兒童牛奶過(guò)敏性特應(yīng)性皮炎全基因組DNA甲基化特點(diǎn)＊

謝蕓蕓 ，曾弘華 ，黃偉 ，劉冬梅 ，邱曉露 ，周順龍 ，李守明

(1.江西省兒童醫(yī)院兒童保健科，南昌 330006；2.江西省豐城市劍光醫(yī)院，豐城 331100；3.江西省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330006；4.江西省兒童醫(yī)院皮膚科，南昌 330006)

特應(yīng)性皮炎（Atopic Dermatitis，AD）病因復(fù)雜，與遺傳、環(huán)境因素、感染、皮膚屏障功能異常、Th1/Th2失衡及神經(jīng)免疫異常等多種因素有關(guān)[1]。實(shí)驗(yàn)和調(diào)查證實(shí)，至少35%-60%的特異性皮炎是由食物過(guò)敏引起的[2]，對(duì)于食物過(guò)敏導(dǎo)致AD的原因已經(jīng)有足夠證據(jù)表明與遺傳因素有關(guān)。研究也發(fā)現(xiàn)基因的多態(tài)性與AD密切相關(guān)，如FLG（Filaggrin gene）。由安徽醫(yī)科大學(xué)張學(xué)軍教授領(lǐng)銜的皮膚病遺傳學(xué)研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院、德國(guó)基爾大學(xué)等國(guó)內(nèi)外30多家單位攻關(guān)，采用全基因組關(guān)聯(lián)研究方法，對(duì)近2萬(wàn)例特應(yīng)性皮炎患者和健康對(duì)照者進(jìn)行易感基因研究，在人類基因組2個(gè)區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與該病發(fā)病密切相關(guān)的4個(gè)易感基因，即5號(hào)染色體區(qū)域的TMEM232和SLC25A46；20號(hào)染色體區(qū)域的 TNFRSF6B和ZGPAT；同時(shí)證實(shí)了既往在歐洲和亞洲人群中曾報(bào)道的易感基因FLG[3，4]。但單基因似乎不足以完美地解釋這類AD產(chǎn)生的深層次原因，另一方面近年發(fā)展的表觀遺傳學(xué)為我們提供了一個(gè)令人興奮的方向，表觀遺傳是一種不改變DNA序列的、可以遺傳的基因表達(dá)模式，表觀遺傳學(xué)的改變不僅在出生前或后就能發(fā)生，而且在以后的發(fā)展時(shí)期也能出現(xiàn)，在整個(gè)生命過(guò)程中，都影響基因表達(dá)，因此，表觀遺傳調(diào)控為早期暴露后病情發(fā)展的相關(guān)分子事件提供了一個(gè)機(jī)制的解釋[5]。DNA甲基化和染色體的修飾是兩種重要的表觀遺傳方式，我們檢測(cè)了兒童牛奶過(guò)敏性特應(yīng)性皮炎的全基因組DNA甲基化情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病例收集和分組 在病人知情同意下選擇患者及對(duì)照組（n=30），AD患者年齡均為＜1歲，按照文獻(xiàn)[6，7]方法進(jìn)行臨床試驗(yàn)病例的篩查。按臨床表現(xiàn)瘙癢、紅斑、浮腫、脫皮和結(jié)痂程度分為對(duì)照組（無(wú)癥狀，n=30），實(shí)驗(yàn)組 1（輕度癥狀，n=30），實(shí)驗(yàn)組 2（中度癥狀，n=30），實(shí)驗(yàn)組 3（重度癥狀，n=30）四個(gè)組，抽取靜脈血做免疫學(xué)檢查和甲基化檢測(cè)。

1.2 AD患兒與食物過(guò)敏關(guān)系的判斷 參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行熒光酶標(biāo)法來(lái)檢測(cè)病人血清中對(duì)食物特異性IgE水平，IgE水平0.35kUA/L以上為陽(yáng)性。

1.3 病例選擇和分類 參照文獻(xiàn)[9]方法對(duì)病例進(jìn)行選擇性分類：牛奶過(guò)敏病例：IgE水平＞15kUA/L或＜1歲兒童IgE水平超過(guò)5kUA/L入選本項(xiàng)研究對(duì)象。

