革蘭陰性菌外膜囊泡的研究進(jìn)展

馮文艷 張扣興

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院綜合ICU，廣州 510530)

所有活著的生物都釋放外囊泡(extracellular vesicles, EV)到細(xì)胞外環(huán)境中[1-4]。革蘭陰性菌產(chǎn)生的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是自然不可復(fù)制的、高度免疫原性球形納米粒子，有著重要的生物學(xué)功能[5-6]。革蘭陰性菌分泌許多毒力因子以操控宿主細(xì)胞[7]，且通過(guò)一些機(jī)制使它們能在不同的環(huán)境定植和生存，例如I-VI型分泌系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛的研究和發(fā)表。如今一些學(xué)者提出了細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)，例如OMVs—一種額外的獨(dú)立的分泌方式，暫稱為O型分泌系統(tǒng)。它們起源自外膜，因此組成成分與細(xì)胞膜成分相似。這些源自外膜的囊泡可以運(yùn)輸多種重要的生物分子：酶、毒素、抗原決定簇、脂多糖(LPS)和核酸[8]。因此，其所運(yùn)輸多種不同的物質(zhì)分子，決定了它在細(xì)胞間的交流扮演著十分重要的角色。

1 OMVs的合成與成分

革蘭陰性菌產(chǎn)生的OMVs是直徑為10～300nm的球形雙分子層脂蛋白，包裹的蛋白質(zhì)、脂類、核酸、以及代謝物等物質(zhì)，在細(xì)菌的致病機(jī)制、細(xì)胞間交流方面，發(fā)揮著至關(guān)重要的生物學(xué)功能[5,9-10]。OMVs起初被認(rèn)為是細(xì)胞裂解的副產(chǎn)物，而后很快被證實(shí)OMVs是由革蘭陰性菌外膜(outer membrane,OM)積極分泌產(chǎn)生的[5,11-12]。

1.1 OMVs的合成

OMVs是由細(xì)胞膜或是細(xì)胞器膜突起的一小部分脫落而產(chǎn)生。在真核細(xì)胞中這一過(guò)程已研究清楚，這是選擇性的進(jìn)程，精心的選擇特定的細(xì)胞成分作為囊泡攜帶的貨物以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能。這一精細(xì)的過(guò)程是高度協(xié)調(diào)的系統(tǒng)，在囊泡形成之處，膜重組和改造，膜的曲率增大以便一個(gè)平面的膜成為一個(gè)球狀囊泡[13]。由此我們推測(cè)，原核生物的這一進(jìn)程與真核生物相似。膜的曲率的改變無(wú)論對(duì)于真核細(xì)胞還是原核細(xì)胞都是極度消耗能量的過(guò)程。由平面的膜形成球狀囊泡所需的自由能(ΔG)大約是250～600kBT(kBT是熱能單位)[11]。膜的曲率變化是由外膜蛋白之一“曲率誘導(dǎo)蛋白(curvature inducing protein)”實(shí)現(xiàn)的，包裹錯(cuò)誤折疊蛋白(misfolded protein)及各種膜間質(zhì)蛋白(periplasmic protein)。在OMVs內(nèi)，內(nèi)膜相關(guān)聯(lián)的膜周質(zhì)蛋白比同內(nèi)膜緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)含量更高[14-15]。另外一種形成機(jī)制是，VacJ/Yrb ABC(ATP-結(jié)合型盒子)傳輸系統(tǒng)。在兩種完全沒(méi)有親緣關(guān)系的革蘭陰性菌流感嗜血菌和霍亂弧菌中實(shí)驗(yàn)，VacJ/Yrb的缺失或低表達(dá)使兩種細(xì)菌的OMVs產(chǎn)物增加。脂質(zhì)組學(xué)分析闡明了來(lái)源于VacJ/Yrb缺失突變型流感嗜血菌的OMVs富含某磷脂質(zhì)和某些脂肪酸。結(jié)果顯示OMVs起源的機(jī)制是基于外膜上突出小葉上的磷脂的積累。這一機(jī)制在革蘭陰性菌中是高度保守的，這或許能夠解釋為何OMVs在所有生長(zhǎng)環(huán)境下均能夠形成，而且在體內(nèi)可能有重要的病理生理意義[5,16-17]。

