調節(jié)性T細胞與非酒精性脂肪性肝?、?/h1>
2019-01-08 17:12:15胡義揚
中國免疫學雜志 2019年11期
金 岳 胡義揚 馮 琴
(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海中醫(yī)臨床重點實驗室，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海201203)
非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指肝細胞脂質過度沉積，不伴有酒精的過量攝入，其疾病譜包括單純非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化、肝硬化以及NAFLD相關肝癌。NAFLD已經成為全世界常見的慢性肝病。美國約有25%的成年人患有脂肪肝，部分患者中超過25%由于血清轉氨酶水平升高和缺乏其他可識別的肝損傷原因而被定義為NASH，這些NASH患者中約有1/4可進展為NASH相關肝纖維化或肝硬化[1]?！岸嘀卮驌魧W說”是目前公認的NAFLD發(fā)病機制。來自于肝內或肝外的損傷因素，導致促炎和抗炎因素失衡，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)、鐵沉積、氧化應激和肝細胞損傷等參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。免疫系統(tǒng)，包括固有免疫和適應性免疫被證實是NASH的又一關鍵發(fā)病機理。肝臟作為重要的免疫器官，內含眾多免疫細胞，包括Kupffer細胞、自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)、樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)、肝竇內皮細胞及調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)，這些細胞介導了肝臟的免疫反應。同時，肝臟也是免疫損傷的靶器官，免疫系統(tǒng)參與肝臟的損傷、修復、纖維化等，這些免疫反應對維持和介導一系列病理過程有重要意義。近年來，Treg細胞被證實在NAFLD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。本文主要將Treg細胞在NAFLD發(fā)病中的作用及相關治療進展進行綜述。
1 調節(jié)性T細胞
Treg屬CD4+T輔助(T helper,Th)細胞的一種亞型，由幼稚的CD4+T細胞在抗原刺激下，被選擇性激活，并在微環(huán)境影響下分化為效應性T細胞，發(fā)揮細胞免疫功能。CD4+T細胞亦可分化為Th1、Th2、Th17等細胞。Treg目前被定義為具有CD4+CD25+表面標志物并表達胞內轉錄因子叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor 3,Foxp3)的CD4+T淋巴細胞的子集，即CD4+CD25+Foxp3+T細胞。研究者于1995年首次發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞的CD25+亞類具有調節(jié)活性；從T細胞接種物中消除CD4+CD25+T細胞可增加移植物抗宿主病和受體菌株中產生的自身免疫疾病的特征。CD4+CD25+T細胞占外周血液CD4+T細胞的5%～10%，它們通過積極抑制自身反應性淋巴細胞而在維持免疫耐受中發(fā)揮重要作用。Treg的發(fā)育由Foxp3控制，屬于Forkhead/Winged-helix轉錄因子家族的新成員，被認為是Treg細胞的特征性標志物，其表達對Treg細胞發(fā)育成熟和發(fā)揮免疫抑制功能均具有重要作用[2]。Tsuda等[3]證明人Foxp3 轉基因小鼠的基因表達完全受限于 CD4+T 細胞中的Treg細胞，且證明T細胞受體(T-cell receptor，TCR)信號是 Foxp3 基因表達的條件之一，轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)存在時，通過TCR刺激在小鼠Treg細胞上觀察到人Foxp3 表達。
Tregs在體內主要發(fā)揮免疫抑制作用[4]。免疫抑制能力表現(xiàn)為對T細胞增殖、分化的抑制，對抗原提呈細胞(Antigen presenting cell,APC)活性的干擾和直接介導靶細胞的死亡。此外，Tregs可通過分泌顆粒酶A和穿孔素溶解T細胞、分泌抑制性細胞因子白介素10(Inteleukin-10，IL-10)和TGF-β、產生腺苷酸等多種機制來發(fā)揮免疫抑制功能。
