腐殖酸對低濃度百菌清的緩釋增效作用

魏世平，吳萌，李桂龍，江春玉，劉明，陳瑞蕊，李忠佩

?

腐殖酸對低濃度百菌清的緩釋增效作用

魏世平1,2，吳萌1，李桂龍1，江春玉1，劉明1,2，陳瑞蕊1,2，李忠佩1,2

（1中國科學院南京土壤研究所土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，南京 210008；2中國科學院大學，北京 100049）

【目的】明確腐殖酸對低濃度（5 mg·L-1）百菌清（chlorothalonil）的緩釋增效作用，為減少農藥使用量、延長農藥藥效提供新的科學思路，為選擇新的農藥增效劑提供理論依據?！痉椒ā繉⒏乘幔?0 mg·L-1）添加至低濃度百菌清中，進行尖鐮孢（）的體外平板及液體培養(yǎng)，通過菌絲體生長試驗及血球計數板、等溫微量熱技術，測定相應的抑菌率（inhibition rate，IR）、孢子體數量以及生長代謝過程中的熱量排放?！窘Y果】將對照抑菌率設定為0，腐殖酸-百菌清復配處理較百菌清處理的IR顯著提高了10.29%（＜0.05），相對增效達到25.33%。液體搖菌培養(yǎng)過程中，搖菌培養(yǎng)的第3天，百菌清處理與腐殖酸-百菌清復配處理的孢子數無顯著差異；搖菌培養(yǎng)第7天，百菌清處理的孢子數極顯著低于其他處理（＜0.01）；搖菌培養(yǎng)的第14天，腐殖酸-百菌清復配處理的孢子數顯著低于其他處理（＜0.05），而百菌清處理與對照之間無顯著差異，表明腐殖酸延長了低濃度百菌清對尖鐮孢孢子數增加的抑制效應。各處理的熱功率-時間曲線圖顯示，腐殖酸-百菌清復配處理熱量排放曲線在監(jiān)測的72 h內未檢測到熱排放峰；而單獨添加百菌清的處理在試驗的后期重新出現熱排放峰；單獨添加腐殖酸處理的熱排放曲線與對照曲線接近。對熱功率-時間曲線相關參數進一步分析，結果顯示百菌清處理的Pmax（最大熱功率）顯著低于對照和腐殖酸處理（＜0.05），而Tmax（最大熱功率時間）顯著高于對照和腐殖酸處理（＜0.05）；腐殖酸-百菌清復配處理的Pmax、Q（整體發(fā)熱量）、k（生長速率常數）均顯著低于其他處理（＜0.05），表明該處理病原菌的生長代謝活性顯著低于其他處理，即病原菌生長代謝受到抑制的程度最大；腐殖酸處理與對照曲線各參數之間無顯著差異，表明病原菌的生長代謝活性沒有受到抑制，同時說明腐殖酸-百菌清復配處理中生長代謝受到的抑制作用與腐殖酸本身無關?！窘Y論】添加腐殖酸可以顯著提高低濃度百菌清對尖鐮孢菌絲體生長、孢子體數量增加以及生長代謝過程中能量排放的抑制能力。將腐殖酸作為低濃度百菌清的農藥增效劑，是降低百菌清用量及延長百菌清藥效的有效措施。

