一株高產(chǎn)漆酶野生金針菇菌株的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

駱 燕

（山西安弘檢測技術(shù)有限公司，山西太原030000）

金針菇（Flammulina velutipes）是中國最早栽培的食用菌之一，具有種類繁多的特點，中國如今已成為世界上金針菇產(chǎn)量和出口量最多的國家[1-2]。

漆酶早在1883年發(fā)現(xiàn)于日本的漆樹中，它在木質(zhì)素降解過程中起著重要的作用，屬于多銅氧化酶家族，能在氧氣作為電子受體的條件下氧化酚類或芳胺類化合物[4]。此外，經(jīng)過長期的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶廣泛存在于細菌、真菌、植物、昆蟲中[5-6]。對其性質(zhì)和作用進行研究后發(fā)現(xiàn)，漆酶在食品工業(yè)、造紙業(yè)、環(huán)境保護過程中都起著重要的作用，從而促進了漆酶的進一步研究。

漆酶作為環(huán)境污染物的最佳處理酶種之一，在木質(zhì)素的降解過程中起著非常重要的作用。國內(nèi)外有關(guān)漆酶產(chǎn)生菌的報道也越來越多，高等真菌漆酶是由擔(dān)子菌的白腐菌分泌。白腐菌包括煙管菌、白囊耙齒菌、射脈菌、糙皮側(cè)耳、靈芝、朱紅密孔菌、云芝菌，其漆酶都具有很強烈的染料脫色能力[7]。因此，筆者對山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供的一株高產(chǎn)漆酶菌株F0027進行鑒定，并對子實體培養(yǎng)料菌渣中的漆酶酶學(xué)性質(zhì)及染料脫色能力進行初步研究，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌株F0027，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。

1.2 試劑

DNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；ABTS[2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽]購自Sigma公司；其他生化試劑或化學(xué)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g∕L，葡萄糖 20 g∕L，KH2PO40.3 g∕L，MgSO4·7H2O 0.15 g∕L，瓊脂 18 g∕L，pH自然。

培養(yǎng)料：棉籽殼80%，麩皮15%，玉米粉3%，糖1%，石膏粉1%。

1.4 產(chǎn)漆酶菌株的鑒定

1.4.1 菌株分離

將分離活化F0027菌株接種于滅菌后的培養(yǎng)料中，23℃培養(yǎng)30 d，菌絲即可長滿瓶。隨后，將菌絲體生長的溫度控制在23℃，出菇階段將溫度控制在15℃，待出菇結(jié)束后留培養(yǎng)料備用。

1.4.2 形態(tài)學(xué)鑒定

參照《真菌鑒定手冊》（魏景超1979）和《微生物分類學(xué)》（張紀(jì)中1990）對黃色金針菇的形態(tài)學(xué)進行初步鑒定。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

產(chǎn)漆酶菌株基因組DNA的提取運用了CTAB法[8]。ITS基因的PCR擴增：擴增時采用真菌通用引物對 ITS1∕ITS4。具體序列為 ITS1：TCCGTAGGTAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 17.7 μL，10×buffer 2 μL，引物各 1 μL，模板 DNA1 μL，Taq 酶 0.3 μL，dNTP 2 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性3 min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。將擴增條帶膠回收后，送交上海生工公司測序。測序后所得序列提交GenBank中進行BLAST比對[9]。

1.4.4 漆酶活性的測定

培養(yǎng)料殘渣中加入適量蒸餾水放入研缽中研磨成勻漿，在1359×g的條件下離心15 min，收集上清液測定酶活性，每個樣品重復(fù)3次。采用ABTS法[10-13]對漆酶的酶活性進行測定，將等體積的酶液與10 mmol∕L的含有ABTS的醋酸鈉緩沖溶液混合。將5 μL漆酶樣品加入195 μL底物ABTS溶液（pH 4.6）中混合均勻，置于25℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，加入300 μL 5%的TCA（三氯乙酸）溶液終止反應(yīng)，測定420 nm處的吸光度。對照組用5 μL去離子水代替5 μL漆酶樣品，其余的條件相同。酶活力單位定義為：在420 nm處，每分鐘每毫升反應(yīng)體系產(chǎn)生一個吸光值所需要的酶量為一個酶活力單位。所有的試驗均重復(fù)3次。

1.5 產(chǎn)酶特性試驗

取F0027出菇結(jié)束后培養(yǎng)料殘渣于研缽中，加入適量蒸餾水，用力研磨后移入離心管中，于4℃、1359×g的條件下離心15 min，最后收集上層清液，測定漆酶、蛋白酶、核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶的活性。以ABTS為底物測定漆酶的活性[14]；以Casein為底物測定蛋白酶的活性[15]；以酵母tRNA為底物測定核糖核酸酶的活性[16]；以對硝基苯酚為底物測定α-半乳糖苷酶的活性[17]。