2 NAFLD疾病過程中Treg的變化
2.1 NAFLD或肥胖患者機體Treg變化 近年來，對于Treg細胞在NAFLD發(fā)病中的變化，不少學者進行了探討。馬巧平等[5]研究表明NAFLD患者外周血CD4+CD25+Foxp3 T細胞百分數(shù)水平低于正常人群，且隨著脂肪肝程度的加重而降低；中、重度脂肪肝CD4+CD25+Foxp3+T細胞百分數(shù)水平低于輕度脂肪肝，提示血清CD4+CD25+Treg下降水平與脂肪肝程度呈正相關。謝中華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者外周血調節(jié)性T細胞的減少與胰島素抵抗指數(shù)呈明顯負相關，這表明調節(jié)性T細胞可能通過調節(jié)胰島素抵抗參與NAFLD的形成和發(fā)展。內臟脂肪組織的Treg可以調節(jié)脂肪組織的炎癥，使機體免受肥胖相關的代謝綜合征(如NAFLD、2型糖尿病)的影響，研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者內臟脂肪組織Treg下降，可能是肥胖患者易發(fā)生代謝紊亂的原因。Rau等[7]對112例肥胖相關的NAFLD患者進行臨床觀察發(fā)現(xiàn)NAFLD患者外周血和肝活檢組織中Treg(CD4+CD45RA+CD25++)細胞均有不同程度的下降；但減肥手術之后Treg(CD4+CD45RA+CD25++)含量增加。然而，另一項針對不同肝臟疾病(NAFLD、自身免疫性肝炎)的研究中發(fā)現(xiàn)，NAFLD肝臟組織的Foxp3的表達增加，局部Treg的累積與凋亡介質的表達及肝臟的炎癥相關[8]；并且肝臟組織學評分超過4分的患者與非NASH患者相比的Foxp3陽性細胞增加，即肝組織的炎癥程度與Foxp3的表達呈正相關[9]?，F(xiàn)在部分研究結果出現(xiàn)矛盾，需要進一步深入研究證實。
2.2 NAFLD動物模型中Treg變化 一些學者在不同的動物模型中探討了Treg細胞在NAFLD中的變化情況。Ma等[10]研究表明，高脂飲食的小鼠在喂養(yǎng)到第八周時其肝臟的Treg細胞含量下降一半，而脾臟的Treg細胞沒有變化，可見高脂飲食誘導的Treg細胞消耗可能是肝臟特異性的；該研究同樣觀察到在NASH小鼠體內，氧化應激可引起Treg細胞凋亡，肝內Treg數(shù)量逐漸減少，對炎性反應的抑制性降低，而抗氧化治療可以減少Treg凋亡增加肝內Treg數(shù)量，減少脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的肝臟損傷。尾靜脈注射磁珠分離純化的同種系Treg細胞至小鼠體內時，同樣可以改善LPS誘導的肝臟組織學損傷，降低血清谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平，推測Treg細胞可能通過抗氧化阻斷NAFLD的進展[10]。此外，Treg還可以通過誘導巨噬細胞分化為抗炎的M2型巨噬細胞，分泌抗炎因子IL-10，使肝組織對胰島素的敏感性增強，減輕胰島素抵抗水平，改善NASH[11]。
初始T細胞在TGF-β和IL-6的共同誘導下分化為Th17細胞，而在TGF-β單獨誘導下分化為Treg細胞。Treg細胞具有抗炎作用，Th17細胞發(fā)揮促炎作用，Th17細胞與Treg細胞在功能和分化過程中相互對抗，在正常情況下兩者保持平衡，有利于機體免疫穩(wěn)定狀態(tài)的維持，若兩者失衡就會產生一系列免疫病理反應。高脂飲食36周誘導的NASH小鼠研究結果顯示模型小鼠肝臟和腹部脂肪Treg含量下降，Th17含量增加[12]。另外一項NAFLD相關肝癌研究發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟Treg比例雖未發(fā)生明顯改變但是絕對數(shù)量有所下降[13]，提示Treg可能參與NAFLD相關肝癌的發(fā)生發(fā)展。
從現(xiàn)有報道來看，除個別研究外，大多研究提示Treg在NAFLD患者體內或動物體內是下降的，并與NAFLD進展中的胰島素抵抗和炎性反應相關。但目前研究主要局限在觀察外周血、脂肪組織或肝臟單器官Treg的變化情況，缺乏對機體內肝臟、外周血、脂肪組織、腸道等多組織系統(tǒng)觀察以及內在機制的探討。
3 NAFLD發(fā)病過程中影響Treg的因素
NAFLD的發(fā)生與糖脂代謝異常、脂肪組織堆積、腸道菌群紊亂、炎癥因子釋放紊亂等密切相關。相關病理因素促進NAFLD發(fā)生發(fā)展同時，影響機體Treg的分化發(fā)育及功能發(fā)揮，同時Treg的異常又可能反過來進一步促進NAFLD相關代謝紊亂或免疫損傷。
