漂白粉對(duì)近親真寬水蚤不同發(fā)育階段的毒性試驗(yàn)

馬 靜，曹婷婷，吳 桃

（1.內(nèi)蒙古阿拉善盟水產(chǎn)技術(shù)推廣站，內(nèi)蒙古 阿拉善左旗 750306；2.江蘇省連云港市海州區(qū)漁業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇 連云港 222000；3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市水產(chǎn)管理站，內(nèi)蒙古 康巴什區(qū) 017000）

近親真寬水蚤是浮游甲殼動(dòng)物的一個(gè)重要類群，分布廣泛，生長(zhǎng)迅速，在水產(chǎn)養(yǎng)殖的水體環(huán)境中是許多魚類和水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的天然餌料。但因養(yǎng)殖水體中近親真寬水蚤有時(shí)會(huì)侵襲魚卵或魚苗、蟹苗，故其又是魚類和經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物苗期的敵害，在養(yǎng)魚池和輪蟲(chóng)培養(yǎng)池中，人們常使用有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑（敵百蟲(chóng)）來(lái)防治其危害。在甲殼動(dòng)物苗種生產(chǎn)中，特別是河蟹育苗過(guò)程中則大多使用漂白粉來(lái)殺除近親真寬水蚤，其濃度（有效氯）從1 mg/L到10 mg/L不等，殺除效果又依照近親真寬水蚤各發(fā)育階段和水肥度條件及溫度不同而有所差別，筆者在實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，對(duì)漂白粉殺除不同發(fā)育階段的近親真寬水蚤的效果進(jìn)行了深入的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)生物：試驗(yàn)生物為成體、橈足幼體、卵和無(wú)節(jié)幼體4個(gè)不同發(fā)育階段的近親真寬水蚤。近親真寬水蚤成體、橈足幼體均取自養(yǎng)殖生產(chǎn)的池塘；卵由成體死亡后脫落而得；為保持生理的一致性，無(wú)節(jié)幼體取自卵萌發(fā)出的子一代 （24 h以內(nèi)）。

1.1.2 試驗(yàn)用水：經(jīng)300目篩絹網(wǎng)過(guò)濾的池塘水。

1.1.3 肥水：取自經(jīng)人工培養(yǎng)的小球藻大量繁殖后的池塘水，生物量為0.395 mg/mL，化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）為 42.8 mg/L，溶氧在 7.85～13.13 mg/L，pH 值在 9.58～9.98，平均室溫25℃。

1.1.4 瘦水：取自未進(jìn)行人工培養(yǎng)小球藻的池塘水，生物量為0.003 mg/mL，COD為5.46 mg/L，溶氧在 6.75～8.01 mg/L，pH 值在 8.42～8.66， 平均室溫25℃。

1.1.5 主要儀器和藥品：主要儀器有1 000 mL燒杯若干、17 mL青霉素小瓶若干、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、浮游生物計(jì)數(shù)框、電爐、量筒、坩堝、堿式滴定管、容量瓶、碘量瓶、pH計(jì)、YST MODEL-58溶氧儀、SXP-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱、微量可調(diào)移液槍等。此外，還有漂白粉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、高錳酸鉀等主要藥品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備：用0.1 mL的微吸管在坩堝中挑選近親真寬水蚤的成體、橈足幼體、無(wú)節(jié)幼體、卵。其中，成體選擇帶有卵袋、附肢齊全、活動(dòng)正常的個(gè)體；橈足幼體與無(wú)節(jié)幼體取附肢齊全、活動(dòng)正常的個(gè)體即可，無(wú)節(jié)幼體是在生物顯微鏡下用0.1 mL的微吸管準(zhǔn)確挑選10個(gè)由卵萌發(fā)出不到24 h的子一代個(gè)體；卵來(lái)自于帶有卵袋、附肢齊全、活動(dòng)正常的成體近親真寬水蚤。每一個(gè)平行組取10只個(gè)體（成體、橈足幼體、無(wú)節(jié)幼體、卵）放入17 mL青霉素小瓶中，并加入10 mL的試驗(yàn)用水，將挑選好的樣本放入SXP-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱備用，溫度設(shè)置在5℃和25℃，光照1 000～2 000 lx。

1.2.2 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)按等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)梯度[1-2]設(shè)置漂白粉有效氯濃度梯度 （該文所述濃度均為漂白粉有效氯濃度），具體情況見(jiàn)表1。將一定量的漂白粉溶于蒸餾水后取上清液，分別加入盛有試驗(yàn)生物及卵的小瓶中進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每個(gè)樣品間加漂白粉的時(shí)間不能超過(guò)5 min，隨之再次放入SXP-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)置在5℃和25℃，光照1 000～2 000 lx，試驗(yàn)期間不投喂。