1.2 OMVs的成分

OMVs含有豐富的外膜蛋白(如OMPs、OmpA、OmpC和OmpF)，膜間質(zhì)蛋白(如AcrA和堿性磷酸酶)，以及一系列與宿主組織黏附和侵襲有關(guān)的毒性因子。OMVs主要由細(xì)胞外膜的成分組成，例如外膜的磷脂質(zhì)(phospholipids，PLs)、外膜的蛋白、脂多糖或脂質(zhì)低聚糖，也含有其他成分如周質(zhì)蛋白和細(xì)胞壁成分。同時(shí)，也含有內(nèi)膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)的成分、DNA、RNA、離子、代謝物和信號(hào)分子等[1,18-19]。革蘭陰性菌的細(xì)胞膜是脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，兩層膜夾著一個(gè)空間，夾著一層薄的肽聚糖。外膜是不對(duì)稱的脂質(zhì)膜。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和磷脂分別是外膜小葉和內(nèi)膜小葉上最充足的脂質(zhì)。LPS由脂質(zhì)A、多糖核心和O抗原(一個(gè)長(zhǎng)的多糖側(cè)鏈)組成[20]。通過(guò)鈉十二烷基硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)的方法，用蛋白染色跟蹤，研究對(duì)比純化的外膜和OMVs的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)二者的蛋白組成不同[21]。若OMVs是細(xì)胞裂解的隨機(jī)產(chǎn)物，那它的蛋白組成應(yīng)與細(xì)胞膜一致。然而，在OMVs中發(fā)現(xiàn)一些鞭毛蛋白或是分泌蛋白是細(xì)胞膜上所沒(méi)有的[11]。因此，這些這種能量的消耗以及成分的多元化表明OMVs是一種主動(dòng)的分泌過(guò)程。

2 OMVs的功能及致病機(jī)制

在各種不同環(huán)境下研究OMVs的分泌，發(fā)現(xiàn)周圍環(huán)境情況的能量必須很充足，才允許OMVs的分泌[22-23]。因此，OMVs成分的選擇性和細(xì)菌顯著的能量消耗，提示OMVs對(duì)于革蘭陰性菌必然發(fā)揮著至關(guān)重要的功能。

2.1 水平的基因轉(zhuǎn)化及抗生素抵抗

在OMVs中發(fā)現(xiàn)的DNA能夠成功的轉(zhuǎn)化到其他菌細(xì)胞中，形成一種新的DNA傳輸系統(tǒng)[24-25]。先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了OMVs釋放到環(huán)境中可以傳輸各種物質(zhì)(如酶、毒素等)到其他細(xì)菌中[26-28]；當(dāng)OMVs與受體細(xì)胞表面接觸并融合時(shí)，其包裹的物質(zhì)被傳輸?shù)绞荏w細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)間隙。由此推測(cè)，這種融合也可以將其包裹在內(nèi)的DNA傳輸?shù)街苜|(zhì)中，從而使DNA更容易進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)化[25]。

