組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)、維生素D受體和Wnt/β-catenin在慢性病中交互作用的研究進展

李文雄，丁 凡，王擁軍,2，施 杞,2，張 巖,2

(1. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院脊柱病研究所，上海 200032；2. 教育部筋骨理論與治法重點實驗室，上海 200032)

根據(jù)WHO的數(shù)據(jù)顯示，到2030年，心腦血管疾病、惡性腫瘤、糖尿病、慢性腎病等慢性非傳染性疾病(簡稱“慢性病”)將成為全球人口死亡的主要原因[1]。然而慢性病病因復雜，單一方面研究取得的成果有限。已知腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的激活在慢性腎臟病和心血管疾病的發(fā)病機制中起著至關重要的作用。Wnt/β-catenin信號通路是一種進化保守的發(fā)育信號級聯(lián)，在調(diào)節(jié)器官發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用?；钚跃S生素D通過與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結合，除了維持血循環(huán)中鈣、磷水平穩(wěn)定外，近來發(fā)現(xiàn)，其活性轉(zhuǎn)化酶CYP27B1在多個組織都有表達，并且維生素D對局部組織的生理調(diào)控也有重要作用。因此，Wnt/β-catenin信號通路、RAS和VDR均在多種慢性病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本文從Wnt/β-catenin信號通路、RAS和VDR 3者的關系出發(fā)，探究3者是否在慢性病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用，以期為從多角度研究慢性病及創(chuàng)新藥物研發(fā)提供一定的理論支持。

1 Wnt/β-catenin、RAS和VDR

1.1 Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控胚胎發(fā)育、維持成體組織穩(wěn)態(tài)、參與細胞增殖和分化等方面發(fā)揮著重要作用。沒有Wnt信號時，胞質(zhì)內(nèi)的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)大部分與胞膜E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及α-連環(huán)蛋白(α-catenin)結合形成復合體，參與調(diào)節(jié)細胞骨架，維持同型細胞的黏附作用，防止細胞轉(zhuǎn)移。少部分β-catenin與軸蛋白(Axin)、結直腸腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白、酪蛋白激酶1(carsein kinase 1, CK1)、糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)形成降解復合物。降解復合物中的GSK-3β磷酸化β-catenin，進而被泛素連接酶β-TrCP(β-transducin repeats-containing proteins)蛋白識別而泛素化，維持胞質(zhì)內(nèi)游離β-catenin處于低水平狀態(tài)[2-3]。當有Wnt信號傳入時，Wnt蛋白與跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled, FZD)結合，在輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 (low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6)協(xié)同作用下，開啟Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導，激活細胞內(nèi)的CK1，CK1使Dsh/Dvl磷酸化，釋放GSK-3β結合蛋白(GBP)，抑制GSK-3β的磷酸激酶活性，使GSK-3β不能磷酸化β-catenin，β-catenin不被泛素識別，從而不被蛋白酶復合體降解，胞質(zhì)中大量游離的β-catenin聚集，打破了出、入核平衡，β-catenin在核內(nèi)聚集并結合T細胞因子(T cell factor, TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancing factor，LEF)，激活下游靶基因，誘導細胞增殖[4]。

1.2 RASRAS是一種重要的激素內(nèi)分泌系統(tǒng)，主要發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓、水平衡、電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)和心臟重塑等作用。在多種因素作用下，腎小球旁器分泌的腎素，并促使血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)生成血管緊張素Ⅰ (angiotensin Ⅰ，Ang Ⅰ)，Ang Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)作用下，轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ (angiotensin Ⅱ，AngⅡ)。 AngⅡ是RAS中重要的生物活性物質(zhì)，主要通過與靶器官細胞膜上的特異性受體結合而發(fā)揮生理和病理效應。除了傳統(tǒng)循環(huán)中的RAS以外，多數(shù)組織也可通過自分泌、旁分泌或細胞內(nèi)分泌等方式發(fā)揮局部作用。如在心臟、肝臟、胰腺、血管、腦、腎等許多組織中，AngⅡ可以不釋放到血液中而發(fā)揮局部作用。研究顯示，不僅局部組織產(chǎn)生RAS，細胞也存在自身的RAS，如心肌細胞、神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞等多種細胞中，均發(fā)現(xiàn)RAS成分[5-7]，說明RAS在細胞代謝與功能、組織器官中都具有重要的生物學作用。