表1 正式試驗(yàn)漂白粉有效氯濃度梯度設(shè)置mg/L

試驗(yàn)在5℃和25℃時(shí)分別設(shè)肥水和瘦水2個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)設(shè)1個(gè)對(duì)照組（只放試驗(yàn)生物不放漂白粉），每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)平行，經(jīng)8、24、48 h后計(jì)算出近親真寬水蚤成體、橈足幼體、無(wú)節(jié)幼體在不同溫度及水肥度下漂白粉的死亡率和半致死濃度。

為了確定活體和死體帶的卵是否有萌發(fā)的能力，用殺死成體的最高濃度（有效氯10.000 mg/L）漂白粉的試驗(yàn)組作為參照，來(lái)探究卵是加藥后被殺死的，還是卵在死體身上就無(wú)法繼續(xù)萌發(fā)。每隔24 h觀察卵的萌發(fā)情況，48 h后用碘液固定3個(gè)平行樣，統(tǒng)計(jì)卵的萌發(fā)率。對(duì)未萌發(fā)的試驗(yàn)組，用過(guò)濾海水反復(fù)沖洗，轉(zhuǎn)置無(wú)漂白粉的培養(yǎng)液繼續(xù)觀察，觀察時(shí)間為48 h，檢驗(yàn)經(jīng)過(guò)漂白粉處理的卵是否還有萌發(fā)的潛力，并統(tǒng)計(jì)卵的萌發(fā)率。

1.2.3 測(cè)定方法：試驗(yàn)有效氯含量的測(cè)定采用碘量滴定法；pH值用pH計(jì)測(cè)定；溶氧含量用YSTMODEL-58溶氧儀測(cè)定；COD用堿式高錳酸鉀法測(cè)定；判定試驗(yàn)生物死亡依據(jù)李永涵等對(duì)橈足類急性毒性試驗(yàn)的方法[3]；根據(jù)濃度對(duì)數(shù)與概率單位之間的關(guān)系[4-5]，計(jì)算漂白粉的半致死濃度（ LC50）。

2 結(jié)果及分析

2.1 攻毒后成體的死亡情況

試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)表2），有效氯濃度為1.000mg/L時(shí)，成體死亡率超過(guò)50%（半數(shù)死亡）的情況出現(xiàn)在24 h后的5℃瘦水中、48 h后的5℃瘦水及25℃瘦水中，死亡率分別為83.3%、96.7%和73.3%。有效氯濃度為3.200 mg/L時(shí)，除8 h后25℃肥水中死亡率為20%未超過(guò)50%外，其余的死亡率均超過(guò)50%，其中8 h后5℃肥水的死亡率達(dá)100%。有效氯濃度為3.200 mg/L時(shí)，48 h后死亡率均達(dá)100%，該濃度可作為實(shí)踐中使用漂白粉滅殺近親真寬水蚤成體的一個(gè)依據(jù)。在有效氯濃度為1.000 mg/L和3.200 mg/L 2個(gè)濃度下，出現(xiàn)死亡率超過(guò)50%未達(dá)100%的各試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，相同溫度下瘦水中的死亡率高于肥水中的死亡率，相同水體中5℃時(shí) （較低溫度）的死亡率高于25℃時(shí)（較高溫度）。

表2 使用漂白粉攻毒后成體死亡情況

表3 使用漂白粉攻毒后橈足幼體死亡情況

表4 使用漂白粉攻毒后無(wú)節(jié)幼體死亡情況

2.2 攻毒后橈足幼體的死亡情況

由表3可以看出，橈足幼體在有效氯濃度為1.000 mg/L時(shí)，在24 h時(shí)死亡率超過(guò)50%的情況出現(xiàn)在5℃瘦水、25℃瘦水中，死亡率分別為63.3%和53.3%；48 h時(shí)死亡率超過(guò)50%的情況出現(xiàn)在 5℃瘦水中（83.3%）、25℃瘦水中（100%）、25℃肥水中（56.7%）。在有效氯濃度為3.200 mg/L時(shí)，各試驗(yàn)組死亡率為100%，可見(jiàn)橈足幼體對(duì)漂白粉耐受力相比成體較弱。而在有效氯濃度為1.000 mg/L濃度下，肥水中的死亡率在同一溫度下均低于瘦水的死亡率；但該濃度下在同一水體中不同溫度下死亡情況無(wú)明顯規(guī)律。

2.3 攻毒后無(wú)節(jié)幼體的死亡情況

由表4可以看出，有效氯濃度為0.100 mg/L時(shí)，在5℃的瘦水中的48 h死亡率達(dá)96.7%；有效氯濃度為0.320 mg/L時(shí)，5℃瘦水中在各時(shí)間點(diǎn)（8、24、48 h） 的死亡 率 分 別 為 93.3% 、93.3% 、100%。由此可以得出，在低溫（5℃）的瘦水中可用0.032 mg/L這個(gè)濃度滅殺無(wú)節(jié)幼體；高溫瘦水及肥水中可選用1.000 mg/L這個(gè)濃度滅殺無(wú)節(jié)幼體。無(wú)節(jié)幼體在1.000 mg/L時(shí)各試驗(yàn)組全部死亡，可見(jiàn)無(wú)節(jié)幼體對(duì)漂白粉的耐受力相比橈足幼體較弱。在0.320 mg/L濃度下各試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，相同溫度下瘦水中的死亡率高于肥水中的死亡率；相同水體中5℃時(shí)（較低溫度）的死亡率高于25℃時(shí)（較高溫度）。

