sIgA

sIgA抗體是由漿細(xì)胞分化產(chǎn)生的，在黏膜中含量最為豐富，是參與黏膜免疫反應(yīng)的主要抗體。sIgA由兩個IgA單體、1條J鏈和一條分 泌 片 (secretory component，SC)構(gòu)成[7]，J鏈?zhǔn)窃跐{細(xì)胞分泌IgA前同IgA聚合的，SC則是由IgA穿過上皮轉(zhuǎn)運過程中加上的。SC無免疫活性，但它能促進上皮細(xì)胞積極地從組織中吸收sIgA，并將其釋放到消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜表面，從而發(fā)揮黏膜免疫效應(yīng)，還能夠保護抗體免受蛋白酶的降解，增加抗體的穩(wěn)定性，使其在消化道及呼吸道管腔中保持活性的時間延長。與單體IgA相比，sIgA表面具有大量的抗原結(jié)合位點，結(jié)合抗原的能力強。sIgA沒有活化補體和其他促炎癥因子的功能，當(dāng)發(fā)揮免疫活性時只是與腸腔中的各種抗原連接，干擾它們的攝入，因此對黏膜上皮細(xì)胞的損傷較小。sIgA的作用主要是：1）能捕捉進入黏膜內(nèi)的病原，使病原發(fā)生凝聚，阻斷其病原與黏膜結(jié)合、或與病原微生物結(jié)合形成復(fù)合物，從而阻斷或阻止病原對黏膜的黏附，發(fā)揮外源病原的免疫排斥作用；2）能與溶菌酶、補體共同作用引起細(xì)菌溶解，也能中和相應(yīng)腸毒素的毒性；3）能與吞噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）效應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞；4）增強乳鐵傳遞蛋白及乳過氧化物酶系統(tǒng)對幾種黏膜病原體的抗菌作用；5）可通過黏膜淋巴組織增強抗原依賴性細(xì)胞作用，從而提高對病原的直接殺傷能力。

1.2 黏膜 sIgM

sIgM是由5個IgM單體聚合而成，也是能發(fā)揮黏膜免疫功能的一種高效抗體。同sIgA的功能類似，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，尤其對IgA免疫缺陷的個體，sIgM的免疫功能更為重要。

1.3 黏膜中的IgG

目前，尚不清楚血清中的IgG是如何進入分泌物中的，黏膜表面的IgG抗體在抵抗感染中可發(fā)揮重要作用。分泌到管腔中的IgG同樣具有抗菌、抗病毒及抗毒素等功能。但IgG與抗原結(jié)合發(fā)揮免疫活性時，能激活補體造成黏膜上皮細(xì)胞的損傷，從而達(dá)到清除病原的作用。IgG抗體對蛋白酶的水解作用抵抗力弱，容易降解，不穩(wěn)定。IgG同sIgA一樣也能發(fā)揮ADCC效應(yīng)，殺傷靶細(xì)胞。管腔中的IgG可與抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，返回到黏膜固有層，經(jīng)樹突狀細(xì)胞處理后，遞呈給CD4+ T細(xì)胞，以供機體免疫系統(tǒng)識別。

2 黏膜免疫佐劑

經(jīng)黏膜免疫時大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原免疫力降低，經(jīng)反復(fù)大量免疫后，易引起免疫耐受，阻礙了黏膜疫苗的發(fā)展。因此，需要配合相應(yīng)的佐劑，以增強黏膜免疫反應(yīng)的效果，或使抗原物質(zhì)免于被胃腸道消化酶降解。黏膜免疫相關(guān)佐劑可提高疫苗的免疫原性，延長抗原與黏膜及免疫活性細(xì)胞的作用時間，減少黏膜免疫耐受，增強疫苗免疫效果[8]，是黏膜疫苗研發(fā)的重點。好的黏膜免疫佐劑需具備以下條件：1）能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；2）安全性好，無致熱原，無致癌致畸特性，無毒副作用，不會引起動物體的過敏反應(yīng)；3）穩(wěn)定性好，在一定溫度、pH范圍能長時間保存，性質(zhì)不發(fā)生改變。目前，人們已開發(fā)出多種黏膜免疫佐劑并投入到實際生產(chǎn)中，取得了一定的成果。

