布魯氏桿菌病檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

杜清春，王 鵬

（1. 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，大理671000；2. 云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理 671000）

布魯氏桿菌?。╞rucellosis），簡(jiǎn)稱(chēng)布病，是由革蘭陰性、兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的布魯氏桿菌（Brucella）引起的人獸共患疾病，是我國(guó)法定乙類(lèi)傳染病，布魯氏桿菌由英國(guó)軍醫(yī)Bruce于1887年在因患馬耳他熱而致死的英國(guó)士兵脾臟中首次分離[1]。目前，F(xiàn)AO和WHO根據(jù)布魯氏桿菌的生化特性、對(duì)自然宿主的選擇性和致病性，將布魯氏桿菌屬分為6個(gè)種（species）19個(gè)生物型（biovars）。6個(gè)種分別為羊種（Brucella melitensis）、牛種（Brucella abortus）、豬種（Brucellasuis）、沙林鼠種（Brucella neotomae）、犬種（Brucella canis）和綿羊附睪種（Brucella ovis）；根據(jù)表型羊種分為3個(gè)生物型（1、2、3型），牛種分為8個(gè)生物型（1～7、9型），豬種分為5個(gè)生物型（1～5型），沙林鼠種、犬種和綿羊附睪種各一個(gè)生物型。另外還發(fā)現(xiàn)海洋哺乳動(dòng)物有鯨型海洋種（Brucellaceti）和鰭型海洋種（Brucella pinnipedialis）2個(gè)新種，尚未正式命名和分類(lèi)[1-2]。

1 布魯氏桿菌病的危害

布魯氏桿菌病的傳染源主要是病畜和感染者（包括野生動(dòng)物），其中最危險(xiǎn)和最常見(jiàn)的是被感染的母畜，其流產(chǎn)物及產(chǎn)后陰道分泌物中含有大量的布魯氏桿菌，若在處理時(shí)沒(méi)有采取必要的防護(hù)措施，則極易發(fā)生感染；此外，人通過(guò)食用含病原菌的病畜肌肉、內(nèi)臟和乳汁也可感染[3]。

在已知的6個(gè)布魯氏桿菌種中，對(duì)人具有感染性和侵襲力的是羊種、豬種、牛種和犬種，其中羊種布魯氏桿菌感染的數(shù)量最多，占90%以上[2-3]。母畜感染布魯氏桿菌的主要臨床癥狀是流產(chǎn)，其次是早產(chǎn)、死胎或弱胎[4]；有些母畜會(huì)發(fā)生子宮炎或膿腫導(dǎo)致生育能力下降、產(chǎn)乳量下降，有的還會(huì)發(fā)生關(guān)節(jié)炎和滑囊炎而導(dǎo)致跛行。公畜患病后主要表現(xiàn)為睪丸炎和副睪炎，后肢麻痹導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙[1-4]。

人感染布魯氏桿菌患病后主要表現(xiàn)為反復(fù)持續(xù)的發(fā)熱癥狀和關(guān)節(jié)腫脹疼痛，因關(guān)節(jié)炎而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙。男性患者還會(huì)出現(xiàn)睪丸炎和前列腺炎，女性患者特別是妊娠期的孕婦會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀[5]。目前，在全球170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已發(fā)現(xiàn)人、畜布魯氏桿菌病的存在和流行[2]。布魯氏桿菌病的爆發(fā)流行往往會(huì)給一個(gè)國(guó)家和地區(qū)的人民帶來(lái)生命和財(cái)產(chǎn)的巨大損失。特別是在牧區(qū)，如我國(guó)的新疆維吾爾族自治區(qū)、內(nèi)蒙自治區(qū)等地，有效地防治布魯氏菌病將直接關(guān)系到牧區(qū)人民的生活水平和我國(guó)的衛(wèi)生發(fā)展，而布魯氏桿菌病的檢測(cè)是布魯氏桿菌病防控中的重要環(huán)節(jié)，在布魯氏桿菌病的防控中有著重要的意義。

