梅花鹿鹿茸總蛋白對慶大霉素誘導(dǎo)腎毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制

孫 航，阮豪南，王露露，張 晶，

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春 130118；2.長春科技學(xué)院，吉林長春 130600）

氨基糖苷類藥物是較為常見的革蘭陰性菌抗生素，其中慶大霉素（gentamicin，GM）具有一定的代表性［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，GM的抗菌作用具劑量依賴性，但其耳毒性、腎毒性和速發(fā)型過敏性休克等嚴(yán)重不良反應(yīng)亦會隨劑量增加而增強(qiáng)［2］。GM用藥過程中，有10%～25%患者被誘導(dǎo)出腎毒性，并伴有急性腎衰竭癥狀［3-4］。如何減輕或預(yù)防GM腎毒性仍然是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

GM的腎毒性機(jī)制主要分2方面：①近端腎小管上皮細(xì)胞積聚GM，導(dǎo)致上皮細(xì)胞缺血或壞死等［5］；② 降低腎小球?yàn)V過率，升高血清肌酐（creati?nine，Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量［6］。組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GM可嚴(yán)重?fù)p傷腎組織結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大面積組織壞死，腎小管空泡化，腎小球皺縮，細(xì)胞排列疏松，刷狀緣不規(guī)則等現(xiàn)象。GM腎毒性產(chǎn)生的分子機(jī)制復(fù)雜，有研究表明，GM積聚于腎組織，從而誘導(dǎo)大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化酶活性下降和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，進(jìn)而影響細(xì)胞膜功能及完整性、氧化還原系統(tǒng)失衡和線粒體膜電位下降［7-9］。同時(shí)還伴有促炎細(xì)胞因子的上調(diào)，如白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6，并導(dǎo)致隨后的炎癥反應(yīng)發(fā)生［10-11］。

《中華人民共和國藥典》2015版記載，鹿茸具有壯腎陽、強(qiáng)筋骨和益精血等功效，主治腎陽不足，陽痿滑精、冷宮不孕、精血虧虛、神疲等證［12］。已知鹿茸中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、多糖、脂溶性成分和無機(jī)元素等［13］。鹿茸蛋白作為其主要的活性成分，具有清除自由基、修復(fù)組織、消炎和神經(jīng)保護(hù)等作用［14-16］。研究發(fā)現(xiàn)，梅花鹿鹿茸總蛋白（Sika deer velvetantler protein，SVPr）對順鉑誘導(dǎo)的腎毒性具有一定改善作用［17-18］。本研究旨在探討SVPr對GM誘導(dǎo)的腎毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

梅花鹿二杠茸于2017年采購于吉林雙陽鹿場（瑞龍鹿業(yè)有限公司），經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)王全凱教授鑒定為梅花鹿（Cervus nipponTemminck）二杠茸。SVPr由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院中藥學(xué)研究室提取。梅花鹿茸粉碎過80目篩，取鹿茸粉末50 g，按料液比1∶10加入蒸餾水，60℃，80 Hz超聲30 min，過濾，重復(fù)5次，合并提取液［14］。提取液4℃恒溫?cái)嚢?，緩慢加?5%乙醇，使醇含量達(dá)85%（V/V），4℃靜置4 h后，6000×ɡ離心10 min，棄上清液，以適量蒸餾水迅速溶解沉淀，冷凍干燥得SVPr，收率為20.78%。經(jīng)Bradford法檢測，蛋白質(zhì)含量＞90%。

GM（長春市修正藥業(yè)有限公司，純度≥95%，批號：20160616）；芥子酸（sinapic acid，SA，合肥市博美生物科技有限責(zé)任公司，純度≥98%，批號：20160306）；DMEM/HIGH培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、PBS（HyClone，美國）；胎牛血清（Clark，美國）；0.25%胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲亞砜（DMSO）（Amresco，美國）；丙二醛（malondial?dehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydro?genase，LDH）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、Cr和BUN測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6 ELISA試劑盒（博士德生物工程有限公司）；其余化學(xué)試劑均為分析純。

BP211D電子天平（Switzerland，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；XSP-BM-8CA生物顯微鏡（上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司）；連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Selecta，西班牙）；超凈工作臺和高壓蒸汽滅菌鍋（Sanyo，日本）；KQ-250DB數(shù)控超聲清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher，美國）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳公司）；水平搖床（東聯(lián)電子技術(shù)公司）；石蠟切片機(jī)（Leica，德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞

雄性ICR小鼠42只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，動物許可證號SCXK-（吉）2011-0007。動物飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會要求，小鼠自由飲水?dāng)z食，在室溫24～26℃、濕度55%～65%、明暗交替12 h（7∶00～19∶00照明）的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院分子免疫實(shí)驗(yàn)室提供。以含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液在恒溫37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液，待細(xì)胞密度達(dá)75%～85%用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測定HEK293細(xì)胞存活