更為重要的是，被包裹在OMVs中的耐藥質(zhì)粒，可以避免核酸酶的作用發(fā)生降解，從而導(dǎo)致抗生素抵抗基因水平傳遞到其他細(xì)菌，發(fā)生耐藥傳遞。有活性的淋病奈瑟菌和流感嗜血菌及無(wú)活性的銅綠假單胞菌和大腸埃希菌O157:H7的OMVs已被確認(rèn)包裹著DNA。淋病奈瑟菌的OMVs包裹線性和染色DNA、質(zhì)粒(其中一個(gè)攜帶青霉素抗性基因)以及少量的RNA。用這種OMVs與青霉素敏感的淋病奈瑟菌一同孵化，轉(zhuǎn)化株能在抗生素環(huán)境中生存。這些數(shù)據(jù)表明OMVs介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移能發(fā)生于淋病奈瑟菌之間[29]。大腸埃希菌O157:H7的質(zhì)粒攜帶氨芐西林抗性基因(AmpR)和綠色熒光蛋白基因(pGFP)，將大腸埃希菌O157:H7的OMVs與缺乏這個(gè)質(zhì)粒大腸埃希菌共同孵化，導(dǎo)致有熒光的轉(zhuǎn)化株，這也表明，大腸埃希菌OMVs作為DNA運(yùn)輸?shù)妮d體[30]?？梢?jiàn)，OMVs有水平轉(zhuǎn)移DNA的能力，是一種新發(fā)現(xiàn)的自然的轉(zhuǎn)化載體，介導(dǎo)了細(xì)菌間耐藥的傳遞過(guò)程。

2.2 生物膜的形成

生物膜是指附著于物體表面的微生物群，是一種環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，對(duì)細(xì)菌的生存有重要意義。細(xì)菌為了逃離不利環(huán)境，黏附于固體表面，以固著方式生長(zhǎng)。生物膜內(nèi)部的細(xì)菌能避免抗生素及宿主免疫的作用，從而引發(fā)持續(xù)性感染。OMVs能夠刺激生物膜的形成。一株有生物膜形成能力的幽門螺桿菌菌株的OMVs能導(dǎo)致另一沒(méi)有這一能力菌株的生物膜形成[31]。若能阻斷OMVs的刺激作用，則有可能降低生物膜形成的幾率，對(duì)臨床的預(yù)后轉(zhuǎn)歸均有重大意義。

2.3 傳輸生物分子及細(xì)胞間交流

OMVs能貯存和傳輸多種多樣的生物分子[32]，形成了一個(gè)保護(hù)機(jī)制以對(duì)抗宿主的蛋白酶和抗體。例如，在周質(zhì)發(fā)現(xiàn)的溶血基因A(clyA)是非活性的，而在OMVs中發(fā)現(xiàn)的是活性的低聚合的溶血基因A[33]。OMVs可以增加包裹在其中的毒素的半衰期[26]，為各種毒素提供最佳的環(huán)境。

許多細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)來(lái)交流和協(xié)調(diào)，被稱之為群體效應(yīng)。疏水性群體效應(yīng)分子涉及細(xì)胞與細(xì)胞間的交流，例如2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮是銅綠假單胞菌喹諾酮信號(hào)(Pseudomonas quinilonesignal, PQS)，參與了細(xì)胞間的信息傳遞，能在肺上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，從而引發(fā)氧化應(yīng)激，抑制肺上皮細(xì)胞的血紅素氧合1表達(dá)，顯著地誘導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡，在銅綠假單胞菌感染宿主細(xì)胞時(shí)起著重要作用[34]。主動(dòng)介導(dǎo)自身及銅綠假單胞菌產(chǎn)生的其他抗生素喹諾酮的包裝。OMVs攜帶的PQS能夠補(bǔ)足缺乏PQS的銅綠假單胞菌菌株。許多群體信號(hào)有明顯的疏水性，有實(shí)驗(yàn)表明機(jī)會(huì)致病菌銅綠假單胞菌將信號(hào)分子PQS包裝到OMVs中以在群體中傳輸。在細(xì)菌群體中除去OMVs則細(xì)胞間的交流終止，且抑制了PQS控制的群體行為[25,35]。

