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    桑黃原生質(zhì)體的制備與再生研究

    2019-01-08 01:44:00白靜瑩王立山范桂枝
    食用菌 2018年4期
    關(guān)鍵詞:桑黃原生質(zhì)丁香

    白靜瑩 王立山 張 媛 范桂枝

    (東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱150000)

    桑黃(Phellinus yucatanenisis)屬于擔(dān)子菌亞門、多孔菌目、多層孔菌科、針層孔菌屬[1],是一種珍貴而功效多樣的藥用真菌,有“森林黃金”之美稱。桑黃最早使用記錄是從漢朝開始的,至今已有2000多年的歷史,中醫(yī)用以治療血崩、血淋、帶下、脾虛泄瀉等[2-3]?,F(xiàn)代藥理研究表明,桑黃含有多糖、黃酮、三萜酸、脂肪酸類、芳香酸等成分[4],具有抗菌、抗癌、抗氧化、抗肝纖維化和增強(qiáng)免疫等藥用價值[5-6],是國際公認(rèn)的最佳抗癌真菌之一。因此,桑黃作為名貴的滋補(bǔ)藥材,市場對其需求驟升。

    野生桑黃人工栽培難度大、子實(shí)體生長周期長,一般3~4年,這限制了對桑黃的進(jìn)一步開發(fā)和利用。為了滿足日益增長的市場需求,選育性狀穩(wěn)定、子實(shí)體生長周期短和人工栽培難度小的桑黃菌種成為一項重要的工作。原生質(zhì)體技術(shù)是選育優(yōu)良菌種行之有效的手段,如原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體誘變和原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化等。其中,原生質(zhì)體的制備和再生是原生質(zhì)體技術(shù)的前提和基礎(chǔ)。祝子坪和馬海樂[7]、許謙[8]的研究分離了桑黃菌絲原生質(zhì)體并成功再生,但是上述研究均未報道桑黃菌種的寄生樹種。研究表明,桑黃孔菌屬(Sanghuangporus)常與其所生長的樹木之間存在種類專一性關(guān)系[9],目前知道世界上桑黃屬有12種[10-12],主要生長于楊、松、桑、白樺、暴馬丁香、杜鵑等樹的樹干上[13]。不同寄生樹種來源的桑黃菌絲中,藥用代謝物含量可能存在差異[14],其分離的原生質(zhì)體活力、產(chǎn)量和再生能力是否相同還未見報道。為此,筆者將比較分析來源于暴馬丁香、桑樹、松樹、樺樹、楊樹桑黃等五種桑黃菌絲的原生質(zhì)體活力和產(chǎn)量以及葡萄糖和pH對原生質(zhì)體再生的影響,為利用原生質(zhì)體技術(shù)選育優(yōu)良桑黃菌種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試菌株、試劑與培養(yǎng)基

    1.1.1 供試材料

    五種不同樹種的桑黃子實(shí)體分別為暴馬丁香桑黃(Sanghuangporus baumii)、桑樹桑黃(Sanghuangporus sanghuang)、松樹桑黃(Phellinus igniarius Linn)、樺樹桑黃(Phellinus igniarius)、楊樹桑黃(Sanghuangporus vaninii),均由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院森林生物工程學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供,該菌種已從形態(tài)和分子水平鑒定[15]。

    1.1.2 主要試劑

    崩潰酶(北京索萊寶科技有限公司),蝸牛酶(北京百泰生化技術(shù)公司),二乙酸熒光素(FDA)(上海瑞永生物科技有限公司),由本地市場購得葡萄糖、甘露醇等均為分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    液體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g沸水煮30 min,4層紗布過濾。取濾液,加入20 g葡萄糖,補(bǔ)水至1000 mL,pH自然。

    PDA培養(yǎng)基:PDB培養(yǎng)基再加10%瓊脂粉。

    原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨2 g,酵母粉4 g,溶于0.6 moL/L滲透壓穩(wěn)定劑中,體積為1000 mL,加入10%瓊脂粉,pH自然。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),超凈工作臺(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司),SHA-B水浴恒溫振蕩器(國旺儀器),TDZ5-WS臺式低速離心機(jī),OLYMPUS熒光顯微鏡,酒精燈,移液槍,鑷子,0.22μm細(xì)胞篩,0.22μm微孔濾膜,尼龍紗布(64μm)等。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 桑黃菌絲體的培養(yǎng)

    取PDA斜面上生長旺盛的菌絲,接種于PDB培養(yǎng)基中,28℃,130 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)15 d左右,直至菌絲長成約1 cm的球狀。