將HEK293細(xì)胞消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，制成單細(xì)胞懸液，并接種于96孔板，每孔1.0×104細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白對照組（含等量培養(yǎng)液，無細(xì)胞）。GM和SVPr以PBS溶解，以0.22 μm濾膜過濾除菌后用于實(shí)驗(yàn)。藥物處理分2部分進(jìn)行，①將HEK293細(xì)胞與GM（終濃度分別1，2，3，4，5，6，7，8和9 g·L-1）共同孵育24 h后；② 將HEK293細(xì)胞分為正常對照組（給予等量PBS）、GM模型組（給予GM 3.00 g·L-1孵育24 h）和模型+SVPr組（分別給予SVPr 1，2和4 g·L-1孵育24 h后，加入GM 3.00 g·L-1共同孵育24 h）。藥物處理后，每孔加入MTT（5 g·L-1）20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，待結(jié)晶充分溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm處測定各孔吸光度（A570nm）值。細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A570nm-空白對照組A570nm）/（正常對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。

1.4 HEK293細(xì)胞LDH，GSH和MDA含量及SOD活性測定

將HEK293細(xì)胞以每孔6×104細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞分組和藥物處理同1.3。藥物處理后：①收集各孔培養(yǎng)上清液，按照LDH微板法試劑盒說明書操作，測A450nm值，計(jì)算LDH釋放量。②吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，以PBS洗細(xì)胞2次后反復(fù)凍融2～3次，3500×g離心10 min，收集上清液，按照GSH微板法試劑盒說明書操作，測A405nm值，計(jì)算GSH含量。③吸棄孔內(nèi)含藥培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞2次，加50 μL細(xì)胞裂解液裂解10 min，3500×g離心10 min取上清液，按SOD WST-1法試劑盒說明書操作，測A405nm值，計(jì)算SOD活性。④吸棄孔內(nèi)含藥培養(yǎng)液，加MDA提取液0.5 mL，混勻2 min，超聲波（功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次）破碎細(xì)胞制成懸浮液，按MDA微板法試劑盒說明書操作，測A530nm值，計(jì)算MDA含量。

1.5 動物分組和處理

42只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組7只。正常對照組：連續(xù)ig給予等量蒸餾水10 d，在第3～10天ip給予等量生理鹽水；模型組：連續(xù)ig蒸餾水10 d，在第3～10天 ip給予GM 100 mg·kg-1［8］；陽性對照組：連續(xù)ig給予SA 20 mg·kg-1［7］10 d，第3～10天，在SA給藥前6 h ip給予GM 100 mg·kg-1；SVPr組：連續(xù)ig給予SVPr（50，100和200 mg·kg-1）10 d，第3～10天，在SVPr給藥前6 h ip給予 GM 100 mg·kg-1。所有小鼠末次給予GM前12 h禁食禁水，SVPr末次給藥2 h后眼眶內(nèi)靜脈取血，取血后乙醚麻醉處死。

1.6 小鼠體質(zhì)量和腎指數(shù)的測定

未次給藥前記錄小鼠體質(zhì)量。處死小鼠后立即取新鮮雙側(cè)全腎，去除腎外膜和脂肪后稱取腎質(zhì)量，計(jì)算腎指數(shù)。腎指數(shù)=腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.7 小鼠血清BUN和Cr水平的檢測

取收集的小鼠血液樣本，待血液凝固約30 min后，3500×g離心15min取上清。按照試劑盒說明書操作，測定小鼠血清中BUN和Cr水平。酶標(biāo)儀405 nm波長處測定吸光度，根據(jù)說明書計(jì)算BUN和Cr含量。

1.8 小鼠腎組織SOD和CAT活性及GSH和MDA含量的檢測

剪取右腎腎皮質(zhì)按1∶9比例加入冰浴0.9%NaCl溶液研磨制備10%勻漿組織液，4℃、3500×ɡ離心10 min。按CAT可見光法試劑盒說明書操作，測A405nm值，計(jì)算CAT活性。SOD活性及GSH和MDA含量的測定按試劑盒說明書操作，具體方法同1.4。

1.9 ELISA法測定小鼠血清中TNF- α和IL-6含量

小鼠血液樣本處理方法同1.7。按試劑盒說明書操作，測A450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α和IL-6含量。

1.10 HE染色觀察小鼠腎組織病理變化

將新鮮的左腎修剪為4 mm×3 mm×3 mm的組織塊，經(jīng)固定、脫水、透明化、包埋、切片（6 μm）處理后按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理學(xué)變化。病理標(biāo)本進(jìn)行編號，每組隨機(jī)選取3個(gè)標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取7個(gè)視野，根據(jù)腎小管損傷程度進(jìn)行評分。0分：無損傷；1分：腎小管上皮腫脹，出現(xiàn)炎癥浸潤；2分：腎小管出現(xiàn)大面積炎癥細(xì)胞浸潤及管腔擴(kuò)張；3分：腎小管上皮細(xì)胞核染色消失；4分：腎小管結(jié)構(gòu)破壞，上皮細(xì)胞核無著色。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用±s表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)（HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果）采用Ridit檢驗(yàn)分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SVPr對GM誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞存活的影響