1.4 方法 病例進(jìn)行分類后分組后檢測(cè)外周血的DNA甲基化程度：采用血液DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)提取全血DNA，按照說(shuō)明書進(jìn)行。采用整體甲基化定量試劑盒 (P-1014，美國(guó)Epigentek公司)，該試劑盒基于ELISA的原理，甲基化水平與吸光度(A)值的高低成正比。DNA甲基化的程度采用如下公式計(jì)算：相對(duì)甲基化水平=A(樣本-陰性對(duì)照)/2×A(陽(yáng)性對(duì)照-陰性對(duì)照)。 其中陰性對(duì)照含有50%的胞嘧啶，陽(yáng)性對(duì)照含有50%的5-甲基胞嘧啶。

RT-PCR檢測(cè)DNMT 1表達(dá)：利用淋巴細(xì)胞分離液從全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，Trizol(日本 Takara公司)一步法提取PBMC總RNA，定量后取1 xg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(D6110A試劑盒，日本Takara公司)。DNMT l及GAPDH由上海生物工程有限公司合成。引物序列及反應(yīng)條件見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)依據(jù)北京百泰克生物技術(shù)有限公司2 X Power Taq PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 PCR引物及序列

2 結(jié)果

2.1 牛奶過(guò)敏兒童外周血全基因組DNA甲基化程度 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 牛奶食物過(guò)敏兒童全血基因組DNA甲基化水平

上圖可見(jiàn)，牛奶過(guò)敏兒童隨著癥狀加重全血基因組DNA甲基化水平逐漸下降，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組3（重癥組）與正常對(duì)照組比較有極顯著差異 （P＜0.01）。

2.2 牛奶過(guò)敏兒童PBMC中DNMT 1表達(dá)變化DNMT 1是甲基化轉(zhuǎn)移酶，牛奶過(guò)敏兒童PBMC中DNMT 1表達(dá)變化見(jiàn)下圖2所示。上述結(jié)果可見(jiàn)，特應(yīng)性皮炎兒童隨癥狀程度的增加，DNMT1表達(dá)下降。

3 討論

圖2 牛奶過(guò)敏兒童PBMC中DNMT 1表達(dá)的變化

特應(yīng)性皮炎是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病[12]，15%-30%的兒童，2%-10%的成人受到影響，主要癥狀有劇烈的瘙癢、濕疹樣皮損、干皮癥等。AD影響12-15%的兒童，對(duì)兒童的影響包括使兒童睡不著(restless)/感到沮喪(frustrated)、影響兒童的社會(huì)化技能（social skills），導(dǎo)致與其他人交流退縮或缺乏，并帶來(lái)潛在的心理問(wèn)題，而且影響患病兒童和家長(zhǎng)的關(guān)系。另外，AD患兒家長(zhǎng)更感到苦惱、疲憊以及承受更大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，解決這部分患者病痛顯得日益緊迫。

環(huán)境或其他多種因素會(huì)影響本病的發(fā)生，目前食物過(guò)敏成為本病高發(fā)原因[10，11]，而近年發(fā)現(xiàn)表觀遺傳是食物過(guò)敏的產(chǎn)生機(jī)制之一[13，14]。在牛奶過(guò)敏（CMA）期間，Th1和Th2細(xì)胞因子基因的DNA甲基化發(fā)生改變[15]。關(guān)于過(guò)敏相關(guān)表型的表觀遺傳學(xué)研究也在日益增多，主要集中在DNA甲基化上[16]。綜上所述，表觀遺傳學(xué)既是食物過(guò)敏的重要知識(shí)缺口，又是食物過(guò)敏研究中有前途的研究領(lǐng)域。由于食物過(guò)敏的早期發(fā)病，前瞻性的表觀遺傳學(xué)研究有可能更好地理解食物過(guò)敏在關(guān)鍵發(fā)育窗口（先孕、子宮和兒童早期）期間的基因-環(huán)境相互作用和潛在的生物學(xué)機(jī)制，并可能導(dǎo)致食物過(guò)敏診斷、預(yù)防和管理方面的新范例，并為食物過(guò)敏的未來(lái)藥物發(fā)現(xiàn)和治療提供新的靶點(diǎn)。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏程度與全血中DNA甲基化水平下降呈一致性，過(guò)敏兒童PBMC中DNMT1的表達(dá)顯著降低可能是導(dǎo)致血液中全基因組DNA甲基化水平下降的原因。在今后工作中有必要進(jìn)一步關(guān)注患兒血液DNA甲基化的水平，以指導(dǎo)臨床診治。