嵌合抗原受體T細胞治療胰腺癌的現(xiàn)狀及未來策略

潘澤雁 綜述，湛先保 審校

海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院腫瘤科，上海 200433

胰腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢，由于其復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)及病理學(xué)特征，現(xiàn)有的主流治療方法不盡如人意，晚期胰腺癌的中位生存期為3～5個月，1年生存率＜10%，因此亟待開發(fā)新的有效的治療方法。免疫治療作為繼手術(shù)、放療和化療后的腫瘤治療策略，近年來快速發(fā)展，其中嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞治療血液系統(tǒng)腫瘤效果顯著，因此，人們同樣寄希望于CAR-T細胞療法攻克包括胰腺癌在內(nèi)的實體腫瘤。本文就CAR-T細胞療法在胰腺癌治療中的現(xiàn)狀及未來的發(fā)展方向進行綜述。

1 CAR-T細胞的生物學(xué)特點及在實體瘤治療中的困境

將編碼CAR的外源基因在體外完成設(shè)計和合成，并通過病毒載體等方式轉(zhuǎn)染T細胞，使T細胞穩(wěn)定表達CAR結(jié)構(gòu)，形成CAR-T細胞。CAR-T細胞在體外規(guī)模化擴增后回輸至體內(nèi)，進行抗腫瘤治療的方法即為CAR-T細胞療法。CAR-T細胞得以發(fā)揮抗腫瘤作用的原理在于CAR結(jié)構(gòu)中包含一段細胞外的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA）結(jié)合區(qū)，該結(jié)合區(qū)通過鉸鏈結(jié)構(gòu)、跨膜段與T細胞的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相聯(lián)結(jié)，細胞外段的腫瘤抗原結(jié)合段通常來源于多克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)域的單鏈可變區(qū)（singlechain variable fragment，scFv）段，當(dāng)T細胞遇到腫瘤抗原時，scFv段與腫瘤抗原特異性結(jié)合后可直接激活T細胞并啟動殺傷機制。

CAR-T細胞療法目前已發(fā)展至第四代，其中二代CAR-T細胞治療血液系統(tǒng)腫瘤的成就最引人矚目。然而，CAR-T細胞治療實體瘤困難重重，緣于其具有復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，其內(nèi)部的低氧、酸性代謝產(chǎn)物等均不利于T細胞激活，影響其增殖。腫瘤細胞本身亦在不斷產(chǎn)生抑制性分子，影響T細胞的生存、激活及活化擴增。在腫瘤免疫微環(huán)境中，目前已知的抑制性免疫細胞包括：調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）、髓源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、M2型的腫瘤相關(guān)巨噬細胞等，這些類型的免疫細胞成為CAR-T發(fā)揮治療效應(yīng)的主要障礙。人體免疫系統(tǒng)內(nèi)抑制性免疫細胞同CAR-T細胞間的相互作用及影響尚不清楚，這也將可能成為未來CAR-T細胞治療的研究重點和關(guān)鍵突破點。已有諸多研究表明，清除免疫抑制性細胞有助于CAR-T細胞的抗腫瘤效應(yīng)，Burga等[1］報道清除Gr1+細胞（腫瘤相關(guān)中性粒細胞及MDSC的表面分子標(biāo)志）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的CAR-T細胞可顯著抑制大腸癌的肝轉(zhuǎn)移灶。Treg在正常機體內(nèi)參與維持免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡，防止自體免疫的產(chǎn)生。但在腫瘤患者體內(nèi)，Treg的抑制性作用將會降低T細胞對腫瘤細胞的殺傷力。Perna等[2］研究發(fā)現(xiàn)，使用白細胞介素（interleukin，IL）-2培養(yǎng)的GD2 CAR-T細胞的功效減弱，很可能是IL-2培養(yǎng)的CAR-T細胞會產(chǎn)生較多數(shù)量的Treg，因此抑制了CAR-T細胞的活性和治療作用。而在體外培養(yǎng)過程中，IL-7不能夠使Treg擴增，因此對CAR-T細胞的增殖沒有影響。由此我們得到的啟示是，CAR-T細胞回輸前的體外培養(yǎng)條件，很可能成為決定治療結(jié)果好壞的關(guān)鍵因素之一。

