骨肉瘤免疫靶向治療相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展①

曾新歆 王勝濤 貴 鵬 吳 昊 李朝旭

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨二科,桂林 541004)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)以局部疼痛、腫脹、活動受限為臨床癥狀，以生長速度快、惡性程度高、轉(zhuǎn)移時間早為發(fā)病特點。經(jīng)傳統(tǒng)外科手術(shù)治療、新輔助化療后患者生活質(zhì)量降低、腫瘤易復(fù)發(fā)，是骨肉瘤治療的主要困難。近來，骨肉瘤協(xié)作研究小組(Cooperative Osteosarcoma Study Group,COSS)和歐洲骨肉瘤協(xié)作組(European Osteosarcoma Intergroup,EOI)共同進(jìn)行EURAMOS-1試驗，探索經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)新輔助化療后療效較差的骨肉瘤患者，若繼續(xù)化療，是否可以改善無事件生存率(Event-free survival,EFS)。該團(tuán)隊加用異環(huán)磷酰胺、依托泊苷及聚乙二醇化干擾素α-2b(Peginterferon alpha-2b,INF α-2b)后,局限性O(shè)S患者5年生存率為65%～70%，轉(zhuǎn)移性O(shè)S患者5年生存率僅為19%～30%， EFS并未提高[1]，該研究表明使用普通化療藥物不能提高抗OS療效。

免疫治療指通過人為刺激提高宿主免疫反應(yīng)，增加細(xì)胞殺傷毒性，繼發(fā)性增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，殺滅癌組織，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。靶向治療是在分子水平通過抑制或激活腫瘤生長所必需的重要通路，促進(jìn)T細(xì)胞清除，加速腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。靶向治療后出現(xiàn)耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)等現(xiàn)象，對遠(yuǎn)期療效有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，除了直接清除腫瘤細(xì)胞外，靶向治療還能參與免疫調(diào)節(jié)過程，加速腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)啟動[4]，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)，持續(xù)高效性殺傷靶細(xì)胞。免疫聯(lián)合靶向治療可能存在協(xié)同機(jī)制，放大細(xì)胞毒性作用，抑制腫瘤耐藥細(xì)胞形成[5]，解除細(xì)胞凋亡抑制，改善腫瘤微環(huán)境。

1 抗OS的免疫治療

1.1抗OS治療的免疫反應(yīng)過程 將免疫學(xué)方法運用于抗OS治療始于1891年[6]，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，提取處理后的細(xì)菌物質(zhì)可影響腫瘤增殖。從單一藥物單個靶點試驗，到多藥聯(lián)合不同免疫反應(yīng)過程相結(jié)合，經(jīng)過上百年的發(fā)展，OS免疫治療取得跨越式成功。經(jīng)大量研究證實，免疫制劑通過免疫擴(kuò)增的方法刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)，上調(diào)免疫應(yīng)答強(qiáng)度，降低免疫耐受[7]。

抗OS免疫反應(yīng)大致經(jīng)過以下過程：最初樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)識別骨腫瘤特異性抗原，經(jīng)主要組織相容復(fù)合體(Major histocompatibility complex,MHC)通路激活T細(xì)胞(主要為CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞)[8]，通過T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)介導(dǎo)以及大量共刺激分子共同作用，活化的腫瘤特異性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞。此過程需逃避免疫檢查點監(jiān)控，克服大量免疫反應(yīng)負(fù)性影響殺滅腫瘤細(xì)胞。免疫反應(yīng)是多個過程相銜接，多信號共同刺激，層層遞進(jìn)，相互作用，對腫瘤進(jìn)行長期穩(wěn)定的破壞。

1.2免疫治療OS的最新進(jìn)展

1.2.1INF α-2b、IL-2、胞壁酰三肽(Liposomal form of muramyl-tripeptide-phosphatidyl ethanolamine,LM-TP-PE)制劑可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫監(jiān)視，放大特異性細(xì)胞毒殺傷作用，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞活力，提高體液免疫與細(xì)胞免疫能力[9]，為穩(wěn)定有效的免疫調(diào)節(jié)劑。L-MTP-PE類免疫治療藥物能夠有效作用于環(huán)孢素，激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡，臨床數(shù)據(jù)表明此類藥物亦能提高患者5年生存率[10]。因此，激活吞噬細(xì)胞活力可用于抗OS治療。