1.3 VDRVDR是介導活性維生素D發(fā)揮生物效應的生物大分子，是存在于細胞質(zhì)和細胞核中的核類固醇受體超家族的一員，主要分布在骨骼、腸道、腎臟等傳統(tǒng)靶器官上，心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有一定VDR表達[8]。

VDR由膜受體(mVDR)和核受體(nVDR)兩大類組成。mVDR通過調(diào)節(jié)激酶和磷酸酶的活性，控制離子通道的開放狀態(tài)，發(fā)揮經(jīng)典的鈣磷調(diào)節(jié)作用[9]。nVDR是核受體超家族中的一員，包括N端區(qū)、DNA結合區(qū)(DBD)和C端的配體結合區(qū)(LBD)。在N端區(qū)和LBD各有1個激活功能(activation function，AF)區(qū)。nVDR與活性維生素D結合后，構象發(fā)生變化，與維甲類X受體(retinoid X receptor，RXR)結合，構成異質(zhì)二聚體并轉(zhuǎn)位到細胞核中，與目標基因啟動子區(qū)域中的維生素D反應元件(vitamin D response element，VDRE)結合，發(fā)揮基因調(diào)控效應，參與維生素D的非鈣磷調(diào)節(jié)作用[10]。

2 Wnt/β-catenin信號通路、RAS和VDR之間的交互作用

2.1 Wnt/β-catenin信號通路和RAS健康成人的Wnt/β-catenin信號處于沉默狀態(tài)，而在慢性病發(fā)生、發(fā)展過程中，Wnt/β-catenin信號被激活。已知RAS是引發(fā)慢性腎病、高血壓、冠心病等慢性病的一個重要因素，因此，Wnt/β-catenin和RAS可能在慢性病的發(fā)生、發(fā)展過程中存在著交聯(lián)與對話。

Zhao等[11]通過注射AngⅡ誘導心臟肥大模型大鼠，表現(xiàn)為β-MHC、α-actin、α平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和B型利鈉肽(type B natriuretic peptide，BNP)的表達明顯升高，心臟/體質(zhì)量比值升高，心室結構異常，心肌纖維化，血壓升高。使用Wnt信號抑制劑ICG-001治療后，明顯抑制了β-MHC、α-actin、α-SMA、ANP和BNP的表達，降低心臟/體質(zhì)量比值，抑制心室重構及心肌纖維化，降低血壓，效果和氯沙坦相當。使用AngⅡ處理大鼠的原代心肌細胞，qRT-PCR檢測到Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt11、Wnt16 mRNA的表達升高，免疫熒光染色顯示，β-catenin表達升高并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移；蛋白免疫印跡法顯示，β-catenin表達升高，其下游Snail1、PAI-1和c-Myc靶基因表達增加。ICG-001能夠抑制β-catenin的激活及其下游靶基因的表達，抑制β-MHC、α-actin、ANP、BNP的表達，縮小肥大的心肌細胞。以上體內(nèi)、體外實驗結果表明，RAS通過激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導心肌細胞損傷并促進心臟纖維化，而使用ICG-001能阻斷該信號，對心臟起到保護作用。提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可能是RAS調(diào)控的下游系統(tǒng)，并且可以作為治療心臟病的新靶點[11-12]。

此外，在梗阻性腎病、阿霉素腎病、腎臟缺血/再灌注損傷以及5/6腎切除的殘余腎中，均可見到Wnt/β-catenin信號被激活，β-catenin在胞質(zhì)中累積并轉(zhuǎn)移到核中，與TCF/LEF結合，促進靶基因的表達。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，TCF/LEF的結合位點位于AGT、腎素、ACE、AT1R和AT2R等所有RAS組分的基因啟動子區(qū)域，激活β-catenin能夠促進LEF-1和這些位點結合，過表達β-catenin能夠誘導多個RAS組分基因表達[13-14]。因此，Wnt/β-catenin信號也可能是RAS的上游調(diào)控系統(tǒng)。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路和VDR在人源結腸癌細胞中，1,25(OH)2D3拮抗Wnt/β-catenin信號通路的機制主要有3種[15-16]：第一，誘導細胞內(nèi)的VDR和β-catenin相互作用，減少β-catenin和TCF的結合，抑制下游基因的表達；第二，誘導E-cadherin的表達，促進β-catenin從細胞核中輸出并將其重新定位，黏附在細胞膜上；第三，1,25(OH)2D3誘導細胞分泌Wnt信號通路的抑制分子DKK1，從而抑制Wnt/β-catenin信號傳導。因此，從最終效應來看，1,25(OH)2D3明顯抑制結腸癌細胞β-catenin/TCF靶基因的表達，如c-MYC、TCF1、LEF1、AXIN2、PPAR、CD44、ENC1、EPHB2等。