腐殖酸；百菌清；等溫微量熱；緩釋增效作用

0 引言

【研究意義】尖鐮孢（）是引起多種農作物根腐病、枯萎病的主要真菌致病菌，嚴重危害農作物的生長和糧食安全[1-2]。針對該致病菌的防治技術包括農業(yè)防治、物理防治、化學防治和生物防治，其中化學防治仍然是目前主要的防治手段，百菌清（chlorothalonil）、多菌靈（carbendazim）、代森錳鋅（mancozeb）等殺菌劑是農業(yè)上常用的化學防治藥劑[3]。作為一種廣譜高效的保護性殺菌劑，百菌清被廣泛應用于農業(yè)生產中，但隨著使用年限的增加，防治效果逐年下降；且百菌清在水體、土壤中的累積殘留量給生態(tài)環(huán)境和人類帶來了新的威脅[3-5]。農業(yè)生產中如何提高農藥藥效，進而減少農藥的使用量，成為一種研究趨勢[6]。農藥增效劑是解決這一生態(tài)環(huán)境問題的重要途徑[7]?！厩叭搜芯窟M展】越來越多的綠色農藥增效劑應用到農業(yè)生產中，如植物油、生物堿、萜烯、茶皂素、腐殖酸等[8-11]。研究證明腐殖酸能夠通過理化作用與農藥形成復合物，降低農藥毒性，減少環(huán)境污染，是一種較好的農藥緩釋增效劑。腐殖酸類物質在結構單元組成上包含大量的活性基團，如羧基、羰基、醇羥基、醌基等，這些活性基團使得腐殖酸-農藥復配體系在殺菌、殺蟲等過程中發(fā)揮了重要的作用[12]。研究發(fā)現，腐殖酸類物質可作為甲基托布津、多菌靈等農藥的增效劑[13]。王任明等[14]通過室外盆栽接蟲和田間小區(qū)試驗，得出黃腐酸對殺蟲脒存在較好的增效作用；金平等[15]用1% NaOH提取出泥炭的腐殖酸，將其與克露復配噴施黃瓜葉片，從生理機制上證明了腐殖酸對克露起到增效作用。【本研究切入點】目前還未見腐殖酸對百菌清緩釋增效作用的報道。另外，田間接種和生理指標測定的試驗方法存在工作量大、耗時長等弊端，因此，探索一種新的試驗方法實現對農藥增效劑的有效篩選意義重大。等溫微量熱技術在醫(yī)學上已經普遍用于檢測藥物活性及其定量構效關系的研究（quantitative structure-activity relationship，QSAR）[16-17]，但利用等溫微量熱技術來篩選農藥增效劑的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】將腐殖酸與農藥百菌清同時添加至純菌培養(yǎng)基中，通過測定病原菌菌絲體的凈生長量以及孢子體數量，探索腐殖酸-百菌清復配體系對尖鐮孢體外生長的直接影響，同時利用等溫微量熱儀監(jiān)測復配體系及單獨添加處理生長代謝過程中的熱排放，實時監(jiān)測微生物代謝活性的變化，為農藥增效劑的選擇提供新的篩選方法以及衡量指標，為擴大腐殖酸在農業(yè)領域的應用提供理論依據，為我國煤礦、泥炭等腐殖酸材料來源的充分利用提供新的途徑。

1 材料與方法

試驗于2017年7月至2018年6月在中國科學院南京土壤研究所土壤與農業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室完成。

1.1 腐殖酸材料來源及提取、純化

供試腐殖酸材料來源于褐煤，購自內蒙古自治區(qū)烏海市同升商貿有限責任公司，其腐殖酸的提取、純化過程參考文獻[18-19]。經元素分析儀測定該腐殖酸含碳565.5 g·kg-1，氮15.1 g·kg-1，硫5.1 g·kg-1，氧339.4 g·kg-1。13C固態(tài)核磁光譜顯示，其化學組成中各碳組分的相對比例為烷基碳11.6%，甲氧基/酰胺碳0.6%，烷氧碳0.7%，異頭碳3.4%，芳香碳64.8%，芳香族碳氧8.5%，羰基碳10.5%。

1.2 病原菌來源

供試菌種尖鐮孢購自中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心，為花生根腐病致病菌株。

1.3 菌絲體體外平板培養(yǎng)試驗

試驗設置4個處理，分別為PSA（potato sugar agar）培養(yǎng)基對照、單獨添加低濃度百菌清處理、單獨添加腐殖酸處理以及同時添加腐殖酸和低濃度百菌清的處理。

PSA固體培養(yǎng)基配方：200 g馬鈴薯加蒸餾水煮沸，小火煮20 min，加20 g蔗糖和18 g瓊脂粉，定容至1 L，115℃滅菌，30 min。PSA液體培養(yǎng)基的配制不添加瓊脂粉。

將腐殖酸和百菌清用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，并用含有200 μg·mL-1乳化劑的無菌蒸餾水稀釋至相應濃度，腐殖酸添加濃度為50 mg·L-1，百菌清添加濃度為5 mg·L-1。吸取1 mL檢測液至無菌培養(yǎng)皿中（直徑9 cm），加入9 mL的PSA固體培養(yǎng)基。菌絲接種環(huán)的直徑約5 mm，將致病真菌接種至各處理培養(yǎng)皿的中間位置，25℃培養(yǎng)72 h，測量菌絲體的生長直徑，每處理 3—4個重復。