1.2.2免疫檢查點是存在于免疫系統(tǒng)中的一些抑制性信號通路，通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)減少組織損傷，增強(qiáng)自身抗原耐受。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)為T淋巴細(xì)胞表面的一種抑制性因子，與配體特異性結(jié)合，致其信號分子磷酸化，抑制T淋巴細(xì)胞活化。當(dāng)TCR受刺激，CTLA-4與CD28競爭B7，阻斷T細(xì)胞受體信號，提高T細(xì)胞抗腫瘤特性[11]。程序性死亡蛋白1(Programmed death protein-1,PD-1)和CD28同源，表達(dá)于活性T淋巴細(xì)胞表面的另一種抑制性因子，同CTLA-4一樣，PD-1上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。PD-1與配體PD-L1結(jié)合可活化T細(xì)胞效應(yīng)，增強(qiáng)外周免疫。臨床上成功運用CTLA-4、PD-1免疫治療黑色素瘤[12，13]后，開始讓研究者將免疫檢查點的靶向治療應(yīng)用于OS。近來有研究證實PD-L1在OS細(xì)胞中表達(dá)，且PD-1/PD-L1結(jié)合能夠增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性[14]，研究人員在封閉K7M2骨肉瘤小鼠模型上的CTLA-4和PD-1抗原表位后，腫瘤特異性T細(xì)胞活性增強(qiáng)，產(chǎn)生對OS的有效抑制。隨后再次將此OS細(xì)胞接種于該鼠，也能產(chǎn)生持久免疫能力[15]。針對免疫檢查點的阻斷是強(qiáng)化抗腫瘤治療的有效方法之一，更多CTLA-4和PD-1免疫抑制劑正在研發(fā)當(dāng)中。

1.2.3髓源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)來源于骨髓組織，具有強(qiáng)大的免疫抑制作用。OS患者外周血MDSCs含量顯著升高，Guan等人從外周血提取出MDSCs，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、實時定量PCR(Real-time PCR)、免疫印跡實驗(Western blot)和流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry)證實MDSC與IL-18水平呈正相關(guān)。隨后運用抗IL-18治療，發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤加速，同時外周血及腫瘤細(xì)胞MDSCs含量顯著降低，證實MDSCs能在IL-18誘導(dǎo)下遷移入腫瘤實質(zhì)細(xì)胞[16]，抑制OS細(xì)胞生長。MDSCs與IL-18之間的相互作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步實驗闡明，基于MDSCs與IL-18的相關(guān)性研究以及臨床應(yīng)用將成為骨肉瘤免疫治療的有效策略之一。

2 抗OS靶向治療

2.1抗骨肉瘤靶向治療的分類 抗OS靶向治療已不再是一個陌生的名詞，經(jīng)歷數(shù)十年對骨腫瘤發(fā)病機(jī)制的不斷探索，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)若能夠針對OS細(xì)胞不同部位特異性治療，能夠極大提高治療效果，抗OS的靶向治療應(yīng)運而生。抗OS靶向大致可分為三個不同階段：最初級的器官靶向治療、細(xì)胞靶向治療和特異性最強(qiáng)的分子靶向治療。其中分子靶向治療為目前研究熱點，以前兩階段為基礎(chǔ)，通過改變癌變基因，在分子水平阻斷細(xì)胞傳遞通路，其作用靶點可以是某個蛋白質(zhì)分子、某些DNA、RNA片段甚至基因產(chǎn)物。

2.2抗OS靶向治療的最新進(jìn)展

2.2.1核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)存在于骨組織中，與OS生成、存活有關(guān)。Beristain等[17]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠模型上，IgG2單克隆抗體地諾塞麥(Denosumab)能特異性結(jié)合RANKL，抑制OS細(xì)胞遷移和非停泊性生長。此研究成果為抗OS靶向治療提供了重要理論依據(jù)。