3.1 共刺激分子B7和共刺激分子CD40 共刺激分子B7屬于免疫球蛋白超家族，其配體為CD28，CD28/B7是激活T細胞的關鍵共刺激分子，可以誘導幼稚T細胞向Treg細胞分化。B7敲除小鼠進行高脂飲食誘導肥胖，其小鼠肝臟Treg大量下降，同時皮下脂肪組織和附睪脂肪組織的Treg下降，肝臟和脂肪組織的炎癥因子水平增加，胰島素信號異常，炎性反應加劇[14]。 CD28缺陷小鼠的內臟脂肪組織和肝臟的Treg數(shù)量減少，但其肝臟脂質沉積和炎癥減少[15]。
CD40L為共刺激分子CD40的配體，CD40/CD40L是T細胞另外一對共刺激分子。CD40缺陷可增加內臟脂肪組織Treg含量，惡化內臟脂肪組織的炎癥和胰島素抵抗，加速肝臟的脂肪變性[16]。但CD40L敲除的高脂飲食誘導的肥胖小鼠，附睪脂肪組織和脾臟Treg細胞增加，同時肝臟脂肪變性、氣球球樣變和小葉炎癥減輕[17]。
3.2 肝細胞乙酰輔酶A羧化酶1(Acetly CoA carboxylase 1，ACC1) ACC是脂肪從頭合成過程中的限速酶，NAFLD患者體內肝臟脂肪新生明顯增多，ACC活性顯著升高。脂肪酸是合成內源性甘油三酯(Triglyceride，TG)的主要原料，在脂質代謝過程中起重要的作用。研究證實抑制ACC1可使初始T細胞更多地向Treg細胞分化，而在脂肪酸合成功能正常的情況下則更多地向Th17細胞亞群分化，促進炎性反應[18]。
3.3 雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamy-cin,mTOR) 哺乳動物mTOR是介導脂質堆積的關鍵環(huán)節(jié)之一，與細胞的生長和代謝密切相關，其表達上調會使熱量攝入增加，胰島素敏感性下降，加速機體脂肪的合成和能量蓄積。mTOR信號通路對Treg有著重要的調控作用，mTOR缺陷或特異性敲除mTOR的小鼠CD4+T細胞趨向分化為Treg，而不能發(fā)育為效應性T細胞[19]。當機體處于高糖狀態(tài)時，細胞分泌TGF-β因子激活mTOR信號通路，導致Foxp3的低表達，影響Treg的分化、增殖和抑制功能。然而，缺氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可通過mTOR通路靶向降解Foxp3蛋白酶體，抑制Treg生成而促進Th17分化，從而調節(jié)糖酵解信號通路和轉錄系統(tǒng)[20]。
3.4 瘦素 瘦素是一種主要由脂肪組織分泌的激素，參與糖、脂肪及能量代謝的調節(jié)，促進機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，進而使體重減輕。機體瘦素抵抗可以改變肝細胞的胰島素信號，增加肝細胞內脂肪含量，引起肝臟脂肪變性。正常小鼠Treg細胞多聚集在內臟脂肪組織，肥胖小鼠中瘦素水平較高，且Treg數(shù)量明顯少于正常小鼠[21]。De Rosa等[22]發(fā)現(xiàn)Treg細胞高表達瘦素和瘦素受體，瘦素可影響Treg細胞的增殖及免疫抑制功能。在瘦素缺陷(ob/ob)或瘦素受體缺陷(db/db)小鼠模型可以觀察到外周血Treg細胞數(shù)量、比例以及免疫抑制功能顯著提高；外源性補充瘦素后，Treg細胞的數(shù)量及比例則出現(xiàn)下降。
3.5 過氧物酶體增殖體激活受體-γ(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ) PPAR-γ是脂肪細胞分化誘導和控制多種脂肪細胞因子基因表達的一個關鍵轉錄因子，它不僅是脂肪細胞分化的主要調節(jié)因子，而且是胰島素增敏劑，提高細胞內胰島素受體底物活性而增加胰島素敏感性，并且對內臟脂肪組織Treg細胞的聚集、表型和功能發(fā)揮重要的調控作用。PPAR-γ特異性地敲除，使Treg在脂肪組織的表達大量減少，PPAR-γ的激動劑(如吡格列酮、噻唑烷二酮)可以增加高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織Treg細胞的數(shù)量，減少脂肪組織的炎癥，改善肥胖相關的代謝紊亂[23]。
3.6 腸道菌群及其代謝產物 研究表明腸道菌群與NAFLD發(fā)病密切相關，近年來，腸道菌的發(fā)酵產物短鏈脂肪酸(Short chain acids，SCFA)被發(fā)現(xiàn)在多方面影響機體的免疫功能。SCFA是細菌發(fā)酵食物纖維的主要代謝產物，在腸道中濃度很高，腸腔內的SCFA能夠進入黏膜固有層，與結腸黏膜固有層內Treg的G蛋白耦聯(lián)受體結合，促進Treg功能[24]，亦可促進腸上皮細胞分泌TGF-β，刺激Treg分化。SCFA中的丁酸鹽則通過抑制組蛋白去乙?；?，增強了Foxp3位點中Lys27的組蛋白乙?；饔?，由此增加Foxp3蛋白的轉錄并穩(wěn)定表達，以此維持Treg免疫調節(jié)能力[25]。Arpaia等[25]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導的NASH小鼠中，肝內和腸道Foxp3明顯下降，但丁酸梭菌干預后，腸內和肝臟Treg含量增加，相關的炎癥因子下降，肝臟組織學改善。