2 布魯氏桿菌檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀

2.1 病原學(xué)的檢測(cè) 檢測(cè)到布魯氏桿菌是診斷布魯氏桿菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。布魯氏桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求較高，一般用血清葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、肝湯瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[6-7]，待菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)其形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性、生化反應(yīng)特點(diǎn)及染色特征進(jìn)行鑒別。布魯氏桿菌菌落生長(zhǎng)形態(tài)呈稍隆起的圓形、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)、大小為0.5～1.0 mm，在血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為白色，且不溶血，在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基斜面上可長(zhǎng)出水溶性微棕色菌苔。布魯氏桿菌的染色一般用柯茲羅夫斯基染色法染色，在顯微鏡下觀察，布魯氏桿菌為紅色球桿狀小桿菌，而其他菌為藍(lán)色，多呈散在分布，偶見(jiàn)成對(duì)、短鏈狀或串狀排列，邊緣稍圓或直[8]；布魯氏桿菌寬0.3～0.6 μm，長(zhǎng)0.6～1.5 μm，無(wú)芽胞、無(wú)鞭毛、不形成莢膜。但是，由于布魯氏桿菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)（短則3～8 d，長(zhǎng)則可達(dá)45 d），且布魯氏桿菌的分離率較低，常常影響臨床醫(yī)師對(duì)該病及時(shí)做出診斷，導(dǎo)致病情加重[7]；此外，布魯氏桿菌的分離培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境有一定的要求，需要經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)和有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員在BSL-2（Biosafety Level 2 Laboratory）級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室操作[8]。所以，布魯氏桿菌的分離培養(yǎng)一般不適合臨床的快速診斷和現(xiàn)場(chǎng)疫情的篩查，但可用于流行病學(xué)的追蹤調(diào)查。

2.2 血清學(xué)的檢測(cè)

2.2.1 虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)（rose-bengal plate agglutination test，RBT） 用經(jīng)培養(yǎng)并滅活的布魯氏桿菌作為抗原，離心收集菌體經(jīng)虎紅染料染色后懸于乳酸緩沖液中制成。因該方法靈敏度高、檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)便且價(jià)格合理，在國(guó)際貿(mào)易中被指定用于牛、羊、豬布魯氏桿菌病的檢測(cè)，適于動(dòng)物群體布魯氏桿菌病的普查，也常用于人布魯氏桿菌病的初篩和監(jiān)測(cè)[7-8]。

2.2.2 試管凝集實(shí)驗(yàn)（standard tube agglutination test，SAT） SAT于1897年開(kāi)始應(yīng)用，是免疫學(xué)方法診斷布魯氏桿菌病的基石，雖然該方法在發(fā)達(dá)國(guó)家已停用，但目前仍然是我國(guó)診斷布魯氏桿菌病的法定方法[7-8]。SAT準(zhǔn)確性高、可以半定量、具有較高的特異性、對(duì)IgM敏感性高，用于布魯氏桿菌的早期診斷；但該方法操作繁瑣，需在37℃條件下孵育過(guò)夜，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，不適用于現(xiàn)場(chǎng)疫情的快速篩查[8-9]。

2.2.3 全乳環(huán)狀實(shí)驗(yàn)（protocol of milk ring test，MRT） MRT的本質(zhì)是抗原抗體的反應(yīng)，用經(jīng)染成紅色的布魯氏桿菌作為抗原，當(dāng)奶樣中存在布魯氏桿菌抗體時(shí)，紅色的抗原抗體復(fù)合物便會(huì)轉(zhuǎn)移至乳脂層，從而形成紫紅色的乳脂環(huán)[7]。MRT主要用于乳樣中的布魯氏桿菌篩查，且世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定該方法只能用于奶牛檢測(cè)。因MRT操作簡(jiǎn)便快速、檢測(cè)成本低廉，常用于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模奶牛篩查檢測(cè)，但該方法敏感性差，在檢測(cè)牛初乳、發(fā)情旺盛期奶牛、接近干奶期的奶牛、患乳房炎的奶牛等均可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[7-9]。