2.1 細(xì)菌毒素

主要包括從霍亂弧菌獲得的霍亂毒素（CT）、從大腸桿菌獲得的熱不穩(wěn)定毒素（LT）及從百日咳博德特氏菌獲得的百日咳毒素等。其中，CT和LT是公認(rèn)的有效的黏膜佐劑，均能提高APCs遞呈抗原的能力，具有良好的免疫原性。CT和LT均是由A、B兩種亞單位組成的六聚體蛋白，A亞單位具有催化ADP核糖基化的作用，B亞單位可與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，穿透細(xì)胞，將A亞單位帶入細(xì)胞。CT能誘導(dǎo)CD4+、Th2型細(xì)胞活化，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，也能促進IgG2b亞類、IgE和黏膜sIgA應(yīng)答的出現(xiàn)。與抗原同時口服時可誘導(dǎo)CD4+、Th1細(xì)胞產(chǎn)生血清IgM、IgG1、IgG2a和 黏 膜 sIgA。LT作為佐劑可與多種抗原經(jīng)不同途徑共免疫，均能明顯增強機體對共免抗原的黏膜sIgA和IgG應(yīng)答，與CT主要誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答不同，LT誘導(dǎo)的應(yīng)答要均衡些，產(chǎn)生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和黏膜sIgA，是Th1和Th2型應(yīng)答的混合。CT和LT均具有毒性，LT的毒性較CT低，經(jīng)黏膜免疫時可產(chǎn)生針對自身的sIgA和血清抗體，限制了其在人體上的應(yīng)用。

2.2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子通過促進免疫活性細(xì)胞的分化增殖或影響細(xì)胞內(nèi)生物活性分子的表達(dá)與分泌而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可直接作為佐劑使用。目前，常用的細(xì)胞因子佐劑有IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18 及 GM-CSF 等。IL-1和IL-12不僅能誘導(dǎo)抗原特異性的免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答。IL-1能顯著增加抗體水平，尤其是IgG2a和IgA的水平，在鼻內(nèi)免疫佐劑中可代替CT或LT，毒性相對較小。IL-18可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化發(fā)育和增殖。細(xì)胞因子佐劑的缺點是半衰期短，活性易受內(nèi)環(huán)境如pH、各種水解酶及血漿蛋白的影響，當(dāng)劑量大時可導(dǎo)致發(fā)熱、炎癥等副作用。

2.3 CpG基序

通過人工合成的一個或多個非甲基化的CpG基序為核心的寡核苷酸（ODN），也具有相似的免疫刺激功能，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的全身免疫及黏膜免疫。當(dāng)與蛋白抗原共同使用時，可誘導(dǎo)機體細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。CpG能刺激B細(xì)胞增殖，分泌多克隆抗體、IL-6、IL-12[9]，同時激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，促使未成熟的樹突狀細(xì)胞（DCs）轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腁PCs。CpG作為佐劑與抗原共同免疫動物可誘發(fā)強烈的以IgG2a和CTL為主的Th1型免疫應(yīng)答。還能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等，產(chǎn)生大量的多種細(xì)胞因子，增強機體的特異性和非特異性免疫效應(yīng)。還可與傳統(tǒng)的黏膜免疫佐劑CT和LT產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，且無毒副作用，是一種極具應(yīng)用前景的黏膜免疫佐劑。

2.4 甘露聚糖

甘露聚糖可作為黏膜反應(yīng)佐劑，誘導(dǎo)血清、陰道及唾液中sIgA的分泌。

2.5 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由單層或多層磷脂組成的具有水相內(nèi)核的環(huán)形囊狀結(jié)構(gòu)小體，對蛋白質(zhì)或多糖抗原都有免疫增強作用，能激發(fā)細(xì)胞免疫活性，提高抗體效價，而且抗體滴度維持的時間較長。脂質(zhì)體與抗原結(jié)合后可增加黏膜供給疫苗的有效性，發(fā)揮免疫佐劑效應(yīng)，能誘發(fā)高水平的系統(tǒng)IgG和黏膜sIgA抗體反應(yīng)。作為鼻黏膜免疫佐劑時，刺激機體產(chǎn)生黏膜和全身免疫應(yīng)答反應(yīng)。在酸性溶液、膽汁和胰液素中非常穩(wěn)定，因此，很適合作為口服疫苗的載體，脂質(zhì)體也可以配合其他黏膜佐劑如CT一起使用，增加口服釋放的效率。