3.7 IL-21和IL-2 IL-21可由Th1、Th17、活化的NKT細胞和T濾泡輔助細胞分泌，其在誘導和維持免疫介導的慢性炎癥過程中發(fā)揮重要作用，并負調節(jié)Treg分化和活性。IL-21敲除的高脂飲食肥胖小鼠，其附睪脂肪組織的Treg水平明顯升高，肝臟組織大泡性脂肪變性改善，促炎的巨噬細胞減少，同時胰島素水平改善，脂肪組織抗炎的巨噬細胞M2(Mgl2,YM1)增加[27]。Treg細胞高表達高親和力IL-2受體，可以通過競爭性地消耗IL-2而抑制效應性T細胞的增殖和分化[28]。腹腔注射人重組細胞因子IL-2可增加肥胖小鼠體內Treg數(shù)量，減輕胰島素抵抗。
總體來看，除了T細胞的共刺激分子如B7、CD40等的直接激活作用外，參與NAFLD發(fā)病的重要轉錄因子、細胞因子如PPAR-γ、瘦素等亦是調節(jié)Treg增殖、分化的重要影響因素；另外，Th17細胞、巨噬細胞等肝臟中其他的免疫細胞亦通過特定細胞因子與Treg相互制約或相互激活?？傊喾N因素參與NAFLD進展中Treg的分化、發(fā)育，Treg的發(fā)育異常又反過來影響NAFLD的進展，兩者互為因果、關系密切。了解NAFLD進展中各種因素對Treg細胞的作用，可為NAFLD的治療提供新視角。
4 與調節(jié)Treg相關的NAFLD治療
雖然目前研究對于NAFLD病理生理、診斷和自然史已經取得了一些進展，但尚無FDA批準的藥物應用于治療NAFLD。減重是一個難以實現(xiàn)和維持的任務，因此藥物治療相當重要。目前沒有NAFLD的靶向Treg治療藥物，但是部分研究表明相關的抗體類或蛋白類藥物(如CD3單克隆抗體、抗TNF融合蛋白、抗LPS抗體)可以通過調節(jié)Treg來發(fā)揮對NAFLD的保護作用。
CD3分子是T細胞膜上的重要分化抗原，是成熟T細胞的特征性標志；利用抗CD3單克隆抗體可激發(fā)或阻斷T細胞活化信號轉導，清除效應T細胞或誘導調節(jié)T細胞的產生。雖然CD3單克隆抗體主要用于器官移植或自身免疫性疾病的治療，但是也有部分研究探討了CD3單克隆抗體對NASH或糖尿病的治療，并且取得了不錯的效果。在ob/ob小鼠模型中，給予小鼠抗CD3單克隆抗體，可以改善肝臟脂肪堆積、降低胰腺增生和肌肉炎癥；降低血清ALT、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性，以及膽固醇和TG水平；這些效應與促進Treg產生以及IL-10、TGF-β水平的增加相關[29]。相關的臨床研究證實口服CD3單克隆抗體能夠誘導Treg細胞的產生，抑制NASH患者的炎癥狀態(tài)，改善NASH臨床指標[30]。在健康志愿者的Ⅰ期臨床試驗中，口服給予抗CD3單克隆抗體，劑量范圍為每日0.2至5.0 mg，其外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)量增加，Th1/Th17和IFN-γ應答受到抑制[31]；在NASH的Ⅱ期臨床研究中，口服不同劑量的抗CD3制劑，可促進外周Treg細胞產生，改善胰島素抵抗，并且血漿葡萄糖和肝酶的降低具有劑量依賴性[32]。這些數(shù)據均支持口服抗CD3單克隆抗體可誘導免疫抑制，增加外周血中CD4+CD25+調節(jié)性細胞從而減輕與NASH相關的肝損傷。
PRX-106不可吸收，為可溶性人TNF受體(TNFR)組成的重組抗TNF融合蛋白。在體外，TNFR與TNF-α結合，抑制其與細胞TNFR的結合，從而阻斷其下游效應。NASH小鼠灌胃PRX-106 22周，觀察到小鼠肝臟TG含量降低，同時血清TG，AST、葡萄糖水平改善，脾臟和肝內Treg淋巴細胞比例增加[33]。在Ⅰ/ⅡA期臨床試驗中，健康志愿者連續(xù)14 d口服3種不同劑量(2，8或16 mg/d)的PRX-106，其在8 mg處理組的外周血中Treg顯著增加[34]。
Imm124E是抗LPS抗體。口服不可吸收的Im124E免疫制劑通過改善免疫進而緩解NASH。在NASH和糖尿病的ob/ob小鼠模型中，口服Imm124E降低血清ALT活性、肝臟TG含量，改善葡萄糖耐量，這些作用與增加的脾臟Treg細胞，減少的血清TNF-α水平相關[35]。在一項開放標簽的臨床試驗中，經活檢證實為NASH和2型糖尿病患者口服給予Imm124E 30 d，其外周血中Treg升高，胰島素抵抗減輕、血清TG、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和肝酶水平降低，胰升血糖素樣肽-1和脂聯(lián)素水平升高[36]。Imm124E免疫制劑用于治療NASH患者的全球性的大型雙盲、加倍劑量、隨機、安慰劑對照試驗正在進行(Clinical Trial Gov.NCT02 316717)。