    1.3.2 原生質(zhì)體制備

    在超凈工作臺上,將五種桑黃菌絲用無菌水洗滌、去除表面水分后,每毫升酶解液加入300 mg菌絲,振蕩混勻,使酶液與菌絲體充分接觸。于35℃恒溫水浴鍋水浴,110 r/min振蕩酶解3 h。待酶解完成后,將五種桑黃菌酶解液用無菌雙層尼龍紗布(64μm)過濾,3800 r/min離心機(jī)離心10 min去上清液,將原生質(zhì)體用滲透壓穩(wěn)定劑稀釋成懸液備用。

    1.3.3 原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力統(tǒng)計

    (1)原生質(zhì)體活力測定(FDA染色法):用丙酮將FDA配置成5 mg/mL溶液,將FDA溶液與原生質(zhì)體懸液按比例1∶1混勻,分別在自然光與熒光顯微鏡下觀察五種桑黃的原生質(zhì)體。在熒光顯微鏡下,有活力的原生質(zhì)體發(fā)出綠色熒光,無活力的不發(fā)光。隨機(jī)選取3個視野,每個樣品重復(fù)3次,計算出在自然光下原生質(zhì)體數(shù)和熒光下有活力的原生質(zhì)體數(shù),得出活力比。

    原生質(zhì)體活力比(%)=熒光下原生質(zhì)體數(shù)(個)/自然光下原生質(zhì)體數(shù)(個)×100

    (2)原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定(血球計數(shù)板計數(shù)):吸取五種桑黃原生質(zhì)體懸液10μL于25×16血球計數(shù)板上,在顯微鏡下,分別在左上、右上、左下、右下、中間五個中方格,計數(shù)原生質(zhì)體數(shù)目。每個樣品重復(fù)3次。

    原生質(zhì)體產(chǎn)量的計算:

    原生質(zhì)體的產(chǎn)量/mL=(a/5)×25 ×104×b

    式中:a為5個中方格中原生質(zhì)體總數(shù);b為原生質(zhì)體懸液稀釋倍數(shù)。

    1.3.4 暴馬丁香桑黃的再生

    1.3.4.1 不同葡萄糖濃度對暴馬丁香桑黃再生率的影響

    取1000 mL馬鈴薯濾液,平均分為兩份,即對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組加入54.65 g甘露醇使其濃度為0.6 mol/L,然后試驗(yàn)組和對照組平均分成五份,分別加入一定量葡萄糖使其葡萄糖濃度分別為0.01 g/mL、0.02 g/mL、0.03 g/mL、0.04 g/mL、0.05 g/mL,pH自然,每份加1 g瓊脂,溶解后121℃、滅菌20 min。每個樣品重復(fù)3次。

    1.3.4.2 不同pH對暴馬丁香桑黃再生率的影響

    取1000 mL馬鈴薯濾液,加入葡萄糖20 g,平均分為兩份,即對照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組加入54.65 g甘露醇使其濃度為0.6 moL/L,然后試驗(yàn)組和對照組平均分成五份,調(diào)節(jié)pH為一定值。每份加1 g瓊脂,溶解后121℃、滅菌20 min。桑黃菌絲生長最適pH為 7.5,所以設(shè)定pH 五個梯度為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。每個樣品重復(fù)3次。

    1.3.5 釋放與再生的觀察

    (1)桑黃原生質(zhì)體的釋放:在酶解過程中,每隔1 h取樣制片,在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況。(2)桑黃再生:在無菌操作臺將桑黃精制后的懸液濃度調(diào)整為1×105個/mL,吸取100μL懸液涂到基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,27.5℃避光條件下培養(yǎng),隨時取樣制片,觀察桑黃原生質(zhì)體再生過程。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 原生質(zhì)體的形態(tài)觀察

    菌絲在酶解的過程中細(xì)胞壁被分解去除,形成的原生質(zhì)體沒有了堅硬的細(xì)胞壁束縛,形態(tài)就會變?yōu)榍蛐位蛘呓蛐?。暴馬丁香、桑樹、松樹、樺樹、楊樹桑黃菌絲分別經(jīng)酶解液精制后得到的原生質(zhì)體形態(tài)如圖1所示。五種桑黃菌絲的原生質(zhì)體形態(tài)變?yōu)榍蛐位蚪蛐?,但楊樹桑黃原生質(zhì)體形態(tài)與其他四種相比較不規(guī)則,可能是由于沒有了細(xì)胞壁的阻隔,原生質(zhì)體可能會發(fā)生自然聚集或融合。進(jìn)一步從熒光顯微鏡圖片可以看出桑樹和樺樹桑黃釋放的原生質(zhì)體相似,均為細(xì)胞膜附近熒光較強(qiáng),而暴馬丁香、松樹和楊樹桑黃釋放的原生質(zhì)體相似,原生質(zhì)體表面均有熒光分布。