當(dāng)革蘭陰性菌感染宿主時(shí)，細(xì)菌與宿主的相互反應(yīng)[11]。細(xì)胞間交流包括了種內(nèi)及種間的細(xì)胞交流[26]。一些細(xì)菌能通過(guò)OMVs干擾宿主細(xì)胞的運(yùn)輸途徑。例如銅綠假單胞菌通過(guò)OMVs包裹的毒素Cif細(xì)菌效應(yīng)蛋白促進(jìn)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的降解，CFRT是清除黏液纖毛所必需的。脂筏是細(xì)胞膜上一種有序的微區(qū)域，調(diào)節(jié)許多膜受體的活化，在OMVs與脂筏融合后，Cif細(xì)菌效應(yīng)蛋白被釋放入宿主細(xì)胞，OMVs阻止CFTR去泛素化，導(dǎo)致了CFTR的溶酶體降解。且效應(yīng)蛋白能夠幫助病原菌感染宿主并在宿主中定植[36]。Vanaja等[28]研究發(fā)現(xiàn)，LPS必須通過(guò)OMVs傳輸?shù)郊?xì)胞中。由此可見(jiàn)，提示OMVs能夠攜帶和釋放生物活性物質(zhì)，并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間交流。

2.4 應(yīng)激反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠?qū)χ車h(huán)境做出反應(yīng)，從而調(diào)整其OMVs的攜帶物質(zhì)。當(dāng)細(xì)菌在模仿含有沙門菌的液泡的環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)，能在OMVs中檢測(cè)到傷寒沙門菌的細(xì)胞膨脹致死毒素和LPS[37]。此外，OMVs中也曾發(fā)現(xiàn)參與抗生素降解的酶和免疫活性化合物[38]。在應(yīng)激的環(huán)境中，細(xì)菌會(huì)釋放一些不必要的或是不想要的物質(zhì)，革蘭陰性菌分泌出來(lái)的OMVs攜帶有毒成分、噬菌體和未折疊的蛋白質(zhì)，以減輕包膜壓力，保護(hù)自己得以避免環(huán)境情況的損害[26,32]。然而現(xiàn)在這一過(guò)程在大腸埃希菌中是通過(guò)哪一應(yīng)激通路控制的仍然未知[39]。而在黏質(zhì)沙雷菌，OMVs的產(chǎn)生是由溫度調(diào)控的。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，黏質(zhì)沙雷菌在22或30℃時(shí)產(chǎn)生大量的OMVs，而在37℃時(shí)產(chǎn)生的量很少。腸道菌的共同抗原(enterobacterial common antigen, ECA)綜合體的失活導(dǎo)致大量囊泡的形成，這支持OMVs在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的觀點(diǎn)。通過(guò)突變的ECA產(chǎn)生高產(chǎn)囊泡的表型能逆轉(zhuǎn)Rcs-磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)器RcsB的失活，提示在這一種生物中OMVs的產(chǎn)生對(duì)于Rcs磷酸化的作用[40]。面對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性微生物，OMVs也有細(xì)菌內(nèi)的作用，例如OMVs能被黏球菌利用以捕食其他細(xì)菌[41]。此外，在同一生態(tài)空間中發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性微生物分泌抗菌素到OMVs內(nèi)，選擇性的殺滅其他種屬的細(xì)胞[42]。細(xì)菌暴露于危險(xiǎn)環(huán)境如抗生素、應(yīng)激源、噬菌體、競(jìng)爭(zhēng)性微生物或抗原位點(diǎn)已被宿主檢測(cè)到時(shí)，OMVs的分泌會(huì)增加，這很有可能是一種新的防御機(jī)制[43-44]。

許多研究闡明不同來(lái)源的OMVs通過(guò)許多不同的方式激活宿主的免疫系統(tǒng)[45-47]，例如百日咳桿菌通過(guò)OMVs傳輸腺苷酸環(huán)化酶毒素到宿主細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平的提高[48]。OMVs傳輸?shù)奈镔|(zhì)不僅僅只有蛋白質(zhì)。一些物種例如伯氏疏螺旋體分泌OMVs以傳輸脂質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[49]。