2 CAR-T細胞治療胰腺癌的臨床前研究

目前，已有許多臨床前研究結(jié)果證實了CAR-T細胞療法在胰腺癌模型治療中的有效性，包括在人源性移植瘤模型、人源性腫瘤組織異種移植（patient-derived xenografts，PDX）模型、免疫健全小鼠中的自發(fā)腫瘤模型、同基因移植瘤模型等。許多研究探索的主要目標(biāo)都是為了發(fā)現(xiàn)胰腺癌的腫瘤特異性抗原，最大程度地減少CAR-T細胞治療的脫靶效應(yīng)。目前的研究數(shù)據(jù)已經(jīng)呈現(xiàn)出一些候選抗原的巨大研發(fā)潛力，例如，臨床前研究胰腺癌的TAA間皮素已進入了臨床試驗階段。間皮素是在多種腫瘤包括胰腺癌細胞中高表達的糖蛋白，這種抗原存在于細胞表面。該蛋白在正常組織中的表達僅局限于間皮細胞，包括胸膜細胞、心包、腹膜、輸卵管、氣管、扁桃體和角膜，但表達在這些器官的間皮素蛋白的功能尚不清楚[2-5］。靶向間皮素的CAR-T細胞已廣泛應(yīng)用于臨床前各種惡性腫瘤模型[6-8］的探索，為滿足不同的治療需求，靶向間皮素的CAR-T細胞類型和制備技術(shù)也在不斷開發(fā)和嘗試。Beatty等[9］對胰腺癌的一項研究表明，用電穿孔的方式將編碼間皮素單鏈抗體的mRNA整合至具有CD3z和4-1BB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的T細胞，引起瞬時CAR表達，構(gòu)建成為CAR-T細胞，這種構(gòu)建CAR的方式相比傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染更安全，抗腫瘤治療過程中表現(xiàn)出更強的生物學(xué)活性。

靶向胰腺癌的CAR-T細胞療法在臨床前研究中不斷被嘗試，另一種表現(xiàn)較為突出的是靶向CEA的CAR-T細胞。CEA是進展期胃腸道惡性腫瘤持續(xù)產(chǎn)生的腫瘤抗原，在胰腺癌中陽性率高達70%，因此成為了潛在的治療靶點。同樣在臨床前研究中有潛力的胰腺癌靶點還包括前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、CD24和黏蛋白1（mucin 1，MUC1）[10-13］?；趯δ[瘤抗原復(fù)雜性的考慮，定位靶抗原的思路和方法也在不斷創(chuàng)新。Posey等[14］報道，將腫瘤靶抗原定位于MUC1的一種糖基化變異體，針對這種靶抗原的CAR-T細胞療法在胰腺癌及白血病的小鼠移植瘤模型中被證實有效。這一結(jié)果給我們的啟示是在選擇治療靶點時，從蛋白的結(jié)構(gòu)及修飾的角度去挖掘新抗原可能會有令人欣喜的發(fā)現(xiàn)。