2.6 細(xì)菌載體

應(yīng)用化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)使上細(xì)菌中的致病基因發(fā)生突變以降低其毒性，但仍保留了其對黏膜的侵襲力或從動物體內(nèi)分離的益生菌作為載體，將疫苗抗原運載至APCs。目前常用的細(xì)菌載體主要包括李斯特桿菌、鼠傷寒桿菌、志賀氏菌、乳酸桿菌、酵母菌等。一般通過口服方式進行免疫，可保護抗原免于被體內(nèi)酸性環(huán)境破壞。

3 黏膜免疫的途徑

常見的黏膜免疫途徑包括消化道、呼吸道、生殖道、直腸黏膜等。由于每個部位的組織結(jié)構(gòu)各不相同，其免疫的分子機制和效果也不同。疫苗用量較少，又能引起強烈的全身性免疫應(yīng)答反應(yīng)的途徑是最佳的途徑[10]。下面簡單介紹一下各種黏膜免疫途徑的特點。

3.1 消化道

消化道免疫主要是通過口服疫苗的方式免疫，操作方便，能同時預(yù)防腸道及呼吸道、泌尿生殖道感染，是傳統(tǒng)的黏膜免疫途徑，能產(chǎn)生大量的sIgA發(fā)揮免疫功能，但通過消化道免疫疫苗時，疫苗容易被強烈的胃酸環(huán)境破壞，免疫時需要加大劑量，或采用特殊的物質(zhì)包被，以減少胃酸對疫苗的破壞。除了sIgA發(fā)揮重要作用外，位于小腸黏膜上皮之間的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，直接與進入腸腔的微生物接觸，也在消化道黏膜免疫中發(fā)揮重要的作用。腸道是誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的有效部位，經(jīng)過腸道免疫可以產(chǎn)生較好的黏膜免疫應(yīng)答，且免疫方法簡單易行。如何使疫苗不受消化液的影響、使用少量的抗原有效地誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)，提高黏膜免疫力是目前經(jīng)消化道免疫急需解決的問題。

3.2 呼吸道

所謂呼吸道免疫主要是經(jīng)鼻腔接種疫苗，疫苗也可通過氣管激發(fā)機體免疫。鼻黏膜具有豐富的血管，接種的疫苗能吸收進入體循環(huán)，一般所需要的劑量少，鼻腔接種后可誘導(dǎo)激活扁桃體處的B淋巴細(xì)胞，在鼻或扁桃體激活的部分B細(xì)胞可進入血液循環(huán)遷移到遠(yuǎn)處黏膜組織。因此，鼻腔接種疫苗不僅能預(yù)防呼吸道感染，也能預(yù)防其他部位的感染。鼻腔接種操作簡單，不需要專門器械，并可避免由于注射而帶來的交叉感染。

3.3 生殖道

豬的一些病毒性疾病如豬偽狂犬病、豬藍(lán)耳病及豬圓環(huán)病毒病可通過公豬的精液傳播，導(dǎo)致大批母豬被感染，引起豬繁殖障礙性疾病。常規(guī)的注射免疫不能阻斷這種傳播，可通過在豬生殖道黏膜接種疫苗的方式，誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答，從而阻止疾病的傳播，黏膜免疫是解決豬繁殖障礙性疾病的重要免疫方式。