1.4 孢子體計數

試驗處理同1.3，但固體培養(yǎng)基改為不添加瓊脂的PSA液體培養(yǎng)基。將致病菌從平板上接種至PSA液體培養(yǎng)基中，30℃搖菌培養(yǎng)48 h（搖菌時間根據孢子濃度適當調整），吸取一定體積的菌懸液至含有新鮮培養(yǎng)基的不同處理中，接種后孢子初始濃度控制在2.5×105個/mL[17,20]，將各處理菌懸液置于25℃搖菌，分別于搖菌培養(yǎng)的第3、7、14、33天采樣進行孢子數計數。使用血球計數板進行計數，血球計數板規(guī)格為25個中方格×16個小方格，選擇左上、左下、右上、右下以及中央的中方格進行孢子計數，對于臨界的孢子體需遵循數上不數下，數左不數右的原則，最后折算為各搖菌瓶中的孢子總數。

1.5 熱動力學試驗

試驗處理同1.4，4 mL的安培瓶內最終上機液體體積為3 mL，其中包含各處理相應量的菌懸液、DMSO、腐殖酸、百菌清及PSA液體培養(yǎng)基。菌懸液配制同1.4，最終上機真菌孢子數同樣為2.5×105個孢子/mL。將安培瓶置于TAM III（TA Instruments，Utah，USA）檢測通道中，設定油浴溫度為25℃恒溫，代謝反應過程中的功率-時間曲線被連續(xù)監(jiān)測72 h（根據試驗結果可適當調整）。用TAM assistant軟件對熱排放曲線進行處理，匯總各熱排放曲線的相關參數，包括最大熱功率（Pmax）、最大熱功率時間（Tmax）、整體發(fā)熱量（Q）和生長速率常數k[21-23]。

1.6 數據處理與統(tǒng)計分析

根據真菌菌絲體凈生長量計算抑菌率（inhibition rate，IR），計算公式：IR（%）=100×（對照菌絲體凈生長量-處理菌絲體凈生長量）/對照菌絲體凈生長量。

腐殖酸-百菌清復配處理的相對增效（%）=100×（復配處理抑菌率-百菌清處理抑菌率）/百菌清處理抑菌率。

熱功率-時間曲線中生長速率常數k是由OriginPro8.0中Exponential進行指數模型擬合得到。各處理抑菌率、孢子數以及熱排放曲線相關參數的單因素方差分析和Tukey B、Duncan多重比較由SPSS 25.0完成。

2 結果

2.1 腐殖酸對百菌清抑制病原菌菌絲體生長的作用

將對照抑菌率（IR）設為0，得到各處理對尖鐮孢的IR（表1）。表1中百菌清、腐殖酸以及腐殖酸-百菌清復配處理對尖鐮孢的IR均大于0，即各處理均存在抑制作用。同時，腐殖酸-百菌清復配處理的IR較百菌清處理有顯著的提高，相對增效為25.33%，表明腐殖酸對低濃度百菌清抑制尖鐮孢菌絲體生長存在顯著的增效作用。

表1 不同處理對尖鐮孢的抑菌率

數據后不同字母表示Tukey B多重比較差異顯著（＜0.05）

Different letters behind the values indicate significantly different at＜0.05 level by Tukey B multiple comparisons

2.2 腐殖酸對百菌清抑制病原菌孢子體數量增加的作用

利用血球計數板對各處理不同培養(yǎng)時間采樣的真菌孢子體進行計數，結果見圖1。搖菌培養(yǎng)的第3天，對照與腐殖酸處理的孢子數極顯著大于百菌清處理與腐殖酸-百菌清復配處理，而百菌清處理與腐殖酸-百菌清復配處理的孢子數之間無顯著差異；搖菌培養(yǎng)第7天，對照的孢子數極顯著大于腐殖酸處理及腐殖酸-百菌清復配處理，而百菌清處理的孢子數極顯著小于其他處理；搖菌培養(yǎng)第14天，腐殖酸-百菌清復配處理的孢子數顯著小于其他處理，而百菌清處理與對照之間無顯著差異。以上結果表明腐殖酸對低濃度百菌清抑制尖鐮孢孢子數增加的效應存在顯著的延長作用。