5 總結與展望
近些年，隨著對免疫及代謝認識的不斷深入，“免疫代謝”的概念被提出并成為關注熱點。天然或獲得性免疫系統(tǒng)參與了既往所認為的非免疫性疾病，如肥胖，產生代謝與免疫方面的異常。NAFLD是肥胖相關的代謝性疾病，肝臟以及全身的免疫異常被發(fā)現(xiàn)是單純脂肪肝向NASH和肝纖維化進展的重要參與因素。T細胞是特異性免疫中細胞免疫的執(zhí)行細胞，其中Treg細胞主要發(fā)揮免疫抑制及免疫耐受功能。本文立足于Treg細胞，對NAFLD疾病過程中Treg的變化、影響Treg分化發(fā)育的因素以及目前報道與調節(jié)Treg相關的治療等進行了綜述。
從現(xiàn)有報道來看，大多研究提示作為一種具有抑制炎癥功能的免疫細胞，Treg在NAFLD患者及模型動物體內是下降的，但亦有相反的報道，有待更多研究去探索或證實。
幾項涉及以Treg細胞為間接靶點進行的臨床及基礎研究證實相關藥物可以通過影響Treg改善NAFLD的胰島素抵抗以及炎癥狀態(tài)，肯定了以Treg為靶點的相關免疫治療在NAFLD中的可行性及有效性。這不僅能為免疫系統(tǒng)與NAFLD的交互作用提供新的理解，也為NAFLD的治療提供新思路。
除Treg外，肝臟中定居著庫普弗細胞、NK、NKT等非特異性免疫細胞及B細胞、Th1、Th2、Th17等其他效應性淋巴細胞，構成了NAFLD復雜的免疫微環(huán)境。Treg被認為可能是阻斷單純性脂肪肝轉變?yōu)橹拘愿窝椎淖詈笠坏馈胺谰€”，其與其他免疫細胞協(xié)同產生的免疫應答加速或放大了損傷，但同時也參與了NASH炎癥及纖維化的緩解。NASH為疾病進展的中間階段，全局把握NASH的免疫病理，免疫與炎癥、胰島素抵抗等的關系以及不同免疫細胞在NASH的作用、角色及相互關系是治療NAFLD的關鍵所在。
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Tregs在體內主要發(fā)揮免疫抑制作用[4]。免疫抑制能力表現(xiàn)為對T細胞增殖、分化的抑制，對抗原提呈細胞(Antigen presenting cell,APC)活性的干擾和直接介導靶細胞的死亡。此外，Tregs可通過分泌顆粒酶A和穿孔素溶解T細胞、分泌抑制性細胞因子白介素10(Inteleukin-10，IL-10)和TGF-β、產生腺苷酸等多種機制來發(fā)揮免疫抑制功能。
2 NAFLD疾病過程中Treg的變化
2.1 NAFLD或肥胖患者機體Treg變化 近年來，對于Treg細胞在NAFLD發(fā)病中的變化，不少學者進行了探討。馬巧平等[5]研究表明NAFLD患者外周血CD4+CD25+Foxp3 T細胞百分數(shù)水平低于正常人群，且隨著脂肪肝程度的加重而降低；中、重度脂肪肝CD4+CD25+Foxp3+T細胞百分數(shù)水平低于輕度脂肪肝，提示血清CD4+CD25+Treg下降水平與脂肪肝程度呈正相關。謝中華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者外周血調節(jié)性T細胞的減少與胰島素抵抗指數(shù)呈明顯負相關，這表明調節(jié)性T細胞可能通過調節(jié)胰島素抵抗參與NAFLD的形成和發(fā)展。內臟脂肪組織的Treg可以調節(jié)脂肪組織的炎癥，使機體免受肥胖相關的代謝綜合征(如NAFLD、2型糖尿病)的影響，研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者內臟脂肪組織Treg下降，可能是肥胖患者易發(fā)生代謝紊亂的原因。Rau等[7]對112例肥胖相關的NAFLD患者進行臨床觀察發(fā)現(xiàn)NAFLD患者外周血和肝活檢組織中Treg(CD4+CD45RA+CD25++)細胞均有不同程度的下降；但減肥手術之后Treg(CD4+CD45RA+CD25++)含量增加。然而，另一項針對不同肝臟疾病(NAFLD、自身免疫性肝炎)的研究中發(fā)現(xiàn)，NAFLD肝臟組織的Foxp3的表達增加，局部Treg的累積與凋亡介質的表達及肝臟的炎癥相關[8]；并且肝臟組織學評分超過4分的患者與非NASH患者相比的Foxp3陽性細胞增加，即肝組織的炎癥程度與Foxp3的表達呈正相關[9]?，F(xiàn)在部分研究結果出現(xiàn)矛盾，需要進一步深入研究證實。