與正常對照組相比，GM 1～9 g·L-1組顯著抑制HEK293細(xì)胞存活（P＜0.01），半數(shù)抑制濃度（IC50）為3 g·L-1（圖1）。SVPr 1，2和4 g·L-1顯著緩解GM 3 g·L-1對HEK293細(xì)胞存活的抑制作用（P＜0.01），與GM模型組相比，細(xì)胞存活率顯著上升（P＜0.01）（圖2）。

Fig.1 Effect of gentamicin（GM）on HEK293 cell viability by MTT assay.HEK293 cells were exposed to various concentra?tions of GM for 24 h.Cell viability（%）=［（A570nmof treatment group-A570 nmof blank group）/（A570 nmof control group-A570 nmof blank group）］×100%.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control（0）group.

Fig.2 Effect of Sika deer velvet antler protein（SVPr）on HEK293 cell viability induced by GM by MTT assay.HEK293 cells were pretreated with SVPr（1，2 and 4 g·L-1）for 24 h，then were added with GM（3 g·L-1）and co-cultured for 24 h.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with GM group.

2.2 SVPr對GM誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞LDH、GSH和MDA含量及SOD活性的影響

與正常對照組相比，GM模型組HEK293細(xì)胞內(nèi)GSH含量和SOD活性顯著降低（P＜0.01），LDH釋放量及MDA含量明顯升高（P＜0.01）。與GM模型組相比，SVPr 4 g·L-1組GSH含量和SOD活性分別升高了49.03%和60.98%（P＜0.01），LDH釋放量及MDA含量顯著降低（P＜0.01），與GM模型組相比，分別降低45.57%和54.71%（圖3）。

Fig.3 Effect of SVPr on lactate dehydrogenase（LDH，A），glutathione（GSH，B），malondialdehyde（MDA，C），and superoxide dismutase（SOD，D）of HEK293 cells with GM-induced oxidative stress damage.See Fig.2 for HEK293 cell treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with GM group.

2.3 SVPr對GM誘導(dǎo)腎損傷小鼠體質(zhì)量和腎指數(shù)的影響

與正常對照組相比，GM模型組小鼠體質(zhì)量減少（P＜0.01），腎質(zhì)量及腎指數(shù)均顯著增加（P＜0.01），表明GM對小鼠具有腎損傷作用，造模成功。與GM模型組相比，SVPr 50，100，200 mg·kg-1和陽性藥均顯著降低小鼠腎質(zhì)量與腎指數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），升高小鼠體質(zhì)量（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

Tab.1 Effect of SVPr on body mass，kidney mass and kidney index of mice with GM-induced renal injury

2.4 SVPr對GM誘導(dǎo)腎損傷小鼠血清BUN和Cr的含量影響

與正常對照組相比，GM模型組小鼠血清Cr和BUN含量顯著升高（P＜0.01），提示腎小球過濾功能紊亂；與GM模型組相比，不同劑量的SVPr和陽性藥均顯著降低血清Cr和BUN的含量（P＜0.01）（圖4）。

Fig.4 Effect of SVPr on levels of blood urea nitrogen（BUN，A）and creatinine（Cr，B）in serum of mice with GM-induced renal injury.See Tab.1 for the mouse treat?ment.±s，n=7.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with GM group.

2.5 SVPr對GM誘導(dǎo)腎損傷小鼠腎組織SOD和CAT活性及GSH和MDA含量的影響

與正常對照組相比，GM模型組小鼠腎組織中SOD和CAT的活性及GSH的含量顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與GM模型組相比，不同劑量SVPr和陽性藥組小鼠腎組織中SOD和CAT活性顯著升高（P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；SVPr 100和200 mg·kg-1以及陽性藥組GSH含量顯著升高（P＜0.01），而SVPr 50 mg·kg-1組GSH含量無顯著變化（圖5）。

Fig.5 Effect of SVPr on SOD（A），catalase（CAT，B），GSH（C）and MDA（D）of mice with GM-induced renal injury.See Tab.1 for the mouse treatment.±s，n=7.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with GM group.

2.6 SVPr對GM誘導(dǎo)腎損傷小鼠血清中TNF- α和IL-6水平的影響

與正常對照組相比，GM模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯升高（P＜0.01）。與GM模型組相比，不同劑量SVPr和陽性藥組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），但均未恢復(fù)至正常水平（圖6）。

Fig.6 Effect of SVPr on levels of tumor necrosis factor- α（TNF- α，A）and interleukin-6（IL-6，B）in serum of mice with GM-induced renal injury.See Tab.1 for the mouse treatment.±s，n=7.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with GM group.