圖中同一培養(yǎng)時間下處理間不同字母為Duncan多重比較結果。*：差異顯著（P＜0.05）；**：差異極顯著（P＜0.01）

2.3 腐殖酸對百菌清抑制病原菌生長代謝的作用

各處理尖鐮孢熱功率-時間曲線見圖2。熱功率-時間曲線圖顯示腐殖酸處理與對照的熱排放曲線接近，表明兩個處理中病原菌的生長代謝過程相近，即腐殖酸對病原菌在生長代謝過程中的熱量排放未檢測到抑制作用。而百菌清處理與對照、腐殖酸處理差異較大，在監(jiān)測初期熱量排放曲線接近直線，百菌清對病原菌的生長起到了很好的抑制作用，這一過程主要來自百菌清殺滅病原菌的作用，隨著監(jiān)測時間的延長，熱排放峰又重新出現，表明百菌清對病原菌的藥效減弱，病原菌重新開始生長產生代謝熱。腐殖酸-百菌清復配處理從監(jiān)測初期開始熱排放一直呈現直線狀態(tài)，表明代謝熱的排放始終受到抑制。從圖3也可以看出，4個處理經微量熱儀72 h、25℃恒溫監(jiān)測培養(yǎng)后，只有腐殖酸-百菌清復配處理的安培瓶中未見明顯的菌絲，這與熱功率-排放曲線的結果一致。

熱功率-時間曲線的Pmax、Tmax、Q和k是用于評估微生物代謝活性的相關參數，其中Pmax、Q和k與代謝活性成正相關，而Tmax與代謝活性成負相關。各處理熱功率-時間曲線的相關參數（圖4）經進一步的統(tǒng)計分析得到，百菌清處理的Pmax顯著低于對照和腐殖酸處理，而Tmax顯著高于對照和腐殖酸處理，表明病原菌生長代謝活性受到百菌清的顯著抑制。腐殖酸-百菌清復配處理的Pmax、Q、k均顯著低于其他處理，表明該處理病原菌的生長代謝活性顯著低于其他處理，即病原菌生長代謝受到抑制的程度最大。腐殖酸處理與對照各參數之間無顯著差異，表明病原菌的生長代謝活性沒有受到抑制，同時說明腐殖酸-百菌清復配處理中生長代謝受到的抑制作用與腐殖酸本身無關。由于腐殖酸-百菌清復配處理的熱排放曲線接近直線，故Tmax在初始時最大。綜上，腐殖酸對百菌清殺滅尖鐮孢存在顯著的緩釋增效作用。

圖2 不同處理尖鐮孢的熱功率-時間曲線

1：對照control；2：百菌清處理chlorothalonil treatment；3：腐殖酸處理humic acid treatment；4：腐殖酸和百菌清復配處理humic acid-chlorothalonil combined treatment

3 討論

通過尖鐮孢體外培養(yǎng)和熱動力學技術，本研究證實了腐殖酸對低濃度百菌清的緩釋增效作用，增效作用提高的抑菌率與前人總結的10%—20%的增效范圍相符[12]。目前在農業(yè)生產上，腐殖酸的主要應用包括作為土壤調節(jié)劑來改善土壤屬性，以及作為植物刺激素來促進植物生長和增加作物產量[24-26]。而本研究的結果為拓展腐殖酸的應用范圍提供了理論依據，即將腐殖酸作為農藥增效劑來增加和延長百菌清的藥效。早期的研究中，李善祥[12]就指出腐殖酸作為一種高效、無公害、低成本、多功能的農藥增效劑有著廣闊的發(fā)展前景，并且將腐殖酸的增效機理概括為：（1）腐殖酸與農藥之間的化學作用，使得農藥的化學結構發(fā)生變化從而導致其活性結構的改善；（2）腐殖酸沒有明顯影響農藥的化學結構，但增加了農藥的表面活性、膜透性、生理生化作用以及吸附作用等。金平等[15]研究證實了腐殖酸對克露的增效作用，其生理機制主要是因為腐殖酸-克露復配處理降低了黃瓜葉片脯氨酸、丙二醛的含量以及質膜透性、黃瓜霜霉病的病情指數，從而促進了黃瓜的生長，提高了黃瓜的產量及谷胱甘肽的含量；于宏偉等[9]認為黃腐酸是一種膠體物質，同時具有表面活性劑的作用，對有機農藥具有強烈的吸附作用，并且使難溶于水相的農藥更好地分散，以此來增加殺菌劑的殺菌效果；Abdel- Monaim等[27]利用可溶性腐殖酸鉀顆粒與苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）浸泡大豆種子，在大田種植條件下，腐殖酸鉀-苯并噻二唑復配體系浸泡后的處理能夠有效地抵抗尖鐮孢對大豆植株的危害；復配處理植株的過氧化物酶（PO）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3種酶活性和酚含量最高。腐殖酸鉀增效的機理為增加的PO和PPO活性可以產生氧化形式的醌，這可能有助于增加防御能力，因為氧化形式的醌可以滅活病原菌產生的果膠酶。PAL是一種苯丙類化合物的關鍵酶，它會導致各種與防御有關的植物次生代謝物的產生，如水楊酸、植物抗毒素和類木質素聚合物等。