2.5 腸道的微生物穩(wěn)態(tài)

OMVs能調(diào)節(jié)微生物群內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11,50-51]。許多類型的擬桿菌對(duì)腸道健康的有重要意義。由脆弱擬桿菌合成的多糖A(polysaccharide A, PSA)通過(guò)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞激活宿主IL-10的分泌，這對(duì)于宿主細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的免疫耐受的形成是很重要的[52]。脆弱擬桿菌的OMVs還能傳輸PSA到樹(shù)突細(xì)胞[53]。OMVs攜帶的PSA相較于單純的PSA能夠引發(fā)一串不同的免疫應(yīng)答。這表明了OMVs的重要性，是腸道的微生物調(diào)節(jié)器的傳輸工具[54]。Elhenawy等[50]用蛋白質(zhì)組學(xué)方法解釋脆弱擬桿菌和多形擬桿菌的OMVs選擇性包裝大量的碳水化合物水解和蛋白水解酶。Rakoff-Nahoum等[51]的工作表明這些OMVs包裝的水解酶對(duì)腸道的生態(tài)環(huán)境至關(guān)重要。許多擬桿菌屬通過(guò)包裹在OMVs中的水解酶都能夠消化吸收各種多糖。一種菌分泌的OMVs消化多糖的產(chǎn)物能夠支持其他無(wú)法分解多糖的菌種的生長(zhǎng)，形成腸道的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這說(shuō)明基于OMVs的網(wǎng)絡(luò)代表了在腸道菌群生態(tài)組織單位基本關(guān)系的創(chuàng)建，促進(jìn)人類腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收。酶被包裹在OMVs中是能免于介質(zhì)中蛋白酶的消化，說(shuō)明了OMVs對(duì)腸道微生物環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用。

2.6 OMVs的關(guān)鍵致病因子

OMVs能夠傳遞DNA片段、自溶酶、細(xì)胞毒素、毒力因子和多種其他生物分子[55-57]，有助于細(xì)菌建立內(nèi)部的交流，并加強(qiáng)與宿主的相互作用。在各種生理和病理功能有突出作用，如獲取營(yíng)養(yǎng)、誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)；傳遞毒素、黏連因子和毒力因子；逃避宿主防御系統(tǒng)。

以往認(rèn)為在OMVs攜帶的各種物質(zhì)中，蛋白是革蘭陰性細(xì)菌OMVs發(fā)揮功能的主要物質(zhì)，因此，做了許多OMVs相關(guān)蛋白的研究[33,58-59]。然而近期發(fā)現(xiàn)，能在宿主細(xì)胞中引起免疫應(yīng)答的關(guān)鍵致病因子是LPS。LPS是OMVs中最富足的成分之一，分布在外表面。此前研究發(fā)現(xiàn)LPS進(jìn)入胞漿中能夠激活caspase-11炎癥小體，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)。然而，很多細(xì)菌本身并沒(méi)有入侵細(xì)胞的能力。Vanaja等[28]為了證實(shí)OMVs介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和IL-1應(yīng)答都是由LPS而不是其他成分導(dǎo)致的，用野生型大腸埃希菌和突變型大腸埃希菌(缺少功能性己酰脂質(zhì)A，因此缺少Caspase-11活化功能)刺激骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow derive macrophage，BMDMs)，結(jié)果顯示后者不能導(dǎo)致強(qiáng)烈的細(xì)胞死亡和IL-1α、IL-1β的分泌。為了了解LPS是否是OMVs功能性部分，Vanaja等[28]對(duì)OMVs用多黏菌素B做預(yù)處理，多黏菌素B是一種可以與LPS對(duì)抗的抗生素。然后測(cè)試它在炎癥因子活化上的效應(yīng)。用多黏菌素B做預(yù)處理的OMVs降低了誘發(fā)細(xì)胞凋亡和IL-1應(yīng)答的能力。此外，來(lái)自革蘭陽(yáng)性菌的膜泡，如單核細(xì)胞增多性李斯特菌，缺少LPS，不能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或是IL-1α和IL-1β的分泌。這表明，LPS是OMVs致病的關(guān)鍵組分，且OMVs是傳輸LPS到宿主細(xì)胞引發(fā)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。