2.7 SVPr對GM誘導(dǎo)腎損傷小鼠腎組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果（圖7，表2）顯示，正常對照組腎組織中，腎小球及周圍腎小管結(jié)構(gòu)正常且清晰，細(xì)胞外基質(zhì)均勻，無病變現(xiàn)象。與正常對照組相比，GM模型組小鼠腎小管管腔出血，腎小管空泡變性，上皮細(xì)胞脫落和變性壞死，腎小球皺縮，腎小管壞死程度等級顯著升高（P＜0.05）。與GM模型組相比，SVPr給藥組小鼠腎組織病理變化均有不同程度的改善，Ridit分析顯示，SVPr 200 mg·kg-1組和陽性藥組小鼠腎小管壞死程度等級顯著降低（P＜0.05），但均未恢復(fù)至正常水平。

Tab.2 Effect of SVPr on renal tubular pathological changes in mice with GM-induced renal injury.

Fig.7 Histopathological changes in renal tissues of mice with GM-induced renal injury.See Tab.1 for the mouse treatment.The arrows show renal pathological changes including renal tubular epithelial cell necrosis，cell structure collapse and inflammatory infiltration.

3 討論

本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SVPr對GM誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，使HEK293細(xì)胞存活率顯著升高，內(nèi)源性抗氧化酶活性升高，LDH釋放量和MDA含量下降。

GM 100 mg·kg-1可誘導(dǎo)血清中BUN和Cr水平顯著升高，并誘導(dǎo)小鼠腎組織中SOD和CAT活性及GSH含量降低，以及MDA含量升高，呈現(xiàn)腎損傷癥狀。SVPr給藥后，小鼠血清中BUN和Cr水平下降，SOD和CAT活性、GSH含量升高及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量下降，GM所致小鼠腎功能損傷得到不同程度的恢復(fù)。GM誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷時(shí)，大量活性氧物質(zhì)積聚于腎組織中［19］，且常伴有細(xì)胞色素系統(tǒng)紊亂［20］。研究結(jié)果表明，SVPr可恢復(fù)內(nèi)源性抗氧化酶活性及降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，推測SVPr對活性氧物質(zhì)的清除和恢復(fù)細(xì)胞色素系統(tǒng)穩(wěn)定具有潛在的藥理活性作用。值得注意的是，BUN和Cr的下降無顯著的量效關(guān)系，這可能與BUN和Cr作為腎損傷標(biāo)志物的靈敏度低和延遲性有關(guān)［21］。因此，應(yīng)選用更為靈敏的、早期性的標(biāo)志物，如腎損傷分子-1、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶和胱抑素C等作為檢測早期腎損傷的指標(biāo)［22-23］。

GM誘導(dǎo)腎毒性的另一個(gè)分子機(jī)制是炎癥反應(yīng)，GM激活相應(yīng)炎癥通路及促炎因子，從而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附到腎皮質(zhì)細(xì)胞引起腎損傷［24］。然而經(jīng)SVPr治療后，GM誘導(dǎo)的腎毒性小鼠血清中TNF-α和IL-6水平顯著降低，表明SVPr可通過抑制炎癥反應(yīng)對GM腎毒性發(fā)揮改善作用。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件（nuclear factorerythroid 2 related factor2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）信號通路作為氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路，與腎疾病密切相關(guān)，其調(diào)控的下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶在細(xì)胞防御中發(fā)揮重要作用，其中Nrf2調(diào)控的下游靶基因血紅素加氧酶1（heme oxygenase，HO-1）不僅在生理狀態(tài)下發(fā)揮作用，更主要是在機(jī)體處于病理或應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮抗炎和抗氧化等作用［25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SVPr改善GM誘導(dǎo)的小鼠腎組織中內(nèi)源性抗氧化酶活性和GSH、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量及血清中炎癥因子TNF-α和IL-6水平，推測Nrf2/HO-1信號通路可能是SVPr改善GM誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥損傷的藥物靶點(diǎn)。與此同時(shí)，病理切片檢驗(yàn)結(jié)果顯示，GM腎毒性小鼠給予SVPr后，腎小管管腔出血明顯減少，腎小球囊腔內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯減少，透明管型現(xiàn)象減少，間充質(zhì)內(nèi)水腫及中性粒細(xì)胞浸潤減少，細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常。進(jìn)一步表明，SVPr對GM誘導(dǎo)的腎組織損傷具有改善作用。

綜上所述，SVPr通過改善氧化應(yīng)激水平、炎癥反應(yīng)對GM誘導(dǎo)的小鼠腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。