柱上不同字母表示Tukey B多重比較差異顯著（P＜0.05）

本研究中，百菌清處理的熱功率-時間曲線從生長代謝方面較好地體現了百菌清的重要殺菌機理，即通過對病原菌糖酵解過程產生影響而起到殺滅致病菌的作用。糖酵解過程中，3-磷酸甘油醛在磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的催化下，轉變?yōu)?,3-二磷酸甘油酸，同時將氧化過程產生的能量貯存到三磷酸腺苷（ATP）分子中。而百菌清分子中的活性氯能夠與磷酸甘油醛脫氫酶上的-SH結合，生成一種復合物，從而使酶的活性喪失，中斷糖酵解過程中3-磷酸甘油醛的脫氫氧化，影響ATP的產生[28-29]。等溫培養(yǎng)初期百菌清抑制了病原菌的糖酵解過程，沒有熱量排放，故熱排放曲線接近直線，后期隨著百菌清藥效的降低，病原菌糖酵解過程恢復，重新出現熱排放峰。腐殖酸-百菌清復配處理，其熱功率-時間曲線始終為近似直線排放，筆者推斷在腐殖酸存在的條件下，百菌清對病原菌糖酵解過程的影響增大，且對能量產生的抑制作用更持久，從而無法出現熱排放峰。這與張國生等[7]總結的農藥增效劑主要作用機理相一致，即農藥增效劑是通過抑制或弱化靶標（害蟲、雜草、病菌等）對農藥活性的解毒作用，延緩藥劑在防治對象內的代謝速度，從而增加防治效果。后續(xù)還需對腐殖酸的結構以及對腐殖酸-百菌清復配體系中的相關酶活性、谷胱甘肽含量等進行研究測定，從而對作用機理有更深入的了解。同時，為了更好地詮釋腐殖酸緩釋增效作用的機理，下一步還需要涉及更多不同來源、結構組成的腐殖酸。

本研究中等溫微量熱技術與病原菌離體培養(yǎng)試驗結果的一致性表明等溫微量熱技術應用于農藥增效劑篩選具有可行性。在應用生物學和醫(yī)學領域，等溫微熱技術的非標記和被動屬性可以對復雜的三維結構進行測量（如微觀組織），以此來代替破壞性的常規(guī)分析（如DNA或蛋白質的量化）[30]。在土壤學領域，微量熱技術與高效氣液相色譜、高通量測序等技術的結合，有望在土壤微生物活性與結構的地理屬性、氣候變化、土壤質量的空間大尺度比較和外源污染物的生物毒性評價等方面發(fā)揮其重要作用[31]。Tafin等[17]在純培養(yǎng)條件下，利用等溫微量熱技術估算兩性霉素B、卡泊芬凈等組合對兩株曲霉（和）的抑制活性，研究證實微量熱技術具有實時評估藥物組合抑真菌活性的潛力。等溫微量熱技術同時還具備操作方便、檢測靈敏、材料消耗少且重現性好等優(yōu)勢，具有很好的應用前景。

4 結論

腐殖酸對低濃度百菌清存在顯著的緩釋增效作用。在低濃度百菌清體系中添加腐殖酸，可以顯著增加低濃度百菌清對尖鐮孢的抑菌率，抑制尖鐮孢孢子體數量的增加和生長代謝過程。將腐殖酸作為百菌清的農藥增效劑具有生產和商業(yè)應用潛力。等溫微量熱技術作為篩選農藥增效劑新的方法及衡量指標具有可行性。

[1] 張述義, 李新鳳, 韋曉艷, 王建明. 33株尖孢鐮刀菌遺傳多樣性的ISSR分析. 生態(tài)學雜志, 2013, 32(5): 1195-1202.