進一步實驗發(fā)現(xiàn)，使用1,25(OH)2D3干預野生型小鼠后，VDR報告基因的活性上升，β-catenin的活性降低；而在VDR-/-的小鼠中呈現(xiàn)出相反的結果。在E-cadherin陽性和陰性的SKBR3的細胞中，1,25(OH)2D3對β-catenin信號的抑制作用相當。以上實驗表明，1,25(OH)2D3發(fā)揮抑制β-catenin信號的作用主要依賴于與VDR的結合，而不是E-cadherin。通過ChIP芯片篩選影響成骨細胞功能的基因研究中，F(xiàn)retz等[17]發(fā)現(xiàn)，小鼠LRP5基因至少存在1個VDRE，與1,25(OH)2D3/VDR結合后，直接影響LRP5基因座內(nèi)染色質(zhì)結構的修飾，并在體內(nèi)、外引起LRP5基因表達水平的增加，證實小鼠LRP5是1,25(OH)2D3的靶基因，并據(jù)此推測1,25(OH)2D3可能調(diào)控Wnt信號通路影響骨生成。

Guo等[18]發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠腎組織VDR蛋白、mRNA水平降低，蛋白尿增加，GSK-3β、β-catenin的蛋白和mRNA水平升高。使用帕立骨化醇治療后，VDR表達上調(diào)，而GSK-3β和β-catenin表達下調(diào)。使用腎小球足細胞進行體外實驗，證實了上述結果。因此，提示激活VDR能夠調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子，減少糖尿病蛋白尿的產(chǎn)生，改善腎臟損傷癥狀。另外，部分受維生素D調(diào)節(jié)的靶基因的啟動子區(qū)中不含VDRE，維生素D/VDR是通過結合Wnt信號通路的β-catenin，直接發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用[19]。比如，He等[20]發(fā)現(xiàn)，帕立骨化醇不僅能抑制Wnt蛋白的表達，還能誘導VDR和β-catenin結合，抑制β-catenin下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而起到防治慢性腎病的腎損傷、蛋白尿的產(chǎn)生及腎小球足細胞功能障礙的作用。結構分析發(fā)現(xiàn)，VDR通過AF-2區(qū)與β-catenin的C末端結合發(fā)揮作用，而β-catenin蛋白C末端乙酰化程度的高低，影響其與VDR結合能力的強弱。

2.3 RAS和VDR糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的腎臟并發(fā)癥，是導致終末期腎病發(fā)病及死亡的主要原因之一。腎組織RAS活性的改變導致腎臟高濾過和高灌注是DN發(fā)病的關鍵因素之一。目前，臨床治療DN的一線用藥主要包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)。然而，由于此類藥物破壞了AngⅡ?qū)δI素的反饋抑制環(huán)，引起腎素水平的升高，減弱RAS抑制劑的療效。那么，是否能夠通過抑制代償性腎素的升高，加強RAS抑制劑的療效。Zhang等[21]使用活性維生素D類似物度骨化醇(doxercalciferol)配合氯沙坦，治療鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病小鼠，結果顯示，聯(lián)合用藥組在預防蛋白尿、恢復腎小球濾過屏障結構和改善腎小球硬化方面的效果優(yōu)于單一用藥組。表明維生素D在DN治療中有良好的應用前景，并證實了通過抑制代償性腎素的升高能夠加強RAS抑制劑療效的觀點[22]。

應用單側(cè)輸尿管結扎術構建梗阻性腎病模型，發(fā)現(xiàn)VDR-/-小鼠和野生小鼠均出現(xiàn)腎小管明顯萎縮、腎間質(zhì)纖維化，VDR-/-小鼠腎臟損傷程度重于野生小鼠。已知VDR-/-小鼠激活RAS系統(tǒng)，引起AngⅡ在腎臟中的累積，并加重梗阻性腎病模型小鼠的腎臟損傷程度。通過使用ARB類藥物氯沙坦治療梗阻性腎病模型小鼠，明顯改善腎臟損傷程度。同樣，體外實驗發(fā)現(xiàn)，AngⅡ明顯促進VDR-/-小鼠的原代近曲腎小管細胞發(fā)生上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)，誘導胞外基質(zhì)的生成[23]。因此，VDR缺失，誘導RAS激活并引起腎損傷。