    2.2 原生質(zhì)體的活力分析

    暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹、楊樹桑黃的原生質(zhì)體活力比分別為81.82%、76.67%、76.47%、71.58%、71.11%(圖2)。其中,暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體的活力最高,楊樹桑黃原生質(zhì)體的活力最低,楊樹桑黃比暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體的活力降低了10%。

    2.3 原生質(zhì)體的產(chǎn)量分析

    暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹和楊樹桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量分別為 3.85×105個/mL、3.14×105個/mL、2.85×105個/mL、3.57×105個/mL 和 2.42×105個/mL(圖3)。其中,暴馬丁香桑黃的產(chǎn)量最高,楊樹桑黃原生質(zhì)體的產(chǎn)量最低,楊樹桑黃比暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體產(chǎn)量降低了1.43×105個/mL。

    圖1 不同樹種桑黃原生質(zhì)體鏡檢圖(10×60)

    圖2 桑黃原生質(zhì)體活力比

    圖3 桑黃原生質(zhì)體產(chǎn)量

    圖4 不同pH對原生質(zhì)體再生的影響

    圖5 不同葡萄糖濃度對原生質(zhì)體再生的影響

    2.4 pH和葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質(zhì)體再生率的影響

    由上述圖2和圖3可知,暴馬丁香桑黃菌絲原生質(zhì)體的活力比和產(chǎn)量最高,為此采用其分析pH和葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質(zhì)體再生率的影響。pH 6.5~8.5,試驗(yàn)組和對照組桑黃菌絲原生質(zhì)體的再生率呈先上升后下降趨勢,其中試驗(yàn)組在pH7時再生率達(dá)最高值23.67%,對照組在pH7.5時再生率達(dá)最高值23.34%(圖4)。

    葡萄糖濃度對桑黃菌絲原生質(zhì)體再生率的影響如圖5所示。葡萄糖濃度在10~50 mg/mL,試驗(yàn)組呈先升高后降低趨勢,葡萄糖濃度在30 mg/mL時,原生質(zhì)體再生率最高值19.33%,而對照組葡萄糖濃度在50 mg/mL時,原生質(zhì)體的再生率最高為14.66%,其他葡萄糖濃度下再生率均在12%左右。

    2.5 原生質(zhì)體釋放與再生過程

    桑黃菌絲酶解1~3 h,隨著酶解時間的增加,桑黃菌絲的細(xì)胞壁首先被降解,原生質(zhì)體從側(cè)端釋放(圖6a),在酶解中期(圖6b、c),大部分菌絲被酶解為片段。該酶解過程與文獻(xiàn)報道一致,即大量菌絲由側(cè)端與頂端位膨脹,釋放更多原生質(zhì)體[16],被釋放后的原生質(zhì)體在滲透壓穩(wěn)定劑作用下,呈現(xiàn)橢圓形或不規(guī)則形狀(圖6d)。

    圖6 原生質(zhì)體釋放與再生過程鏡檢圖(10×60)

    桑黃原生質(zhì)體再生過程中,桑黃原生質(zhì)體首先萌發(fā)變成短狀棒粗菌絲(圖6e),短狀棒菌絲聚合進(jìn)而再轉(zhuǎn)化為菌絲體(圖6f),菌絲體通過大量繁殖聚集變成桑黃菌株(圖6g、6h)。

    3 小結(jié)

    試驗(yàn)以暴馬丁香、樺樹、松樹、桑樹、楊樹桑黃等五種桑黃為原料,進(jìn)行了桑黃原生質(zhì)體活力與產(chǎn)量的測定。選用暴馬丁香桑黃為材料,研究pH 6.5~8.5和葡萄糖濃度10~50 mg/mL對原生質(zhì)體再生的影響,并對暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體釋放與再生過程進(jìn)行顯微攝影觀察。結(jié)果表明:試驗(yàn)所測定的五種桑黃中,暴馬丁香桑黃原生質(zhì)體活力與產(chǎn)量最高,分別為81.82%和3.85×105個/mL。在pH 7時,暴馬丁香桑黃再生率最高為23.67%,葡萄糖濃度為30 mg/mL時,暴馬丁香桑黃的再生率最高為19.33%。初步摸索了桑黃菌株采用酶解法獲得的原生質(zhì)體進(jìn)行釋放與再生歷程,為以后該菌種誘變體系的建立奠定基礎(chǔ)。

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