ZHANG S Y, LI X F, WEI X Y, WANG J M. Genetic diversity of 33strains: an ISSR analysis., 2013, 32(5): 1195-1202. (in Chinese)

[2] LI X G, BOER W D, ZHANG Y N, DING C F, ZHANG T L, WANG X X. Suppression of soil-bornepathogens of peanut by intercropping with the medicinal herb., 2018, 116: 120-130.

[3] 伊海靜, 陳艷, 劉正坪, 王有年, 楊曉, 劉俊. 草莓枯萎病菌的分離鑒定及防治藥劑篩選. 西北農業(yè)學報, 2016, 25(4): 626-635.

YI H J, CHEN Y, LIU Z P, WANG Y N, YANG X, LIU J. Isolation and identification of strawberrywilt pathogen and fungicides screening., 2016, 25(4): 626-635. (in Chinese)

[4] ARUL DHAS D, HUBERT JOE I, ROY S D D, FREEDA T H. DFT computations and spectroscopic analysis of a pesticide: chlorothalonil., 2010, 77(1): 36-44.

[5] ZHANG H, NIE Y, ZHANG S Q, WANG W Z, LI H D, Wang F G, LV X, CHEN Z L. Monitoring and probabilistic risk assessment of chlorothalonil residues in vegetables from shandong province (china)., 2016, 80: 41-45.

[6] WANG J, CHOW W, CHANG J, WONG J W. Development and validation of a qualitative method for target screening of 448 pesticide residues in fruits and vegetables using UHPLC/ESI Q-orbitrap based on data-independent acquisition and compound database., 2017, 65(2): 473-493.

[7] 張國生, 汪燦明, 鄭瑞琴. 淺談農藥增效劑現狀及應用前景. 浙江化工, 2000, 31(4): 18-20.

ZHANG G S, WANG C M, ZHENG R Q. Brief discussion in current situation and application prospect of pesticide synergist., 2000, 31(4): 18-20. (in Chinese)

[8] 胡紹海, 胡衛(wèi)軍, 胡衛(wèi)東, 張志成, 周社文. 茶皂素在化學農藥乳油劑中增效作用研究. 中國農業(yè)科學, 1998, 31(2): 30-35.

HU S H, HU W J, HU W D, ZHANG Z C, ZHOU S W. Study on the synergism of tea saponin in the chemical insectcides EC., 1998, 31(2): 30-35. (in Chinese)

[9] 于宏偉, 段書德, 牛輝, 張東紅. 綠色農藥增效劑的研究進展. 江蘇農業(yè)科學, 2010(2): 142-143, 167.

YU H W, DUAN S D, NIU H, ZHANG D H. Progress in research on green pesticide synergist., 2010(2): 142-143, 167. (in Chinese)

[10] 葉長東. 一種包含黃腐酸的農藥增效組合物及其用途: CN 102626106 A [P]. (2012-08-08) [2018-07-10].

YE C D. Fulvic acid-containing pesticide synergistic composition and use thereof: CN 102626106 A [P]. (2012-08-08) [2018-07-10]. (in Chinese)

[11] RADHIKA S, SAHAYARAJ K, SENTHIL-NATHAN S, Hunter W B. Individual and synergist activities of monocrotophos with neem based pesticide, vijayneem againstFab., 2018, 101: 54-68.

[12] 李善祥. 腐植酸類物質與農藥——研究應用與展望. 腐植酸, 2002(2): 17-25.

LI S X. Progress in research and application on interaction between humic substances and pesticides., 2002(2): 17-25. (in Chinese)

[13] 王天立, 趙永德, 趙穎, 邢黎. 黃腐酸對防治蔬菜病害的增效作用. 河南化工, 1995(4): 31-32.