2.2 NAFLD動物模型中Treg變化 一些學者在不同的動物模型中探討了Treg細胞在NAFLD中的變化情況。Ma等[10]研究表明，高脂飲食的小鼠在喂養(yǎng)到第八周時其肝臟的Treg細胞含量下降一半，而脾臟的Treg細胞沒有變化，可見高脂飲食誘導的Treg細胞消耗可能是肝臟特異性的；該研究同樣觀察到在NASH小鼠體內，氧化應激可引起Treg細胞凋亡，肝內Treg數(shù)量逐漸減少，對炎性反應的抑制性降低，而抗氧化治療可以減少Treg凋亡增加肝內Treg數(shù)量，減少脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的肝臟損傷。尾靜脈注射磁珠分離純化的同種系Treg細胞至小鼠體內時，同樣可以改善LPS誘導的肝臟組織學損傷，降低血清谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平，推測Treg細胞可能通過抗氧化阻斷NAFLD的進展[10]。此外，Treg還可以通過誘導巨噬細胞分化為抗炎的M2型巨噬細胞，分泌抗炎因子IL-10，使肝組織對胰島素的敏感性增強，減輕胰島素抵抗水平，改善NASH[11]。
初始T細胞在TGF-β和IL-6的共同誘導下分化為Th17細胞，而在TGF-β單獨誘導下分化為Treg細胞。Treg細胞具有抗炎作用，Th17細胞發(fā)揮促炎作用，Th17細胞與Treg細胞在功能和分化過程中相互對抗，在正常情況下兩者保持平衡，有利于機體免疫穩(wěn)定狀態(tài)的維持，若兩者失衡就會產生一系列免疫病理反應。高脂飲食36周誘導的NASH小鼠研究結果顯示模型小鼠肝臟和腹部脂肪Treg含量下降，Th17含量增加[12]。另外一項NAFLD相關肝癌研究發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟Treg比例雖未發(fā)生明顯改變但是絕對數(shù)量有所下降[13]，提示Treg可能參與NAFLD相關肝癌的發(fā)生發(fā)展。
從現(xiàn)有報道來看，除個別研究外，大多研究提示Treg在NAFLD患者體內或動物體內是下降的，并與NAFLD進展中的胰島素抵抗和炎性反應相關。但目前研究主要局限在觀察外周血、脂肪組織或肝臟單器官Treg的變化情況，缺乏對機體內肝臟、外周血、脂肪組織、腸道等多組織系統(tǒng)觀察以及內在機制的探討。
3 NAFLD發(fā)病過程中影響Treg的因素
NAFLD的發(fā)生與糖脂代謝異常、脂肪組織堆積、腸道菌群紊亂、炎癥因子釋放紊亂等密切相關。相關病理因素促進NAFLD發(fā)生發(fā)展同時，影響機體Treg的分化發(fā)育及功能發(fā)揮，同時Treg的異常又可能反過來進一步促進NAFLD相關代謝紊亂或免疫損傷。
3.1 共刺激分子B7和共刺激分子CD40 共刺激分子B7屬于免疫球蛋白超家族，其配體為CD28，CD28/B7是激活T細胞的關鍵共刺激分子，可以誘導幼稚T細胞向Treg細胞分化。B7敲除小鼠進行高脂飲食誘導肥胖，其小鼠肝臟Treg大量下降，同時皮下脂肪組織和附睪脂肪組織的Treg下降，肝臟和脂肪組織的炎癥因子水平增加，胰島素信號異常，炎性反應加劇[14]。 CD28缺陷小鼠的內臟脂肪組織和肝臟的Treg數(shù)量減少，但其肝臟脂質沉積和炎癥減少[15]。
CD40L為共刺激分子CD40的配體，CD40/CD40L是T細胞另外一對共刺激分子。CD40缺陷可增加內臟脂肪組織Treg含量，惡化內臟脂肪組織的炎癥和胰島素抵抗，加速肝臟的脂肪變性[16]。但CD40L敲除的高脂飲食誘導的肥胖小鼠，附睪脂肪組織和脾臟Treg細胞增加，同時肝臟脂肪變性、氣球球樣變和小葉炎癥減輕[17]。
3.2 肝細胞乙酰輔酶A羧化酶1(Acetly CoA carboxylase 1，ACC1) ACC是脂肪從頭合成過程中的限速酶，NAFLD患者體內肝臟脂肪新生明顯增多，ACC活性顯著升高。脂肪酸是合成內源性甘油三酯(Triglyceride，TG)的主要原料，在脂質代謝過程中起重要的作用。研究證實抑制ACC1可使初始T細胞更多地向Treg細胞分化，而在脂肪酸合成功能正常的情況下則更多地向Th17細胞亞群分化，促進炎性反應[18]。
3.3 雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamy-cin,mTOR) 哺乳動物mTOR是介導脂質堆積的關鍵環(huán)節(jié)之一，與細胞的生長和代謝密切相關，其表達上調會使熱量攝入增加，胰島素敏感性下降，加速機體脂肪的合成和能量蓄積。mTOR信號通路對Treg有著重要的調控作用，mTOR缺陷或特異性敲除mTOR的小鼠CD4+T細胞趨向分化為Treg，而不能發(fā)育為效應性T細胞[19]。當機體處于高糖狀態(tài)時，細胞分泌TGF-β因子激活mTOR信號通路，導致Foxp3的低表達，影響Treg的分化、增殖和抑制功能。然而，缺氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可通過mTOR通路靶向降解Foxp3蛋白酶體，抑制Treg生成而促進Th17分化，從而調節(jié)糖酵解信號通路和轉錄系統(tǒng)[20]。