2.2.4 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（complement fixation test，CFT） 主要根據(jù)是否發(fā)生溶血現(xiàn)象來(lái)判斷受檢血清中有無(wú)抗體[10]。CFT是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織公認(rèn)的布魯氏桿菌病確診性實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于其他血清學(xué)檢測(cè)方法，CFT的特異性強(qiáng)和敏感度高，適用于牛、羊、綿羊附睪種布魯氏桿菌病的診斷[8-9]。由于豚鼠補(bǔ)體的作用效果會(huì)受到豬的補(bǔ)體干擾，使實(shí)驗(yàn)敏感性下降38%～40%，因此CFT不適用于豬布魯氏桿菌病的檢測(cè)和診斷[7-11]；此外，CFT主要通過(guò)肉眼觀察溶液顏色的變化來(lái)判斷溶血程度，結(jié)果帶有一定的主觀性，且該方法實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高，不適宜在基層推廣和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[12]。

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ Enzyme-linked immuonsorbant assay，ELISA） ELISA相對(duì)于其他血清學(xué)檢測(cè)方法而言，其靈敏度高、特異性強(qiáng)，所需樣品量少，可以用作確診實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也可用于大批量樣本篩查[13]，在布魯氏桿菌病診斷中，主要用于血清和乳樣中抗體的檢測(cè)。1976年，Carin-Bastuji等[14]第一次用ELISA檢測(cè)血清中布魯氏桿菌抗體，并發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度是SAT的10～100倍。目前，ELISA所選用的抗原主要是S-LPS，抗原決定族又主要位于LPS的O鏈上，但粗糙型布魯氏桿菌的表面缺乏O鏈，所以基于LPS-O鏈的檢測(cè)方法無(wú)法確診粗糙型布魯氏桿菌感染引發(fā)的布病[13]。雖然ELISA靈敏度高，卻不能分辨出接種牛種布魯氏桿菌或羊種Rev1疫苗產(chǎn)生的抗體和自然感染產(chǎn)生的抗體，故多用于非免疫家畜的篩查；ELISA具有高特異性和高敏感性等優(yōu)點(diǎn)，于2004年被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為診斷牛種布魯氏菌病的推薦方法[13-14]。ELISA操作繁瑣，需在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及向基層推廣[15]。

2.2.6 膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography，GICA） GICA操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短（2 min后觀察結(jié)果，15 min完成檢測(cè)），對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求不高，血清樣品用量少，且方法特異、靈敏，適用于臨床疾病的初步診斷、現(xiàn)場(chǎng)疫情的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查研究，也用于人布魯氏桿菌病的監(jiān)測(cè)[16]。當(dāng)用GICA檢測(cè)組織切片中菌體抗原時(shí)，最小檢出量為200 CFU/mL，其敏感性略高于ELISA和PCR[17-18]。但是，GICA只能做定性篩查還不能實(shí)現(xiàn)定量、質(zhì)控指標(biāo)統(tǒng)一以及其靈敏度還需進(jìn)一步提高[19]。目前，膠體金試紙條市場(chǎng)需求較大，特別是在各醫(yī)院檢驗(yàn)科，因該方法成本低且簡(jiǎn)便快速，常常作為初篩的手段。

2.3 核酸檢測(cè)技術(shù)

2.3.1 普通PCR（polymerase chain reaction） 目前，普通PCR法檢測(cè)布魯氏菌病的引物主要有編碼BCSP-31序列的B4/B5、16SrRNA（F4/R2）、外膜蛋白如omp31、 omp10、omp2a、omp2b等[20]。1990年，F(xiàn)eteke等首次應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)布魯氏桿菌病，表明該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短，可用于大批量樣品的檢測(cè)[3-5,20]。單對(duì)引物的PCR雖然可檢出含有布魯氏桿菌的樣品，但不能完全區(qū)分鑒別布魯氏桿菌屬的所有生物型。