WANG T L, ZHAO Y D, ZHAO Y, XING L. Synergistic effect of fulvic acid on vegetable disease prevention., 1995(4): 31-32. (in Chinese)

[14] 王任明, 張巖峰. 黃腐酸對農藥殺蟲脒的增效作用初探. 江西化工, 2001(1): 38-40.

WANG R M, ZHANG Y F. The positive effect of the yellow humic acid to the pesticide., 2001(1): 38-40. (in Chinese)

[15] 金平, 陶波, 張淑華. 腐殖酸對克露增效作用的生理機制初探. 東北農業(yè)大學學報, 2003, 34(1): 7-9.

JIN P, TAO B, ZHANG S H. The initial study on the biological mechanism of the humic acid to improve the effect of cours., 2003, 34(1): 7-9. (in Chinese)

[16] MANNECK T, BRAISSANT O, HAGGENMULLER Y, KEISER J. Isothermal microcalorimetry to study drugs against., 2011, 49(4): 1217-1225.

[17] TAFIN U F, ORASCH C, TRAMPUZ A. Activity of antifungal combinations againstspecies evaluated by isothermal microcalorimetry., 2013, 77: 31-36.

[18] WU M, SONG M Y, LIU M, JIANG C Y, LI Z P. Fungicidal activities of soil humic/fulvic acids as related to their chemical structures in greenhouse vegetable fields with cultivation chronosequence., 2016, 6: 32858.

[19] WEI S P, WU M, LI G L, LIU M, JIANG C Y, Li Z P. Fungistatic activity of multiorigin humic acids in relation to their chemical structure., 2018, 66(28): 7514-7521.

[20] 何篤貴, 李強國, 楊德俊, 李旭, 葉麗娟, 魏得良, 黃熠, 張輝, 劉義. RE (C7H5O3)2(C9H6NO)配合物抗真菌作用的熱動力學研究. 中國稀土學報, 2007, 25(1): 107-110.

HE D G, LI Q G, YANG D J, LI X, YE L J, WEI D L, HUANG Y, ZHANG H, LIU Y. Thermokinetics study of antifungal functions of complexes of rare earths with salicylic acid and 8-hydroxyquinoline., 2007, 25(1): 107-110. (in Chinese)

[21] BARROS N, GOMEZ-ORELLANA I, FEIJOO S, BALSA R. The effect of soil moisture on soil microbial activity studied by microcalorimetry., 1995, 249: 161-168.

[22] 馮有智, 林先貴. 微量熱法在土壤微生物研究中的應用進展. 土壤, 2012, 44(4): 535-540.

FENG Y Z, LIN X G. Advances in the application of microcalorimetry in soil microbiology research., 2012, 44(4): 535-540. (in Chinese)

[23] JING Z W, CHEN R R, WEI S P, FENG Y Z, ZHANG J W, LIN X G. Response and feedback of C mineralization to P availability driven by soil microorganisms., 2017, 105: 111-120.

[24] DOSKOCIL L, GRASSET L, VALKOVA D, PEKAR M. Hydrogen peroxide oxidation of humic acids and lignite., 2014, 134: 406-413.

[25] FAN H M, WANG X W, SUN X, LI Y Y, SUN X Z, ZHENG C S. Effects of humic acid derived from sediments on growth, photosynthesisand chloroplast ultrastructure in chrysanthemum., 2014, 177: 118-123.

[26] TANG Y, YANG Y, CHENG D, GAO B, WAN Y, LI Y C. Value-added humic acid derived from lignite using novel solid-phase activation process with Pd/CeO2nanocatalyst: a physiochemical study., 2017, 5(11): 10099-10110.

[27] ABDEL-MONAIM M F, ISMAIL M E, Morsy K M. Induction of systemic resistance of benzothiadiazole and humic acid in soybean plants againstwilt disease., 2011, 39(4): 290-298.

[28] 楊謙. 植物病原菌抗藥性分子生物學. 2版. 北京: 科學出版社, 2011.

YANG Q.. Beijing: Science Press, 2011. (in Chinese)

[29] 付國良, 黃曉紅. 甘油醛-3-磷酸脫氫酶功能的研究進展. 生物物理學報, 2013, 29(3): 181-191.

