朱頂紅愈傷組織誘導(dǎo)及增殖發(fā)育體系的建立及優(yōu)化

張 慧，羅珍珍，解曉旭，孫印兵，于文勝

（煙臺(tái)市園林管理處，山東 煙臺(tái) 264000）

朱頂紅（Hippeastrum hybridum），石蒜科多年生球根花卉，又名君子紅、孤挺花、朱頂蘭等。朱頂紅原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，性喜溫暖濕潤(rùn)、陽(yáng)光不過(guò)于強(qiáng)烈的環(huán)境，稍耐寒；生長(zhǎng)期需給予充分的水肥，夏季宜涼爽，冬季休眠期要求冷涼干燥；要求富含腐殖質(zhì)、疏松肥沃而排水良好的砂質(zhì)壤土［1-3］。朱頂紅花大色艷，葉型優(yōu)美，色澤鮮綠，一般用于盆栽觀賞，也可以用作切花，部分品種還可以應(yīng)用到園林中是，是一種優(yōu)良的觀賞花卉，具有廣闊的市場(chǎng)潛力［4］。

朱頂紅常用的繁殖方法主要有自然分球、扦插和播種等，但是繁殖速度慢，很難滿足市場(chǎng)的需求［5］。采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行離體快繁，具有繁殖系數(shù)高、成苗時(shí)間短和便于商品化和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)［6］。本試驗(yàn)在充分吸取前人研究經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以朱頂紅的試管小苗為外植體，詳細(xì)研究了不同激素種類及濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以及不同激素濃度對(duì)不定芽分化及植株再生的影響，旨在系統(tǒng)地探索適合朱頂紅的組織培養(yǎng)方法并構(gòu)建高效的離體快繁體系，縮短生長(zhǎng)周期，為朱頂紅的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料取自煙臺(tái)園林科研所溫室，采用從國(guó)外引進(jìn)的重瓣大花朱頂紅‘仙女’（‘fairy’）品種，采其未綻放的花蕊，主要挑選花托、花梗部位作為外植體，進(jìn)行初代愈傷組織誘導(dǎo)及增殖及不定芽分化研究。經(jīng)過(guò)前期的離體培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室已成功獲取一定數(shù)量生出小鱗莖的試管苗。在此研究的基礎(chǔ)上，采用無(wú)菌試管小苗為外植體進(jìn)一步優(yōu)化其愈傷組織誘導(dǎo)及增殖分化體系。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂粉5.8 g/L，蔗糖30g/L，肌醇、酪蛋白各100mg/L，pH值為5.8，121℃/20min高壓滅菌。培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為25±1℃，相對(duì)濕度一般保持在70%～75%。

1.2.1 外植體的處理及初培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)

選取生長(zhǎng)健壯，無(wú)病蟲(chóng)害的母株，采集未開(kāi)放的花蕾，注意多留存部分幼嫩花梗，剪去上半部分的苞片，將花梗連同花序部分分離出來(lái)，放入燒杯中，杯口罩紗布，先在流水下沖洗1h，然后在超凈工作臺(tái)上，把材料放入10%的NaClO溶液中消毒7min，用無(wú)菌水沖洗3次，再用 0.1%HgCl2處理5min，然后用無(wú)菌水沖洗3次。用經(jīng)過(guò)滅菌的接種刀將花蕾剝開(kāi)，連帶花托進(jìn)行橫向切割，將花序分開(kāi)，切割成長(zhǎng)0.5～1cm，厚度大約2～3mm的薄片，將其接入預(yù)實(shí)驗(yàn)的初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基。大概經(jīng)過(guò)1年左右的培養(yǎng)及篩選，獲取到直徑1cm左右的小鱗莖，本實(shí)驗(yàn)以帶有小鱗莖的無(wú)菌試管苗為外植體，將小鱗莖上端的葉片切下，然后對(duì)小鱗莖進(jìn)行縱向切割，切成1mm左右薄片，接入表1所列的培養(yǎng)基，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種12瓶，每瓶4塊，設(shè)3次重復(fù)。暗培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率及出芽率。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的正交設(shè)計(jì)

1.2.2 愈傷組織的增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)得到的愈傷組織，挑選白色半透明部分，分割為直徑8～10mm的小塊，分別設(shè)置2,4-D濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0mg/L，KT 濃度 0.5mg/L，6-BA 濃度1.0mg/L，每瓶接種6塊，遮光暗培養(yǎng)30d，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)及出芽率。

增殖倍數(shù)=新增愈傷組織的質(zhì)量/接種時(shí)愈傷組織的質(zhì)量

出芽率=出芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)

1.2.3 不定芽的分化及植株再生

將培養(yǎng)得到的愈傷組織，分割為直徑1cm左右的小塊，接種在以下培養(yǎng)基上：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入 6-BA，濃度分別設(shè)置為 0（ck），0.5，1.0，2.0mg/L，每瓶接種4塊，光照培養(yǎng)50天，采用的光照強(qiáng)度為2000-3000Lx，光照周期為每天16h。統(tǒng)計(jì)出芽率，將出芽的部分縱向分割成直徑1.5cm左右小塊，再次接種在同樣的培養(yǎng)基上，30天后，長(zhǎng)成叢狀小植株，統(tǒng)計(jì)大于1cm的芽數(shù)。