3.4 直腸

豬直腸黏膜中有大量M細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，能夠進行局部黏膜免疫。

4 黏膜免疫在豬病毒病防控中的應(yīng)用

4.1 豬流行性腹瀉防控

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）對哺乳仔豬的危害嚴(yán)重，尤其對7日齡內(nèi)的仔豬，因腸上皮細(xì)胞更新速度慢，死亡率更高，通過母乳獲得的sIgA是仔豬抵抗病毒感染的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的母豬肌注滅活疫苗不能產(chǎn)生sIgA，而接種弱毒疫苗后可能會因弱毒含量低或在腸道中的增殖能力低或與當(dāng)前流行毒株不匹配等問題，不能產(chǎn)生大量的sIgA，免疫效果差。而口服疫苗免疫可刺激母豬乳腺產(chǎn)生sIgA，sIgA在腸道中穩(wěn)定性較好，可為仔豬提供被動免疫保護。Hou等[11]構(gòu)建了能表達(dá)PEDV N基因的重組乳酸桿菌，經(jīng)口服和滴鼻免疫小鼠后，檢測其血清中抗PEDV的特異性IgG抗體水平。結(jié)果表明，重組菌能夠刺激機體產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，口服和滴鼻免疫沒有明顯的差異。分別在70 d和84 d收集腸液和肺液，用間接ELISA檢測黏膜IgA抗體水平，結(jié)果表明：無論是在小腸黏液中還是在肺泡液中均可檢測到大量的抗體，這些抗體可以中和豬流行性腹瀉病毒。葛俊偉等[12]構(gòu)建了表達(dá)PEDV COE基因的重組乳酸桿菌口服免疫小鼠，測定其免疫應(yīng)答水平。結(jié)果表明：免疫組小鼠血清、糞便中檢測到較高水平的特異性IgG、sIgA（P ＜ 0.01），血清具有中和活性（1:12），脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于對照組，IL-4和IFN-γ水平極顯著提高（P ＜ 0.01）。

4.2 豬傳染性胃腸炎防控

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是經(jīng)腸道黏膜感染的重要病毒，黏膜免疫在抵御病毒侵入機體過程中具有重要作用。宋振輝等[13]分別構(gòu)建了含TGEV M及N基因的重組桿狀病毒rBac-M和rBac-N，將兩種重組病毒分別口服免疫小鼠，收集小鼠糞便檢測sIgA抗體水平，并檢測血清中IgG。結(jié)果顯示：兩種重組病毒均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生黏膜免疫和體液免疫應(yīng)答。劉義等[14]將含有TGEV S基因的重組乳酸菌口服（灌胃）免疫BALB/C小鼠，首免、二免、加強免疫共免疫3次，每次免疫連續(xù)灌服3 d，間隔兩周,免疫劑量為0.3～0.4 mL/只。第3次加強免疫后10 d，捕殺小鼠，采集血液、脾臟、糞便，處理后采用T淋巴細(xì)胞增殖試驗及間接ELISA方法檢查免疫小鼠對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)答情況。結(jié)果表明，免疫組小鼠血清中的IgG、糞便中的sIgA與對照組有顯著差異（P ＜ 0.05）。

4.3 豬輪狀病毒病防控

輪狀病毒是引起嬰幼兒和各種幼齡動物腹瀉的主要病原之一。對輪狀病毒感染所引起的胃腸炎沒有特效治療藥物，只能通過疫苗免疫預(yù)防。目前，人用的輪狀病毒疫苗可口服免疫，效果較好，豬輪狀病毒口服疫苗的研制是疫苗研究的重要方向。葉麗萍等[15]構(gòu)建了能表達(dá)輪狀病毒Vp4的重組乳酸菌，大量培養(yǎng)后離心，加入滅菌脫脂乳液給BALB/c小鼠灌服，檢測血清抗體和腸黏膜sIgA水平，并進行小鼠免疫保護性試驗。結(jié)果表明，該重組菌能增強小鼠的黏膜免疫反應(yīng)，對豬輪狀病毒強毒株的攻擊具有一定的保護作用。