2.2.2非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B(Glycoprotein non-metastatic melanoma protein B,GPNMB)能促進(jìn)OS分化，參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程。Roth等[18]獲取67例骨肉瘤臨床標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢查，其中12例源于首診患者，38例來自手術(shù)術(shù)后，17例為復(fù)發(fā)性O(shè)S，大于90%樣本均表達(dá)GPNMB,且GPNMB蛋白水平與新型抗癌藥物共軛物Glembatumumab介導(dǎo)的體外細(xì)胞毒性相關(guān)(r=-0.46,P=0.04)。此研究表明GPNMB通過影響Glembatumumab體內(nèi)外毒性作用可殺傷OS。

2.2.3雙神經(jīng)節(jié)苷脂(Disialoganglioside，GD2)為含有唾液酸一種鞘酯類，有促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的作用。GD2在正常組織中低表達(dá)，而在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)，抗GD2治療可顯著改善高風(fēng)險性神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后。Roth等發(fā)現(xiàn)幾乎所有OS細(xì)胞中均過表達(dá)GD2，繼續(xù)探究GD2對OS的抑制機(jī)制將會成為抗OS治療的研究重點[19]。

2.2.4體內(nèi)熒光蛋白成像技術(shù)是指在特殊激發(fā)光照射下顯影表達(dá)熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞，可觀察腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、分化、凋亡全過程。Kiyuna等[20]運用該技術(shù)，在接種OS的小鼠體內(nèi)植入巢蛋白調(diào)控驅(qū)動綠色熒光蛋白(Nestin regulatory element-driven green fluorescent protein,ND-GFP)蛋白，通過檢測Gelfoam?指標(biāo)來評價腫瘤新生血管情況。該試驗發(fā)現(xiàn)不僅腫瘤新生血管均選擇性表達(dá)GPF，并且證實鼠傷寒沙門氏菌A1-R能抑制Gelfoam?編碼的腫瘤血管生成[20]。體內(nèi)成像技術(shù)能直觀反映腫瘤細(xì)胞與宿主免疫反應(yīng)的相互作用及其生物學(xué)特性，為今后尋找更多抗OS治療的靶點提供了新手段。

2.2.5雷公藤紅素(Celastrol)為強(qiáng)氧化性的純天然產(chǎn)物，能高效抑制蛋白酶活性誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡。γδ T細(xì)胞既能識別癌細(xì)胞抗原，又能殺滅腫瘤干細(xì)胞，但殺傷作用不如自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK)。李朝旭等[21]發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素能通過上調(diào)OS表面死亡受體DR4與DR5，促進(jìn)γδ T細(xì)胞對HOS細(xì)胞的殺傷作用。此研究體現(xiàn)了我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥對治療OS的獨特效果，其不良反應(yīng)少，無骨髓毒性，對抑制腫瘤形成、防止和控制腫瘤轉(zhuǎn)移有較大優(yōu)勢。

3 抗OS免疫靶向治療

3.1抗OS免疫靶向治療概念 靶向治療可單獨發(fā)揮抗腫瘤作用，靶向通路還能參與免疫反應(yīng)中的激活、抑制、分化等過程，如增強(qiáng)DC抗原提呈及提高CTL的啟動?？筄S免疫靶向治療是指運用靶向制劑作用于OS特異性靶點，通過自身免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)或抑制免疫應(yīng)答，殺滅OS細(xì)胞。近年來有關(guān)免疫靶向治療的研究層出不窮，BCR-ABL、EGFR、Her-2等靶點的發(fā)現(xiàn)及其免疫抑制劑的研發(fā)，已成為OS治療重要里程碑，為OS的臨床治療，改善預(yù)后，提高患者治療后生活質(zhì)量提供了新方向。

3.2抗骨肉瘤免疫靶向治療作用機(jī)制及最新研究進(jìn)展

3.2.1增強(qiáng)抗原提呈作用 人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)和上皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)為酪氨酸激酶受體，與腫瘤增殖、侵襲、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管形成密切相關(guān)。Her-2及EGFR與相應(yīng)配體結(jié)合后增強(qiáng)下游信號通路表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞黏附能力，增強(qiáng)抗原提呈作用，強(qiáng)化CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞活性，提高殺傷腫瘤細(xì)胞能力。最新研究顯示，將嵌合人HER2/neu融合蛋白(ADXS31-164)的高度減毒重組李斯特菌疫苗作用于附肢OS狗模型，能高效誘導(dǎo)HER2/neu特異性T細(xì)胞應(yīng)答，降低腫瘤復(fù)發(fā)率及生存率[22]，該研究結(jié)果對小兒OS治療具有重大意義。