1.6 漆酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 漆酶最適pH

選用醋酸鈉緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液作為緩沖體系進行漆酶活力的測定。然后取一定量的粗酶液，將其與等體積不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）緩沖溶液（0.1 mol∕L）配置的ABTS溶液混合均勻，在25℃下測定酶活力，以酶活力最高值為100%，以各pH下相對酶活力對pH作圖。每組做3個重復(fù)。

1.6.2 漆酶最適溫度

將5 μL漆酶加入195 μL用最適pH緩沖液配制的ABTS溶液中，分別在4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃水浴中反應(yīng)10 min，加入300 μL 5%的TCA終止反應(yīng)，測定420 nm波長下的吸光值。每組做3個重復(fù)。以酶活性最高值為100%，以各溫度下的相對活力對相應(yīng)的溫度作圖。

1.6.3 金屬離子對漆酶活性的影響

將K+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Cr2+、Mn2+、Al3+、Zn2+和Fe2+的氯化物用去離子水配制成20 mmol∕L的母液，加入漆酶樣品中，使各種金屬離子的終濃度分別達到1.25 mmol∕L、2.5 mmol∕L、5 mmol∕L 和 10 mmol∕L，混合均勻，于4℃下孵育1 h，然后按照1.4.4所述的方法測定酶活性，每組做3個重復(fù)。以未與金屬離子孵育的漆酶活性為100%，以此計算此菌株漆酶經(jīng)各種金屬離子處理后的相對酶活性。

1.6.4 化合物對漆酶活性的影響

將抗壞血酸、草酸、尿素、EDTA用去離子水配制成20 mM的母液，加入漆酶樣品中，使各種化合物的終濃度分別達到1.25 mmol∕L、2.5 mmol∕L、5 mmol∕L、10 mmol∕L，混合均勻，于4℃、pH4.6的條件下孵育1 h，然后按照1.4.4所述的方法測定酶活性，每組做3個重復(fù)。以未與化合物孵育的漆酶活性為100%，以此計算此菌株漆酶經(jīng)各種化合物處理后的相對酶活性。

1.6.5 漆酶的染料脫色能力

選擇溴百里酚藍、鉻黑T和孔雀石綠這3種實驗室染料來評估漆酶的脫色能力。利用紫外可見分光光度法在不同的波長下測定最大吸光度，利用得到的OD值即可計算得到漆酶對于染料的脫色率。反應(yīng)體系為：將10 μL漆酶樣品加入490 μL染料溶液中，30℃水浴反應(yīng)。每個反應(yīng)體系設(shè)置3個重復(fù)，對照組中用熱滅活的漆酶樣品代替10 μL漆酶樣品。分別在4 h、12 h和24 h時定時取樣，測定各染料在最大吸收波長處的吸光度（A2），同時測定對照組吸光度（A1），脫色率計算公式[18]為：

A2為初始溶液的吸光度，A1為反應(yīng)后溶液的吸光度[18]

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株F0027在PDA斜面培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7 d。觀察菌絲體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，其為白色絨毛狀菌絲體，具粉質(zhì)感，有爬壁現(xiàn)象（圖1）。將菌絲體接種于培養(yǎng)料上23℃培養(yǎng)，出菇后觀察其子實體形態(tài)發(fā)現(xiàn)，菌蓋較白色金針菇大，金黃色，邊緣乳黃色且有細紋，菌肉白色，成簇密集彎曲生長，不等長；菌柄有黃褐色的絨毛，內(nèi)部松軟，呈纖維質(zhì)（圖2）。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

圖1 菌絲體形態(tài)

圖2 子實體形態(tài)

圖3 野生菌菌絲體r DNA ITS序列凝膠電泳圖

圖4 pH對菌株F0027漆酶活性的影響

圖5 溫度對菌株F0027漆酶活性的影響

對該菌株的培養(yǎng)料殘渣收集后經(jīng)提取酶液，測定其漆酶活性為315.38 U∕mL。然后用CTAB法提取DNA，并對該菌株的ITS序列進行測定，獲得DNA部分片段的大小為750 bp（圖3）。將該序列在Gen-Bank中進行BLAST同源性比較，發(fā)現(xiàn)與GenBank中報道過的1株Flammulina velutipes（登錄號：KR673332）同源性達99%以上。因此，經(jīng)rDNA-ITS序列分析以及形態(tài)特征的分析可知，該菌株初步被鑒定為黃色金針菇。

2.2 產(chǎn)酶種類及活性

經(jīng)酶液提取后，該上層清液中不同種類的酶活性測定結(jié)果如表1所示。由表1可見，F(xiàn)0027菌株為高產(chǎn)漆酶菌株。

表1 菌株F0027酶及酶活性測定

2.3 漆酶最適pH

測定了pH 3.0～9.0漆酶的酶活性，用相對酶活性繪制曲線。結(jié)果顯示，pH為4.8時，漆酶擁有最大的漆酶活性（圖4）。酶液在pH4.6～5.0，酶活性較高；當(dāng)pH大于9時，酶活性完全喪失。與大多數(shù)的真菌漆酶一樣，酸性條件下其漆酶活性較高。