4.4 豬偽狂犬病防控

由于偽狂犬病病毒并不引起毒血癥，而主要定植在三叉神經(jīng)，使用gE缺失的弱毒疫苗局部黏膜免疫可以起到占位效應(yīng)，從而抵抗野毒的感染。同時，黏膜免疫可以避免母源抗體對免疫產(chǎn)生的影響。用豬偽狂犬病病毒活疫苗在小豬1～3日齡噴鼻免疫，是豬場豬偽狂犬病凈化的第1步，能有效抵御偽狂犬病野毒的入侵。噴鼻免疫一定要操作正確，選用專用的噴鼻器，最好不要進行滴鼻免疫，滴鼻時只有非常少的疫苗粘在鼻腔黏膜，大部分疫苗或通過吞咽反射進入胃內(nèi)被胃酸滅活或直接流出，不能有效利用，如果能配合相應(yīng)的佐劑，則能進一步提高黏膜免疫的效果。豬場在噴鼻免疫的基礎(chǔ)上再做1～2次肌肉注射免疫以建立起細(xì)胞免疫，防控豬偽狂犬病。

4.5 豬支原體病防控

豬支原體能與相應(yīng)的受體結(jié)合，并在黏膜部位的細(xì)胞內(nèi)增殖，通過“占位效應(yīng)”阻斷野毒的“入侵”。豬支原體活疫苗可噴鼻免疫，也可進行噴霧免疫操作，當(dāng)噴霧免疫時一定要控制氣溶膠顆粒的大小，粒徑太大只能吸入到咽部，粒徑太小吸入后又會被呼出，只有一定粒徑的才會停留于肺泡。另外，噴霧時一定要保持抗原的活性，否則就失去意義。如能解決保持粒徑和活性這兩個關(guān)鍵問題，氣霧型免疫就會有很好的進展。

4.6 豬圓環(huán)病毒病防控

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）可經(jīng)呼吸道、消化道、精液及胎盤等途徑傳播，能定植于黏膜系統(tǒng)（包括口鼻呼吸道、支氣管、肺及胃腸道黏膜）然后開始復(fù)制，并伺機突破血液屏障進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)。傳統(tǒng)的圓環(huán)病毒2型疫苗肌肉注射，只能獲得體液免疫，無法阻止PCV2在黏膜系統(tǒng)的定植復(fù)制及向體外排毒，黏膜免疫產(chǎn)生sIgA可通過黏膜免疫中和病毒，全面清除機體中的病毒。英國皇家科學(xué)院用食用酵母菌為載體研制了圓環(huán)病毒病的口服疫苗為粉末狀風(fēng)干重組酵母，可穩(wěn)定地表達(dá)PCV2b的殼蛋白，在母豬腸道建立了黏膜保護，從而顯著降低病毒載毒量和排毒，防止臨床疾病癥狀的發(fā)生，提高血清（IgG）和糞便（IgA）中的抗體水平，顯著降低了母豬圓環(huán)病毒2型的排毒感染壓力。

4.7 豬藍(lán)耳病防控

豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）可經(jīng)呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途徑感染豬，通過黏膜免疫可阻斷其感染。吳國軍等[16]研究證實鼻黏膜免疫接種PRRSV CH-1R株弱毒疫苗，可以刺激機體產(chǎn)生較高的黏膜免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，有效保護易感動物。Han等[17]構(gòu)建了表達(dá)PRRSV的ORF7基因重組減毒沙門氏菌，經(jīng)口服免疫小鼠12周后，在腸系膜淋巴結(jié)、小腸黏膜下淋巴集結(jié)、固有層淋巴細(xì)胞都檢測到sIgA。王振華等[18]構(gòu)建了表達(dá)PRRSV ORF6基因的重組乳酸桿菌，與黏膜佐劑CpG ODN聯(lián)合鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠，評價其佐劑效應(yīng)。結(jié)果顯示，CpG ODN佐劑協(xié)同重組菌抗原組的血清特異性抗體IgG高于單獨佐劑組和抗原組，呼吸道和腸道黏膜sIgA水平高于單獨佐劑組和抗原組，并且呼吸道黏膜sIgA抗體水平高于腸道黏膜抗體，最后一次免疫后14 d檢測脾細(xì)胞懸液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5的活性。IL-2、IFN-γ和IL-5的活性，佐劑CpG ODN協(xié)同重組菌抗原組高于單獨抗原組（P ＞ 0.05）但不顯著，極顯著高于單獨佐劑組（P ＜ 0.01），IL-4水平在各組之間差異不顯著（P ＞ 0.05）。