3 OMVs的提取及純化方法

提取OMVs，要除去非囊泡的物質(zhì)，如鞭毛、菌毛、纖毛和蛋白聚合物等，OMVs的純度對(duì)后續(xù)相關(guān)研究有重要意義。囊泡可以從體外細(xì)菌培養(yǎng)或感染細(xì)菌患者的體液中分離出來(lái)。目前，一系列的實(shí)驗(yàn)指南對(duì)OMVs的分離提純提供詳細(xì)的操作過(guò)程。連續(xù)的離心，過(guò)濾，密度梯度超速離心法及替代的隔離方法，如凝膠過(guò)濾等[55-57]。提取后可通過(guò)透射電鏡檢測(cè)OMVs樣本的純度。

3.1 超濾法與超速離心相結(jié)合

體液或體外細(xì)菌培養(yǎng)后行差速離心，上層清液通過(guò)孔徑為0.22～0.45μm的濾器和超速離心以提取OMVs[64-68]。細(xì)菌上層清液通過(guò)與給定的分子量濾膜，通常為50～100kDa，能夠去除大部分與OMVs不相關(guān)的蛋白質(zhì)。超濾膜材料的選擇對(duì)于濃縮OMVs是至關(guān)重要的。膜的實(shí)際性能各不相同。有兩種方式：一種是通過(guò)惰性氣體施壓，另一種是超濾離心。前者缺點(diǎn)是，由于過(guò)濾的力與膜垂直，導(dǎo)致濾膜容易阻塞，濃縮極化效應(yīng)會(huì)減慢整個(gè)濃縮進(jìn)程，部分OMVs附著于濾膜之上，增加不必要的流失。而后者通過(guò)選擇設(shè)備，薄膜的方向幾乎與離心力平行，可以規(guī)避極化效應(yīng)[71]。再進(jìn)行超速離心以濃縮OMVs。這種方法操作麻煩且耗時(shí)較長(zhǎng)，但得到的OMVs的純度較高。

3.2 單純超速離心法(ultracentrifugation)

單純超速離心操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，然而超速離心并不能完全分離蛋白質(zhì)聚合物和膜碎片[64]。只適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)OMVs純度要求不高的實(shí)驗(yàn)。

3.3 密度梯度離心法(density gradient centrifugation)

OMVs的脂質(zhì)含量高，所以密度低于可溶性分泌蛋白、鞭毛和菌毛等，因此在密度梯度離心時(shí)OMVs遷移到較輕的層面[18]。最常用的密度梯度介質(zhì)是碘克沙醇(optiPrepTM)[70]。其他密度梯度介質(zhì)如蔗糖[71]和右旋糖酐[72]較少用于的OMVs的提取。粗提的OMV樣本高密度溶液混合，再梯度覆蓋低密度溶液[73]。在離心時(shí)OMVs根據(jù)浮力密度遷移到達(dá)平衡位置。離心后，從頂部或底部收集(通過(guò)刺穿管)OMVs用以后續(xù)研究。蔗糖梯度密度超速離心能夠沉淀OMVs，但仍不能移除非囊泡物質(zhì)[74]。密度梯度超速離心法是目前是提取OMVs的最好方法之一[64,69]。