3.4 瘦素 瘦素是一種主要由脂肪組織分泌的激素，參與糖、脂肪及能量代謝的調節(jié)，促進機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，進而使體重減輕。機體瘦素抵抗可以改變肝細胞的胰島素信號，增加肝細胞內脂肪含量，引起肝臟脂肪變性。正常小鼠Treg細胞多聚集在內臟脂肪組織，肥胖小鼠中瘦素水平較高，且Treg數(shù)量明顯少于正常小鼠[21]。De Rosa等[22]發(fā)現(xiàn)Treg細胞高表達瘦素和瘦素受體，瘦素可影響Treg細胞的增殖及免疫抑制功能。在瘦素缺陷(ob/ob)或瘦素受體缺陷(db/db)小鼠模型可以觀察到外周血Treg細胞數(shù)量、比例以及免疫抑制功能顯著提高；外源性補充瘦素后，Treg細胞的數(shù)量及比例則出現(xiàn)下降。
3.5 過氧物酶體增殖體激活受體-γ(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ) PPAR-γ是脂肪細胞分化誘導和控制多種脂肪細胞因子基因表達的一個關鍵轉錄因子，它不僅是脂肪細胞分化的主要調節(jié)因子，而且是胰島素增敏劑，提高細胞內胰島素受體底物活性而增加胰島素敏感性，并且對內臟脂肪組織Treg細胞的聚集、表型和功能發(fā)揮重要的調控作用。PPAR-γ特異性地敲除，使Treg在脂肪組織的表達大量減少，PPAR-γ的激動劑(如吡格列酮、噻唑烷二酮)可以增加高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織Treg細胞的數(shù)量，減少脂肪組織的炎癥，改善肥胖相關的代謝紊亂[23]。
3.6 腸道菌群及其代謝產物 研究表明腸道菌群與NAFLD發(fā)病密切相關，近年來，腸道菌的發(fā)酵產物短鏈脂肪酸(Short chain acids，SCFA)被發(fā)現(xiàn)在多方面影響機體的免疫功能。SCFA是細菌發(fā)酵食物纖維的主要代謝產物，在腸道中濃度很高，腸腔內的SCFA能夠進入黏膜固有層，與結腸黏膜固有層內Treg的G蛋白耦聯(lián)受體結合，促進Treg功能[24]，亦可促進腸上皮細胞分泌TGF-β，刺激Treg分化。SCFA中的丁酸鹽則通過抑制組蛋白去乙?；?，增強了Foxp3位點中Lys27的組蛋白乙?；饔?，由此增加Foxp3蛋白的轉錄并穩(wěn)定表達，以此維持Treg免疫調節(jié)能力[25]。Arpaia等[25]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食誘導的NASH小鼠中，肝內和腸道Foxp3明顯下降，但丁酸梭菌干預后，腸內和肝臟Treg含量增加，相關的炎癥因子下降，肝臟組織學改善。
3.7 IL-21和IL-2 IL-21可由Th1、Th17、活化的NKT細胞和T濾泡輔助細胞分泌，其在誘導和維持免疫介導的慢性炎癥過程中發(fā)揮重要作用，并負調節(jié)Treg分化和活性。IL-21敲除的高脂飲食肥胖小鼠，其附睪脂肪組織的Treg水平明顯升高，肝臟組織大泡性脂肪變性改善，促炎的巨噬細胞減少，同時胰島素水平改善，脂肪組織抗炎的巨噬細胞M2(Mgl2,YM1)增加[27]。Treg細胞高表達高親和力IL-2受體，可以通過競爭性地消耗IL-2而抑制效應性T細胞的增殖和分化[28]。腹腔注射人重組細胞因子IL-2可增加肥胖小鼠體內Treg數(shù)量，減輕胰島素抵抗。
總體來看，除了T細胞的共刺激分子如B7、CD40等的直接激活作用外，參與NAFLD發(fā)病的重要轉錄因子、細胞因子如PPAR-γ、瘦素等亦是調節(jié)Treg增殖、分化的重要影響因素；另外，Th17細胞、巨噬細胞等肝臟中其他的免疫細胞亦通過特定細胞因子與Treg相互制約或相互激活?？傊喾N因素參與NAFLD進展中Treg的分化、發(fā)育，Treg的發(fā)育異常又反過來影響NAFLD的進展，兩者互為因果、關系密切。了解NAFLD進展中各種因素對Treg細胞的作用，可為NAFLD的治療提供新視角。
4 與調節(jié)Treg相關的NAFLD治療
雖然目前研究對于NAFLD病理生理、診斷和自然史已經取得了一些進展，但尚無FDA批準的藥物應用于治療NAFLD。減重是一個難以實現(xiàn)和維持的任務，因此藥物治療相當重要。目前沒有NAFLD的靶向Treg治療藥物，但是部分研究表明相關的抗體類或蛋白類藥物(如CD3單克隆抗體、抗TNF融合蛋白、抗LPS抗體)可以通過調節(jié)Treg來發(fā)揮對NAFLD的保護作用。