1.2.4 再生植株生根

選取高度均勻、生長(zhǎng)良好約2cm左右的植株，分割為單株，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行生根培養(yǎng)。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS進(jìn)行單因素或兩因素方差分析，并采用LSD、Duncan新復(fù)極差法等檢測(cè)各處理組間試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

本實(shí)驗(yàn)中，采用LSD法進(jìn)行多重比較，發(fā)現(xiàn)2,4-D的濃度變化對(duì)于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)呈現(xiàn)顯著性差異，6-BA與KT的濃度對(duì)于誘導(dǎo)效果的影響不顯著。由表2可見(jiàn)，在Y5培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高為60.42%，在Y1培養(yǎng)基中出芽率最高，為39.58%，從表中還可以看出，試驗(yàn)設(shè)置濃度區(qū)間內(nèi)對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)率都高于出芽率，說(shuō)明2,4-D在1.0～4.0mg/L濃度區(qū)間對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于對(duì)芽的誘導(dǎo)，所以合理控制好對(duì)于誘導(dǎo)發(fā)生顯著作用的激素,用量至關(guān)重要。

由表3可見(jiàn)，2,4-D濃度為2.0mg/L時(shí)，愈傷組織的平均誘導(dǎo)率最高為36.1%，而出芽率隨2,4-D濃度升高呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，綜合來(lái)看，Y5培養(yǎng)基中，愈傷組織的誘導(dǎo)率高，而叢芽的誘導(dǎo)效果處于中等，符合試驗(yàn)意圖，所以，誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳培養(yǎng)基為:1/2MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+KT2.0mg/L。

2.2 不同2,4-D濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響

由表4可見(jiàn)，2,4-D濃度在1.0mg/L時(shí)，愈傷組織的增殖倍數(shù)最大，與其他濃度存在顯著性差異，而在4.0mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)最低，可以看出2,4-D濃度在超過(guò)1.0mg/L后，增殖倍數(shù)隨著濃度的升高而降低。體胚發(fā)生率在2,4-D濃度為2.0mg/L時(shí)最大，與其他濃度存在顯著性差異。愈傷組織增殖的最佳狀態(tài)是不斷增殖出新的愈傷組織，所以胚狀體形成是此項(xiàng)試驗(yàn)的負(fù)指標(biāo)，所以，促進(jìn)愈傷組織增殖的最佳濃度是1.0mg/L。

表2 初代愈傷組織的誘導(dǎo)

表3 2,4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表4 2,4-D濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響

2.3 不同6-BA濃度對(duì)愈傷分化及出芽的影響

愈傷組織接入分化培養(yǎng)基開(kāi)始分化出芽，由表5可見(jiàn)，出芽率在不添加6-BA時(shí)（ck組）最低，6-BA濃度為0.5mg/L時(shí)最高，為93.75%，存在顯著性差異，之后出芽率隨6-BA濃度升高而降低，呈負(fù)相關(guān)，可以看出6-BA濃度超過(guò)一定范圍后對(duì)于出芽會(huì)產(chǎn)生抑制作用，所以此階段添加0.5mg/L6-BA可以較好的促進(jìn)芽的分化。

6-BA濃度對(duì)于大于1cm的芽數(shù)的影響存在顯著性差異，同樣是在0.5mg/L時(shí)，大于1cm的芽數(shù)最多，平均為7.83株，芽的高度及整體生長(zhǎng)狀態(tài)最好，在6-BA濃度為2.0mg/L時(shí)最低。綜上可知，6-BA濃度為0.5mg/L時(shí)最利于愈傷組織分化出芽。

表5 6-BA濃度對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)育的影響

2.4 植株的生根及移栽

單株苗轉(zhuǎn)接到無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基上，接種25d左右可獲得完整生根小植株，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)入溫室煉苗栽培環(huán)節(jié)，進(jìn)行下一步研究。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)以朱頂紅帶有小鱗莖的試管苗作為外植體，進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖分化研究，結(jié)果表明：誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳培養(yǎng)基為:MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+KT2.0mg/L，愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)到為60.42%；愈傷組織增殖需要的最佳2,4-D 2.0mg/L濃度為1.0mg/L，增殖倍數(shù)為6.5倍，促進(jìn)不定芽分化及植株再生的6-BA濃度為0.5mg/L，此濃度下出芽率可達(dá)到為93.75%，大于1cm的芽數(shù)平均為7.83株。

對(duì)于朱頂紅的離體快繁，近年來(lái)有很多研究，所采用的外植體包括很多部位，多數(shù)選用鱗莖［7-10］，也有用葉片基部、花葶、花梗、內(nèi)側(cè)鱗片和子房等部位［11］，本研究最初采用幼嫩花苞作為初培養(yǎng)材料，以離體快繁產(chǎn)生的小鱗莖作為外植體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，這樣大大減少了污染率，提高了試驗(yàn)材料的整齊度，也縮短了成苗時(shí)間，加快了生產(chǎn)周期，是近幾年的新嘗試［12］。另外，對(duì)于組培各個(gè)階段應(yīng)用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，大部分研究采用6-BA和NAA的組合進(jìn)行愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)［13-16］，本研究采用6-BA、2,4-D和KT的組合也產(chǎn)生了理想的誘導(dǎo)效果。不同研究因意圖不同采用了不同的激素種類、濃度，也采用了不同的發(fā)生方式，本研究主要針對(duì)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，選取常用的激素種類及快速的發(fā)生途徑，期待建立更加高效穩(wěn)定的離體快繁體系，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。