3 CAR-T治療胰腺癌存在的問題及治療現(xiàn)狀

相比血液系統(tǒng)腫瘤，CAR-T細胞治療實體瘤的情況要復(fù)雜許多。首先，實體瘤細胞表面缺乏特異性靶抗原分子，目標(biāo)抗原在腫瘤細胞及正常組織中同時表達則預(yù)示著潛在的“脫靶”不良反應(yīng)；而最大的障礙是免疫抑制作用限制了CAR-T細胞的擴增及歸巢至腫瘤部位，使用環(huán)磷酰胺或氟達拉濱進行淋巴細胞清除是解決T細胞體內(nèi)擴增受限方法，目前最為常用。在CAR-T細胞治療前，會首先采用清除T細胞的方法對機體進行預(yù)處理，CAR-T細胞療法成功與否的關(guān)鍵之一在于T細胞的擴增能力，多數(shù)患者在接受CAR-T細胞療法時已接受了多個周期細胞毒藥物的治療，已經(jīng)造成了記憶性T細胞和天然T細胞的大量損失，胰腺癌患者面臨的也是同樣的狀況。近期已有報道，患者的T細胞質(zhì)量會影響CAR-T細胞療法的成敗，特別是在經(jīng)過多次化療后CD27/CD28表達丟失的淋巴瘤的患者中尤為明顯[15］。由于CAR-T細胞目前還不是治療實體瘤的一線療法，因此，多次化療后機體內(nèi)環(huán)境的變化應(yīng)該作為影響因素，應(yīng)在使用CAR-T細胞治療前予以考慮。

目前胰腺癌的CAR-T細胞治療臨床經(jīng)驗最多的是靶向間皮素。間皮素是現(xiàn)階段胰腺癌治療的主要靶點[2］。最近一項研究關(guān)于靶向間皮素的CAR-T細胞治療6例難治性轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者，采用靜脈輸注CAR-T細胞，每周3次，共3周。在治療期間，未發(fā)生與治療劑量相關(guān)細胞因子風(fēng)暴及神經(jīng)毒性的不良反應(yīng)，其中2例患者病情穩(wěn)定[9］。此外已開展多項靶向CEA的CAR-T細胞臨床試驗，然而隨后的臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，在使用靶向CEA的CAR-T細胞治療時要謹慎衡量，因為有報道顯示，靶向CEA的CAR-T細胞治療后，有患者出現(xiàn)明顯的呼吸系統(tǒng)不良反應(yīng)，可能的原因為肺上皮細胞表達CEA，而CAR-T細胞釋放的細胞因子γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）同時也會上調(diào)細支氣管上皮細胞表達更多的CEA，因此加重不良反應(yīng)[16］。CAR-T細胞“脫靶”最嚴重的報道來自于2010年，一項針對結(jié)直腸癌患者的靶向ERBB2的CAR-T治療臨床事件。在接受了CAR-T細胞的輸注5 d后，患者出現(xiàn)了細胞因子風(fēng)暴及隨之而來的多器官衰竭，患者最終死亡，其原因為正常肺上皮細胞也表達靶抗原并受到了CAR-T細胞的攻擊[17］，因此，尋找腫瘤細胞表面表達的腫瘤特異性抗原是消除CAR-T細胞“脫靶”不良反應(yīng)最重要的方面。此外，為了減少不良反應(yīng)的發(fā)生概率，CAR-T細胞輸注的劑量應(yīng)該謹慎研究選擇。

由于單用CAR-T細胞難以保障實體瘤療效，因此聯(lián)合免疫療法應(yīng)運而生并迅速進入臨床試驗階段。促成這一想法主要是溶細胞性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytolytic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）和程序性死亡[蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）這類免疫檢查點抑制劑的誕生，通過這些抗體的輸注，使原本在體內(nèi)過度活化后耗竭的T細胞得以逆轉(zhuǎn)。這種聯(lián)合療法在血液系統(tǒng)腫瘤治療中已經(jīng)開展應(yīng)用，同時，包括胰腺癌在內(nèi)的實體腫瘤治療的相關(guān)研究已迅速開展[靶向間皮素的CAR-T細胞聯(lián)合PD-1、CTLA-4抗體針對復(fù)發(fā)及難治性非血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床試驗（NCT03182803，NCT03030001）］。同時，諸如CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也同樣引入到CAR-T細胞療法當(dāng)中，通過敲除CAR-T細胞的PD-1防止T細胞耗竭[18］，或利用該技術(shù)制作通用型CAR-T細胞。一些相關(guān)的基因工程策略也在不斷投入到CAR-T細胞研發(fā)中，包括將自殺基因納入以解決CAR-T細胞過度活化擴增后造成的不良反應(yīng)問題。這些技術(shù)的引入及對CAR-T細胞的不斷改進均有望提高CAR-T細胞治療的安全性及有效性。