FU G L, HUANG X H. Progress on research of functions of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase., 2013, 29(3): 181-191. (in Chinese)

[30] BRAISSANT O, KEISER J, MEISTER I, BACHMANN A, WIRZ D, GOPFERT B, BONKAT G, WADSO I. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay., 2015, 10(3): 460-468.

[31] 姜蘭蘭, 劉燕, 鄭世學. 等溫微量熱技術在土壤微生物學研究中的應用. 應用與環(huán)境生物學報, 2016, 22(4): 732-738.

JIANG L L, LIU Y, ZHENG S X. Applications of isothermal microcalorimetry in study on soil microbial activity., 2016, 22(4): 732-738. (in Chinese)

Slow-release synergistic effect of humic acidon low concentration chlorothalonil

WEI ShiPing1, 2, WU Meng1, LI GuiLong1, JIANG ChunYu1, LIU Ming1, 2, CHEN RuiRui1,2, LI ZhongPei1,2

(1State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008;2University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049)

【Objective】The objective of this study is to clarify the slow-release synergistic effect of humic acid on low concentration (5 mg·L-1) of chlorothalonil, provide a new scientific idea for reducing pesticide use and prolonging pesticide efficacy, and to provide a theoretical basis for selecting new fungicide synergists. 【Method】was culturedsolid and liquid medium including low concentrations of chlorothalonil with or without 50 mg·L-1humic acid addition. The inhibition rate (IR) and spore number were determined through mycelium growth test and blood counting chamber. The heat released during the growth and metabolism process ofwas measured by isothermal microcalorimetry technology. 【Result】The IR of humic acid-chlorothalonil combined treatment significantly increased by 10.29% (＜0.05) when IR of control was set to 0. The relative synergism was 25.33%. During liquid shake culture, there was no significant difference in spore number between the chlorothalonil treatment and humic acid-chlorothalonil combined treatment on the 3rd cultured day. On the 7th cultured day, the spore number of chlorothalonil treatment was significantly lower than that of other treatments (＜0.01). On the 14th cultured day, the spore number of humic acid-chlorothalonil combined treatment was significantly lower than other treatments (＜0.05), while there was no significant difference in spore number between chlorothalonil treatment and control. It showed that humic acid extended the inhibitory effect of low concentration chlorothalonil on the increase of spore number. The heat flow-time curve of each treatment showed that no heat release peak was detected in the humic acid-chlorothalonil combined treatment within 72 hours of monitoring, while that in the chlorothalonil treatment was found in later monitoring, and the heat flow-time curve of humic acid treatment was close to the control. Pmax(peak power) of the chlorothalonil treatment was significantly lower than that of the control and humic acid treatment (＜0.05), while the Tmax(peak power time) was significantly higher than that of the control and humic acid treatment (＜0.05). Pmax, Q (total heat evolution), and k (microbial growth rate constant) of the humic acid-chlorothalonil combined treatment were all significantly lower than other treatments (＜0.05), which indicated that the pathogen metabolic activity of the combinated treatment was significantly lower than that in other treatments. That is, the growth and metabolism ofwere most inhibited. There was no significant difference in Pmax, Tmax, Q, and k between the humic acid treatment and control, that is, the inhibition effect of humic acid treatment on pathogen was not monitored, and which could verify that the inhibition effect of combined treatment was irrelevant to humic acid itself.【Conclusion】The addition of humic acid can significantly enhance the ability of low concentration chlorothalonil to inhibit the growth of mycelia, increase of spore number and heat emission during growth and metabolism process of. Using humic acid as a fungicide synergist of chlorothalonil is an effective measure to reduce the amount of chlorothalonil and extend the efficacy.

humic acid; chlorothalonil; isothermal microcalorimetry; slow-release synergistic effect

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.007

2018-07-10；

2018-08-17

國家自然科學基金（41430859）、江蘇省自然科學基金面上項目（BK20181510）、南京土壤研究所“一三五”計劃和領域前沿項目（ISSASIP1642）

魏世平，Tel：025-86881313；E-mail：spwei@issas.ac.cn。吳萌，E-mail：mwu@issas.ac.cn。魏世平和吳萌為同等貢獻作者。通信作者李忠佩，Tel：025-86881505；E-mail：zhpli@issas.ac.cn

（責任編輯 岳梅）