2.4 漆酶最適溫度

在pH4.8的條件下，測定不同溫度下的漆酶活性，用相對酶活性繪制曲線。結(jié)果表明，殘渣中漆酶的最適反應(yīng)溫度為35℃（圖5）。

2.5 金屬離子對漆酶活性的影響

F0027菌株培養(yǎng)料殘渣中漆酶對于金屬離子的敏感性見表2。由表2可見，K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+對漆酶活性幾乎無影響；Cr2+、Al3+對漆酶活性有不同程度的抑制作用；Cu2+對漆酶活性的促進作用不明顯，F(xiàn)e2+對漆酶活性有強烈的抑制作用，且10 mmol∕L的Fe2+可以完全抑制漆酶的活性。

表2 金屬離子對漆酶活性的影響

2.6 化合物對漆酶活性的影響

表3表明，不同濃度的抗壞血酸均可完全抑制漆酶活性；草酸和EDTA對漆酶活性有強烈的抑制作用，且10 mmol∕L的草酸和EDTA可以完全抑制漆酶活性；尿素對漆酶活性幾乎無影響。

表3 化合物對漆酶活性的影響

2.7 漆酶的染料脫色能力

在紡織工業(yè)中，運用物理和化學(xué)方法對染料進行脫色既昂貴又低效。所以酶法脫色有著極大的益處。黃色金針菇漆酶對于不同的實驗室染料具有不同的脫色率。該漆酶對于依來鉻黑染料的脫色能力最強，在4 h、12 h、24 h后脫色率均在30%以上，且脫色率分別為37.8%、31.0%、32.0%（表3）。

表4 漆酶對3種染料的脫色率

3 小結(jié)與討論

經(jīng)分離鑒定得高產(chǎn)漆酶菌株F0027，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析和ITS測序及同源性比對鑒定為黃色金針菇。經(jīng)對其培養(yǎng)料殘渣進行漆酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)其為高產(chǎn)漆酶菌株。對其產(chǎn)漆酶酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究表明，該菌株漆酶的最適溫度與內(nèi)生真菌Monotosporasp.漆酶的最適溫度相似（30℃）[19]，然而該溫度比菌株Trametessp.漆酶的最適溫度低（75℃）[20]。與大多數(shù)真菌漆酶類似，該漆酶在酸性環(huán)境下的活性較高，在堿性環(huán)境下明顯失活[21]。

金屬離子對F0027產(chǎn)漆酶能力有不同程度的影響，其中K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+對漆酶活性幾乎無影響；Cr2+和Al3+對漆酶活性有不同程度的抑制作用；Fe2+會強烈抑制黃色金針菇的漆酶活性；該漆酶活性因低濃度的銅離子（1.25～5 mmol∕L）而增加，因高濃度銅離子而降低，該結(jié)果與ZHANG G Q等[5]、GUAN G P等[22]的研究相似，但 DALEL D等[23]和YOUNES S B等[24]研究發(fā)現(xiàn)Trametessp.和Symbio-bacterium thermophilum的漆酶會受到Cu2+的抑制，這種抑制作用可能是因為金屬離子改變了漆酶活性部位的構(gòu)象而引起的[25]。而且，漆酶完全受到抗壞血酸的抑制，這種抑制作用已經(jīng)在漆酶中有所報道[26]。抑制劑EDTA對該酶具有強烈的抑制作用，在濃度為10 mmol∕L時可完全抑制漆酶活性，結(jié)果與抑制劑EDTA對紫杉木尺菌漆酶活性影響結(jié)果不同[13]；草酸對漆酶有抑制作用，結(jié)果與草酸對雜優(yōu)-2平菇漆酶活性的影響結(jié)果相同[26]。

白腐真菌漆酶[27]、Lamprospora wrightii漆酶[28]都可以促使染料脫色。研究表明，F(xiàn)0027金針菇漆酶可以使溴百里香酚藍、依來鉻黑、孔雀石綠3種實驗室染料脫色。4～12 h，F(xiàn)0027漆酶對依來鉻黑染料的脫色率均在30%以上。另外，24 h后，依來鉻黑和孔雀石綠的脫色率比4 h時低，這一結(jié)果與Russula virescens漆酶對一些染料的脫色效果相同[18]，這可能是因為隨著脫色時間的增加，游離酶越來越少，酶與底物結(jié)合量減少，所以延長時間也不能增加染料的脫色率。

F0027金針菇漆酶在酸性和較低溫度環(huán)境下具有較高活性。雖然該漆酶對依來鉻黑的脫色能力最好，但是脫色率低于Russula virescens漆酶對于依來鉻黑的脫色率（＞50%）[18]。因此，該漆酶在工業(yè)方面應(yīng)用有待進一步研究。

F0027金針菇栽培條件可控、生長旺盛，并且該菌株生長過的培養(yǎng)料中的漆酶含量最高，這一點給今后商業(yè)生產(chǎn)中漆酶的應(yīng)用提供了依據(jù)，并且從黃色金針菇培養(yǎng)料中提取漆酶的成本低于目前已經(jīng)商業(yè)化的其他食用菌中提取成本。