大量研究表明，血清中1,25(OH)2D3的水平與高血壓患者的血壓以及原發(fā)性高血壓患者的腎素活性之間呈負相關[24]。VDR-/-小鼠出現(xiàn)高血壓、心肌肥大、多飲等癥狀，使用ACE抑制劑卡托普利或AT1R拮抗劑氯沙坦治療，能夠糾正這些癥狀，說明這些異常癥狀出現(xiàn)與RAS活性升高相關。VDR-/-小鼠腎臟中腎素的表達上調(diào)；正常小鼠使用不同劑量的1,25(OH)2D3注射后，腎素的表達也受到抑制，說明1,25(OH)2D3能夠抑制腎素的生物合成。1,25(OH)2D3通過抑制腎素的合成、減少AngⅡ的表達，發(fā)揮降低血壓、抑制心肌肥厚的作用[25]。體外實驗證實，VDR-/-小鼠腎小球足細胞p53、AGT、腎素和AT1R的表達及AngⅡ含量升高，去乙?；窼IRT1的表達降低。VDR和過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)競爭性地與RXR結合發(fā)揮功能。當VDR缺乏時，PPARγ和RXR結合，而PPARγ會抑制SIRT1的表達。因此，VDR-/-小鼠表現(xiàn)出SIRT1的表達下調(diào)，進而促進了p53的乙?；饔?，p53能夠調(diào)控RAS的活化和心肌細胞的肥大[26-27]。因此，激活VDR可以通過直接抑制腎素或者間接抑制PPARγ/p53通路，調(diào)控RAS組分與RAS活性。

體外高糖培養(yǎng)狀態(tài)下，胰腺胰島β細胞RAS組分的表達上調(diào)，而骨化三醇可以通過抑制RAS組分高表達而刺激胰島素分泌[28]。VDR-/-小鼠β細胞RAS組分mRNA和蛋白的表達均較野生型小鼠升高，而且飲食誘導構建的維生素D缺少癥模型小鼠表現(xiàn)為葡萄糖耐量降低，胰島RAS組分基因表達升高，胰島功能障礙，表明維生素D/VDR通路能夠抑制胰島組織RAS組分表達。骨化三醇能夠促進胰島素的分泌，并改善高糖狀態(tài)下RAS組分的異常表達，提示活性維生素D對2型糖尿病具有潛在的保護作用，這可能是通過調(diào)控胰島細胞VDR信號通路，進而調(diào)節(jié)局部RAS的相關效應，以及調(diào)控胰島素分泌而發(fā)揮作用[29]。

3 展望

在冠心病、高血壓等心血管疾病中，RAS-Wnt/β-catenin信號級聯(lián)是主要分子通路，通過激活VDR，能夠抑制RAS-Wnt/β-catenin信號通路，起到抑制疾病進展，甚至逆轉(zhuǎn)疾病進程的作用。在慢性腎病中，活性維生素D通過VDR抑制Wnt/β-catenin-RAS信號通路，防治腎臟損傷。總之，VDR、Wnt/β-catenin、RAS 3個分子信號通路在心血管病、慢性腎病的病理生理過程中發(fā)揮著重要的生物調(diào)控作用。

ACEI、ARB等RAS抑制劑臨床主要治療高血壓、慢性腎病等。然而，由于此類藥物破壞了AngⅡ?qū)δI素的反饋抑制環(huán)路，繼而引起腎素水平升高，減弱RAS抑制劑的療效。活性維生素D類似物，如帕立骨化醇、度骨化醇、骨化三醇等通過激動VDR，抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活和腎素的表達，預防冠心病、高血壓、慢性腎病的發(fā)生和發(fā)展，但具體的臨床療效還有待進行多中心、大樣本的臨床驗證。今后，研發(fā)靶向作用于Wnt/β-catenin/RAS的維生素D類似物，尤其從中藥與天然產(chǎn)物中研發(fā)維生素D樣作用的活性成分，同時有效治療心血管疾病、慢性腎病等多種慢性疾病，不僅能夠減輕醫(yī)療經(jīng)濟負擔，還能減少患者的服藥量，提高患者生活質(zhì)量。