3.2.2調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖分化 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin,mTOR)為哺乳動物體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長代謝的激酶，雷帕霉素為mTOR抑制劑，能激活記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞活性，增加效應(yīng)性-記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞分化，產(chǎn)生記憶應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞毒活性[23]。PI3K/mTOR通路為OS特異性靶向通路，阻斷PI3K/mTOR通路能抑制OS增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]，證據(jù)表明，PI3K/mTOR通路抑制劑NVP-BEZ235可誘導(dǎo)OS細(xì)胞自噬，增強(qiáng)順鉑對細(xì)胞抑制效應(yīng)促進(jìn)凋亡[25]。

3.2.3降低腫瘤免疫抑制 腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生免疫抑制，干擾T細(xì)胞抗腫瘤效能。內(nèi)皮血管生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)異常高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，參與腫瘤細(xì)胞血管形成，具有強(qiáng)大的免疫抑制能力，能阻止體內(nèi)最強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞DC識別腫瘤特異性抗原，降低T細(xì)胞殺傷腫瘤能力。貝伐單抗能抑制DC成熟，明顯降低VEGFA活性，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫殺傷活性。貝伐單抗聯(lián)合甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑可有效治療局限性O(shè)S[26]，但會產(chǎn)生頻繁傷口感染，其遠(yuǎn)期療效仍需進(jìn)一步研究。

3.2.4提高腫瘤細(xì)胞對免疫調(diào)節(jié)的靈敏度 腫瘤細(xì)胞抑制MHCⅠ類分子表達(dá)，干擾T細(xì)胞識別及免疫殺傷，并且增加抗凋亡蛋白表達(dá)減弱細(xì)胞毒作用。靶向制劑可干擾上述過程，提高腫瘤細(xì)胞對免疫調(diào)節(jié)的敏感性。PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖以及存活,而PI3K-AKT抑制劑能增強(qiáng)抗腫瘤的免疫殺傷作用。最近研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體β(ERβ)通過PI3K-AKT途徑獲得調(diào)節(jié)OS增殖能力，并且ERβ激動劑能降低PI3K-AKT信號通路表達(dá)，發(fā)揮抗OS作用[27]。尚缺乏大量ERβ參與OS治療相關(guān)的文獻(xiàn)，此研究需進(jìn)一步實驗數(shù)據(jù)支持。

4 總結(jié)與展望

免疫反應(yīng)聯(lián)合靶向治療為OS治療提供了新平臺，隨著對抗腫瘤研究的不斷發(fā)展，越來越多與OS相關(guān)的靶點被發(fā)現(xiàn)，免疫靶向藥物不斷產(chǎn)生，開創(chuàng)了OS治療的新時代，探究免疫治療與靶向治療的協(xié)同作用將成為未來抗OS研究的新方向。mTOR抑制劑能促進(jìn)記憶性T細(xì)胞分化，下調(diào)mTOR，控制腫瘤細(xì)胞的生長和血管生成。Her-2和EGFR與配體結(jié)合，增強(qiáng)抗原提呈作用，增強(qiáng)T細(xì)胞活性。ERβ激動劑阻止PI3K-AKT信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖與存活。貝伐單抗聯(lián)合其他免疫制劑，抑制DC成熟，更強(qiáng)的降低VEGFA活性，效果優(yōu)于單用甲氨蝶呤。一些新方法雖效果顯著，但仍處于試驗階段，并未完全推廣到臨床治療當(dāng)中。少數(shù)患者雖經(jīng)系統(tǒng)治療，遠(yuǎn)期效果并不理想，仍避免不了截肢，OS中晚期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確。所以，免疫靶向治療仍然存在一些亟待解決的問題，如何提高局部給藥濃度，如何降低藥物副作用，如何降低耐藥程度，國內(nèi)外相關(guān)研究較少，尚需進(jìn)一步探究。關(guān)于抗OS免疫靶向治療更深層次研究，將會為臨床治療提供新的解決方案。