4 CAR-T細胞治療胰腺癌的未來策略

通過個體化定制CAR-T細胞來克服治療中可能存在的障礙，現(xiàn)有策略包括諸如優(yōu)化結(jié)構(gòu)、克服腫瘤微環(huán)境的抑制作用及實現(xiàn)T細胞持久生存。Guedan等[19］通過研究T細胞內(nèi)部共刺激分子組合如可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）或4-1BB的平衡作用，分別提高持久擴增及殺傷效率。這些數(shù)據(jù)表明，CAR-T細胞可以通過改變內(nèi)部共刺激信號的結(jié)構(gòu)這種“特別定制”的方法突破功能局限性。Sukumaran等[20］令CAR-T細胞能夠同時識別PSCA、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-4，這些細胞通過激活、共刺激及細胞因子的輔助作用能夠更有效地傳遞信號。T細胞通過這些特殊結(jié)構(gòu)“裝配”后在胰腺癌治療中有更強的殺傷腫瘤的功效，同時伴隨著CAR-T細胞的持久擴增及存活。許多聯(lián)合免疫治療的探索如CAR-T細胞聯(lián)合天然免疫激活劑STING[21］、溶瘤病毒[22］，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的腫瘤導(dǎo)向性抗體加強CAR-T細胞的識別及擴增[23］結(jié)果樂觀，為今后的細胞治療提供了發(fā)展方向。此外，一些設(shè)計還包括針對腫瘤基質(zhì)的成纖維細胞[24］或血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，ⅤEGF）[25］的CAR-T細胞。第4代CAR-T細胞設(shè)計為在原有二代CAR-T細胞的基礎(chǔ)上共表達功能性蛋白分子，目的在于充分調(diào)動機體免疫系統(tǒng)與CAR-T細胞協(xié)同殺傷腫瘤，目前研究較多的是CAR-T細胞攜帶IL-12分子，前期的動物實驗中已經(jīng)展示了較為滿意的結(jié)果[26］，然而在臨床應(yīng)用中，這種類型的CAR-T細胞卻產(chǎn)生了令人意想不到的毒性作用[27］。盡管IL-12分子設(shè)計成由活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）啟動子連接CAR-T細胞，使IL-12的分泌呈激活表達的形式，但IL-12的精準劑量控制依然是難題，尚待新技術(shù)的發(fā)展來進一步解決。同樣能夠招募免疫細胞的分子如CD40的配體CD40L，將CD40L共表達于CAR-T細胞的表面[28］，這種類型的CAR-T細胞被證實可以充分激活T細胞，同時可以刺激并招募腫瘤微環(huán)境中的其他免疫細胞如樹突狀細胞等，由此調(diào)動機體自身的免疫力協(xié)同殺滅腫瘤。

5 總結(jié)和展望

無論是在血液系腫瘤還是非血液系腫瘤，目前已有的研究成果給未來的胰腺癌研究提供了治療經(jīng)驗及參考，今后的治療方向依然在于攻克腫瘤微環(huán)境、減少脫靶效應(yīng)、發(fā)現(xiàn)并開發(fā)新靶點及適當(dāng)?shù)淖魟┞?lián)合CAR-T細胞治療，以期實現(xiàn)更好的臨床療效。CAR-T細胞治療胰腺癌才剛起步，在總結(jié)和借鑒其他類型腫瘤治療經(jīng)驗的前提下，不斷研究發(fā)展。

筆者近2年嘗試胰腺癌的CAR-T細胞治療多例，但從患者接受CAR-T細胞治療的臨床實踐經(jīng)驗來看，該方法治療胰腺癌目前技術(shù)上尚處于探索階段，諸多方面仍不成熟，尤其是安全性方面存在巨大隱患。對于臨床和研究經(jīng)驗不足的醫(yī)務(wù)工作者而言，進行胰腺癌的CAR-T細胞治療需格外謹慎，以免損害患者健康，甚至危及患者生命。