4 OMVs作為疫苗的應(yīng)用前景

疫苗通常要求輔助劑以增加療效。傳統(tǒng)的輔助劑，例如明礬，以一種無(wú)法控制的方式激活免疫應(yīng)答。新型的輔助劑有助于以更協(xié)調(diào)的方式指揮免疫應(yīng)答。基于OMVs的疫苗現(xiàn)在作為一種重要的生物技術(shù)。OMVs之所以能成為傳統(tǒng)疫苗的替代有以下幾個(gè)原因：首先，OMVs容易被提純；其次，OMVs是天然脂質(zhì)體，它的脂質(zhì)組成和大小，具有增加免疫應(yīng)答的輔助屬性，同時(shí)減少所需的抗原量[75]；最后，它們能夠被設(shè)計(jì)，允許外源抗原的存在[76]。

許多關(guān)于OMVs的疫苗研究說(shuō)明OMVs是有前景的對(duì)抗細(xì)菌感染疫苗候選者，例如流感嗜血菌、多殺巴斯德菌、霍亂弧菌、產(chǎn)腸毒素的大腸埃希菌、腦膜炎奈瑟菌、百日咳博代桿菌和鼠傷寒沙門菌[77-81]。Shim等[4]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)毒性的OMVs在小鼠和雪貂上能有效的增加流感疫苗的功效。無(wú)毒的fmOMVs是個(gè)有前景的佐劑能引起強(qiáng)健的T細(xì)胞預(yù)激，且能被廣泛適用于對(duì)抗流感病毒感染的預(yù)防措施的發(fā)展。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，在小鼠身上，來(lái)源于革蘭陰性菌的OMVs已經(jīng)成功地用作疫苗以抵御細(xì)菌性腦膜炎和敗血癥，而且囊泡的組成能夠被設(shè)計(jì)[82-85]。OMVs能夠通過(guò)設(shè)計(jì)囊泡的外源抗原用作疫苗的平臺(tái)。添加外源抗原到OMVs的主要優(yōu)勢(shì)是使抗原保持它們的天然構(gòu)象，有觸發(fā)特異免疫應(yīng)答的能力，而且一個(gè)單獨(dú)的產(chǎn)物能用于許多的疫苗[86]。

設(shè)計(jì)OMVs作為免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，重新編程細(xì)菌用以疫苗的傳送?，F(xiàn)有更多研究以減少毒性但又不至于滅毒，在保證安全的情況下盡可能的保留其免疫原性。此外大規(guī)模的生產(chǎn)一致的自發(fā)型OMVs仍是需要關(guān)注的領(lǐng)域。迄今為止，大部分設(shè)計(jì)的OMVs都是單價(jià)的，即只能對(duì)抗單一病原體的；多價(jià)OMVs疫苗尚未納入研究，但它可能提高現(xiàn)有的OMVs疫苗的效力[6]。

此外，OMVs疫苗可以擴(kuò)展到過(guò)敏的預(yù)防治療，用于針對(duì)免疫細(xì)胞對(duì)各種過(guò)敏原的耐受。OMVs已經(jīng)被證明能被多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell, DCs)內(nèi)化。例如，Jones等[87]能夠設(shè)計(jì)腦膜炎雙球菌菌株應(yīng)變產(chǎn)生OMVs通過(guò)DC-SIGN針對(duì)DCs。最后，結(jié)合OMVs的治療也可以實(shí)現(xiàn)。OMVs耦合納米粒子例如可以利用OMVs作為輔助劑的影響以及抗原表位的顯示以定位靶向細(xì)胞[6]。

5 OMVs研究展望

近10年來(lái)外膜囊泡的研究數(shù)量大幅上漲，但目前其生物起源、形成過(guò)程及功能尚沒(méi)有全面清楚的研究發(fā)表。相比于真核生物的相應(yīng)的外泌體(exosomes)，目前在原核生物的OMVs研究仍較少。然而，革蘭陰性菌對(duì)人類社會(huì)的影響較大，尤其是慢性病多重耐藥菌。未來(lái)，OMVs的研究可作為突破口，對(duì)我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)革蘭陰性菌和防控其感染均有重大意義。