4.8 口蹄疫防控

口蹄疫病毒（FMDV）經(jīng)消化道、呼吸道進入動物機體，首先在咽喉部和扁桃體增殖，隨后進入血液循環(huán)系統(tǒng)，因此黏膜免疫對預(yù)防口蹄疫具有重要意義。王瀟等[19]分別構(gòu)建了含F(xiàn)MDV VP1基因及小鼠IL-10基因的重組核表達(dá)質(zhì)粒pcD-VP1和proVAX-IL-10，將兩種重組質(zhì)粒同時或pcD-VP1單獨免疫小鼠，檢測免疫效果，結(jié)果顯示：與單獨接種pcD-VP1相比，加入IL-10分子佐劑后可誘導(dǎo)更高水平的黏膜sIgA的表達(dá)及分泌，極大地提高了黏膜部位抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)及CD4+T細(xì)胞中IL-4的表達(dá)量。張馨玉等[20]用殼聚糖來包被口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1形成納米級顆粒，用此顆粒經(jīng)滴鼻、口服、直腸和生殖道4種黏膜免疫小鼠，檢測小鼠針對口蹄疫的體液和細(xì)胞免疫水平。結(jié)果顯示，殼聚糖/pcDVP1滴鼻免疫小鼠，抗體的高峰來臨比僅免疫pcD-VP1提前2周，直腸免疫處理中也呈現(xiàn)如此效果，經(jīng)口服和生殖道途徑的免疫，均沒有呈現(xiàn)比pcD-VP1免疫組更好的抗體水平。但殼聚糖/pcD-VP1在生殖道和直腸免疫途徑里均比pcD-VP1免疫組腸道集合淋巴結(jié)的T細(xì)胞增殖水平高。

4.9 豬流感防控

豬流感病毒（SIV）一般通過呼吸道黏膜感染豬，因此，如果能提高黏膜局部免疫力，可更有效阻止SIV感染。師小瀟等[21]選擇SIV血凝素（HA）的T、B抗原表位，將多個表位片段串聯(lián)，克隆到原核表達(dá)載體pET-30a（+）中，對串聯(lián)表達(dá)的重組SIV蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2，經(jīng)灌胃途徑免疫6周齡昆明小鼠，檢測免疫小鼠抗體及細(xì)胞免疫水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3免后各免疫組血清IgG抗體與PBS對照組差異極顯著（P ＜ 0.01），所有免疫蛋白組與PBS組黏膜sIgA抗體差異均極顯著（P ＜ 0.01），細(xì)胞免疫檢測顯示：所有免疫組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞增殖明顯，SIV血凝抗體檢測結(jié)果顯示，SIV-ep1免疫組、SIV-ep2免疫組、SIV-ep1與LT蛋白免疫組抗SIV H1N1亞型HI效價達(dá)1∶1024，SIV-el2蛋白免疫組HI效價達(dá)1∶512。

5 小結(jié)與展望

黏膜免疫尤其對于一些經(jīng)黏膜途徑侵入動物機體的病原防控效果更好，與傳統(tǒng)的免疫方式相比，黏膜免疫具有很多優(yōu)點，對動物應(yīng)激小，安全性好，既能產(chǎn)生局部黏膜免疫，形成黏膜抗體防護網(wǎng)，又能產(chǎn)生全身免疫應(yīng)答反應(yīng)，操作簡便，省時省力，可發(fā)揮占位效應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)殖場應(yīng)用，是未來豬用疫苗研究的方向。但在黏膜疫苗的研制過程中也存在一些問題，如在免疫佐劑的選擇、免疫途徑的確定及如何保持抗原的活性且發(fā)揮最佳的免疫效果等方面還有很多工作需要研究。目前已有專家從豬體內(nèi)分離出腸道定植的益生菌作為疫苗的載體，制備成可口服的疫苗，能使疫苗的效力達(dá)到最佳。黏膜佐劑的研制也取得了一定的進展，開發(fā)安全性、有效性、穩(wěn)定性好的新型黏膜疫苗仍然是生物技術(shù)領(lǐng)域及生命科學(xué)工作者的重大挑戰(zhàn)。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，黏膜免疫將在今后豬病的防控中發(fā)揮越來越重要的作用。