2.3.2 多重PCR 即在同一反應(yīng)體系中加入兩對(duì)及以上的引物，能同時(shí)檢出多種病原的PCR技術(shù)。Bricker等[21]于1994年首次報(bào)道了能區(qū)分牛種、羊種、綿羊附睪種和豬種布魯氏桿菌的AMOS-PCR法，該方法能檢測(cè)到四種布魯氏桿菌的部分生物型，如牛種的1、2、4型，羊種的3個(gè)型，豬種的1型等。1999年，Sreevatsan等[22]根據(jù)BCSP31K基因和hsp65基因設(shè)計(jì)引物，建立了能檢測(cè)牛奶及牛鼻分泌物中的牛分支桿菌和布魯氏桿菌的二重PCR。多重PCR具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測(cè)多種病原體，節(jié)約了時(shí)間和試劑，為臨床診斷提供更多的依據(jù)[22]。鐘旗等[23]應(yīng)用AMOS-PCR法進(jìn)一步鑒定布魯氏桿菌生物型后，發(fā)現(xiàn)該方法還可以鑒定犬種布魯氏桿菌，能區(qū)分S19疫苗株和野毒株，表明AMOS-PCR法的特異性和敏感性均高于布魯氏桿菌的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法。此外，彭小兵等[24]于2010年以eri作為布魯氏桿菌屬的特異性基因，同時(shí)以IS711基因的拷貝數(shù)差異為布魯氏桿菌種間特異性標(biāo)志，建立了能同時(shí)鑒別羊種、牛種和豬種的三重PCR。雖然多重PCR能同時(shí)檢測(cè)多種病原體，但其引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，而且易產(chǎn)生PCR的副產(chǎn)物焦磷酸[22-23]。

2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence qPCR） Redkar等[25]于2000年根據(jù)IS711元件設(shè)計(jì)了上游引物，根據(jù)每個(gè)菌種的特異序列設(shè)計(jì)下游引物，并用熒光標(biāo)記，由此建立了能特異性檢測(cè)牛種布魯氏桿菌、羊種布魯氏桿菌和豬流產(chǎn)布魯氏桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。2005年，Debeaumont等[26]建立了能夠檢測(cè)人血清中布魯氏桿菌的RT-PCR，結(jié)果表明其特異性和敏感性均強(qiáng)于病原的分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高度特異性和敏感性，是目前確定樣品中DNA拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法，它最大的優(yōu)點(diǎn)在于克服了終點(diǎn)PCR在進(jìn)入平臺(tái)期后進(jìn)行定量帶來(lái)的誤差，實(shí)現(xiàn)了DNA或RNA模板的精確定量；此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR比普通PCR操作簡(jiǎn)便，不用進(jìn)行電泳，避免了因擴(kuò)增產(chǎn)物帶來(lái)的污染，同時(shí)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，在3 h之內(nèi)即可得出結(jié)果[25-26]。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要特殊的檢測(cè)設(shè)備，所用試劑如探針、Mix等比較昂貴，為了避免污染需對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求較高，所以不適于在基層推廣和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[22,27]。

3 展望

目前，世界范圍內(nèi)檢測(cè)布魯氏桿菌的方法主要有病原體的分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法和PCR技術(shù)，血清學(xué)診斷仍是我國(guó)的法定方法。但無(wú)論何種方法，都存在某些不足之處，也不能相互取代，到目前為止，還未有單一的方法適用于任何情況下進(jìn)行快速準(zhǔn)確的布病檢測(cè)。所以，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體并能適用于流行病學(xué)調(diào)查和大批量樣品篩查的檢測(cè)方法，不僅是時(shí)代的需求，也是現(xiàn)代公共衛(wèi)生需要重點(diǎn)突破的難題。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高并能對(duì)DNA含量進(jìn)行實(shí)時(shí)定量，逐漸被廣泛應(yīng)用。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，手?jǐn)y式熒光檢測(cè)PCR儀的面市，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)已可逐步實(shí)現(xiàn)，建立起多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，不僅能在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多種病原體，還能節(jié)約時(shí)間、試劑和費(fèi)用，大大提高了檢測(cè)效率。