表5 卵在使漂白粉攻毒48 h時(shí)的平均萌發(fā)率%

2.4 攻毒后卵的萌發(fā)情況

由表5可以看出，漂白粉濃度達(dá)18.000 mg/L時(shí)已嚴(yán)重影響了卵的萌發(fā)率 （瘦水中萌發(fā)率<0.1）；漂白粉濃度達(dá)32.000 mg/L時(shí)則各組卵均不能萌發(fā)，沖洗后在5℃肥水和25℃肥水中有一定的萌發(fā)率。從該結(jié)果來(lái)看，肥水中的萌發(fā)率高于瘦水中萌發(fā)率；同一水體相比，高溫水體中的萌發(fā)率高于低溫水體中的萌發(fā)率。

2.5 漂白粉對(duì)各發(fā)育階段的半致死濃度

由表6可以看出，在同一溫度、同一水體下近親真寬水蚤成體、橈足幼體、無(wú)節(jié)幼體的48 h LC50依次降低，8 h LC50與24 h LC50無(wú)明顯規(guī)律。

表6 漂白粉有效氯對(duì)近親真寬水蚤各發(fā)育階段的半致死濃度 mg/L

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，近親真寬水蚤各發(fā)育階段在肥水中對(duì)漂白粉的耐受力要高于瘦水中的耐受力，這是因?yàn)樗识葘?duì)有效氯衰減有一定的影響，但并非水肥度越低其有效氯衰減速率就越快 （有效氯對(duì)生物的毒性就越大），而是有一個(gè)范圍[6-7]。漂白粉有效氯衰減速率還可能受溫度及其他因素的影響，這也就解釋了該文出現(xiàn)經(jīng)漂白粉攻毒后同一水體在不同溫度下死亡率及半致死濃度不同的現(xiàn)象。

如何有針對(duì)性地對(duì)近親真寬水蚤各個(gè)不同發(fā)育階段“對(duì)癥下藥”，歷來(lái)是生產(chǎn)中的一個(gè)難題。該文立足于此，給出了漂白粉對(duì)卵、成體、橈足幼體和無(wú)節(jié)幼體的滅殺濃度，分別為32.000、3.200、1.000～3.200 mg/L和1.000 mg/L，在生產(chǎn)實(shí)踐中可以該結(jié)論作為參考。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可判斷近親真寬水蚤的卵、成體、橈足幼體和無(wú)節(jié)幼體對(duì)漂白粉（有效氯）濃度耐受性是依次減弱的，其機(jī)理顯然與各發(fā)育階段固有的生命活力（抗藥性）有關(guān)，這與該文中成體、橈足幼體、無(wú)節(jié)幼體的48 h LC50在同一溫度、同一水體下依次降低結(jié)果同樣一致。而8 h LC50與24 h LC50無(wú)明顯規(guī)律，可能是因?yàn)槠追鬯p過(guò)程 （衰減時(shí)間）受到多重因素的影響所致，這也是大多“殺蟲(chóng)劑”為什么要采用48 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為藥效時(shí)間截點(diǎn)的原因。

有文獻(xiàn)表明，敵百蟲(chóng)對(duì)近親真寬水蚤成體和橈足幼體的致死時(shí)間相近，無(wú)節(jié)幼體耐藥力比成體要高出近5倍，這與該試驗(yàn)結(jié)果正好相反，可能與不同藥物的作用機(jī)理不同有關(guān)。而筆者認(rèn)為，生產(chǎn)中用漂白粉滅殺成蟲(chóng)后，觀察到池塘中成體已經(jīng)死亡，而仍有無(wú)節(jié)幼體的存活的現(xiàn)象，實(shí)際上則為卵重新萌發(fā)的結(jié)果。因?yàn)椋撛囼?yàn)得出卵在漂白粉有效氯為32 mg/L下作用48 h，經(jīng)沖洗后在肥水中有一定的萌發(fā)率。從氯對(duì)生物的毒性作用機(jī)理來(lái)看，漂白粉是通過(guò)氧化作用導(dǎo)致機(jī)體和卵的死亡，即細(xì)胞內(nèi)的重要活性物質(zhì)——酶類的含硫氫基被氯直接氧化[8-9]，對(duì)近親真寬水蚤的卵只有在合適的濃度下才能阻止其萌發(fā)。而敵百蟲(chóng)則是一種神經(jīng)阻斷劑類藥物，對(duì)于成體和幼體起作用，但作用于暫時(shí)無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)的卵，是不起殺滅作用的，并且近親真寬水蚤有著堅(jiān)韌的卵袋 和卵膜，都極大地提高了卵對(duì)藥物的耐受性。