CD3分子是T細胞膜上的重要分化抗原，是成熟T細胞的特征性標志；利用抗CD3單克隆抗體可激發(fā)或阻斷T細胞活化信號轉導，清除效應T細胞或誘導調節(jié)T細胞的產生。雖然CD3單克隆抗體主要用于器官移植或自身免疫性疾病的治療，但是也有部分研究探討了CD3單克隆抗體對NASH或糖尿病的治療，并且取得了不錯的效果。在ob/ob小鼠模型中，給予小鼠抗CD3單克隆抗體，可以改善肝臟脂肪堆積、降低胰腺增生和肌肉炎癥；降低血清ALT、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性，以及膽固醇和TG水平；這些效應與促進Treg產生以及IL-10、TGF-β水平的增加相關[29]。相關的臨床研究證實口服CD3單克隆抗體能夠誘導Treg細胞的產生，抑制NASH患者的炎癥狀態(tài)，改善NASH臨床指標[30]。在健康志愿者的Ⅰ期臨床試驗中，口服給予抗CD3單克隆抗體，劑量范圍為每日0.2至5.0 mg，其外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數(shù)量增加，Th1/Th17和IFN-γ應答受到抑制[31]；在NASH的Ⅱ期臨床研究中，口服不同劑量的抗CD3制劑，可促進外周Treg細胞產生，改善胰島素抵抗，并且血漿葡萄糖和肝酶的降低具有劑量依賴性[32]。這些數(shù)據均支持口服抗CD3單克隆抗體可誘導免疫抑制，增加外周血中CD4+CD25+調節(jié)性細胞從而減輕與NASH相關的肝損傷。
PRX-106不可吸收，為可溶性人TNF受體(TNFR)組成的重組抗TNF融合蛋白。在體外，TNFR與TNF-α結合，抑制其與細胞TNFR的結合，從而阻斷其下游效應。NASH小鼠灌胃PRX-106 22周，觀察到小鼠肝臟TG含量降低，同時血清TG，AST、葡萄糖水平改善，脾臟和肝內Treg淋巴細胞比例增加[33]。在Ⅰ/ⅡA期臨床試驗中，健康志愿者連續(xù)14 d口服3種不同劑量(2，8或16 mg/d)的PRX-106，其在8 mg處理組的外周血中Treg顯著增加[34]。
Imm124E是抗LPS抗體。口服不可吸收的Im124E免疫制劑通過改善免疫進而緩解NASH。在NASH和糖尿病的ob/ob小鼠模型中，口服Imm124E降低血清ALT活性、肝臟TG含量，改善葡萄糖耐量，這些作用與增加的脾臟Treg細胞，減少的血清TNF-α水平相關[35]。在一項開放標簽的臨床試驗中，經活檢證實為NASH和2型糖尿病患者口服給予Imm124E 30 d，其外周血中Treg升高，胰島素抵抗減輕、血清TG、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和肝酶水平降低，胰升血糖素樣肽-1和脂聯(lián)素水平升高[36]。Imm124E免疫制劑用于治療NASH患者的全球性的大型雙盲、加倍劑量、隨機、安慰劑對照試驗正在進行(Clinical Trial Gov.NCT02 316717)。
5 總結與展望
近些年，隨著對免疫及代謝認識的不斷深入，“免疫代謝”的概念被提出并成為關注熱點。天然或獲得性免疫系統(tǒng)參與了既往所認為的非免疫性疾病，如肥胖，產生代謝與免疫方面的異常。NAFLD是肥胖相關的代謝性疾病，肝臟以及全身的免疫異常被發(fā)現(xiàn)是單純脂肪肝向NASH和肝纖維化進展的重要參與因素。T細胞是特異性免疫中細胞免疫的執(zhí)行細胞，其中Treg細胞主要發(fā)揮免疫抑制及免疫耐受功能。本文立足于Treg細胞，對NAFLD疾病過程中Treg的變化、影響Treg分化發(fā)育的因素以及目前報道與調節(jié)Treg相關的治療等進行了綜述。
從現(xiàn)有報道來看，大多研究提示作為一種具有抑制炎癥功能的免疫細胞，Treg在NAFLD患者及模型動物體內是下降的，但亦有相反的報道，有待更多研究去探索或證實。
幾項涉及以Treg細胞為間接靶點進行的臨床及基礎研究證實相關藥物可以通過影響Treg改善NAFLD的胰島素抵抗以及炎癥狀態(tài)，肯定了以Treg為靶點的相關免疫治療在NAFLD中的可行性及有效性。這不僅能為免疫系統(tǒng)與NAFLD的交互作用提供新的理解，也為NAFLD的治療提供新思路。
除Treg外，肝臟中定居著庫普弗細胞、NK、NKT等非特異性免疫細胞及B細胞、Th1、Th2、Th17等其他效應性淋巴細胞，構成了NAFLD復雜的免疫微環(huán)境。Treg被認為可能是阻斷單純性脂肪肝轉變?yōu)橹拘愿窝椎淖詈笠坏馈胺谰€”，其與其他免疫細胞協(xié)同產生的免疫應答加速或放大了損傷，但同時也參與了NASH炎癥及纖維化的緩解。NASH為疾病進展的中間階段，全局把握NASH的免疫病理，免疫與炎癥、胰島素抵抗等的關系以及不同免疫細胞在NASH的作用、角色及相互關系是治療NAFLD的關鍵所在。
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