手足口病從感染到發(fā)病的分子機制

陳 鑫，趙彬彬，武 婧，彭婉君，劉江寧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，主要病原為腸道病毒71(enterovirus 71，EV71)型。輕度感染者可在手足口等部位出現(xiàn)皰疹、斑丘疹等癥狀；重癥患兒可造成腦干腦炎、無菌性腦膜炎、神經(jīng)源性肺水腫等并發(fā)癥，具有較高的致殘率和死亡率。HFMD被稱為21世紀的“脊髓灰質(zhì)炎”，頗受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。2008年5月至2011年12月期間，中國大陸地區(qū)手足口病發(fā)病例數(shù)為500多萬例，其中死亡1870 例，且呈逐年增加態(tài)勢[1]。目前手足口病的致病機制尚不明確，且由于缺乏理想的實驗動物模型等原因使得手足口病研究進展緩慢。

研究手足口病致病相關(guān)基因可以為手足口病的預(yù)防、控制、治療和預(yù)后判斷提供依據(jù)，同時也可為新療法、新藥物提供基礎(chǔ)[2]。但是目前與手足口病致病相關(guān)基因的研究報道較少，缺乏手足口病致病特異基因的研究。在本文中，將對已發(fā)現(xiàn)的EV71致病相關(guān)基因作一綜述。同時，也將介紹遺傳多樣性小鼠，其復(fù)雜的遺傳性狀優(yōu)勢將在手足口病致病相關(guān)基因的研究中發(fā)揮重要作用[3]。

1 手足口病致病相關(guān)基因

目前，已經(jīng)報道的手足口病致病相關(guān)基因主要有三大類，病毒特異性受體類、宿主免疫反應(yīng)類和宿主病理損傷類。研究者發(fā)現(xiàn)這些基因與EV71感染和病情嚴重程度密切相關(guān)。下面將對這些致病相關(guān)基因作詳細闡釋。

1.1 病毒特異性受體類

1.1.1 清道夫受體B2(Scavenger receptor class B member 2，SCARB2)基因

SCARB2蛋白是一種膜蛋白，屬于CD36分子家族，主要表達于溶酶體和內(nèi)含體[4]。SCARB2是人類腸道病毒71的功能性受體，其主要負責(zé)EV71病毒的附著或脫殼。在中性和酸性條件下SCARB2結(jié)構(gòu)的差異，表明SCARB2經(jīng)歷了關(guān)鍵的pH依賴性構(gòu)象變化，其打開脂質(zhì)轉(zhuǎn)移通道以介導(dǎo)疏水性口袋因子從病毒體中排出，完成病毒脫殼過程[5]。研究者還確定了VP1蛋白與SCARB2連接所必需的關(guān)鍵殘基，EV71病毒VP1蛋白第145位的谷氨酸(VP1-145E)。VP1蛋白第145位為VP1-145E的EV71病毒比VP1-145G/Q的EV71病毒在食蟹猴和SCARB2轉(zhuǎn)基因小鼠中的毒力更強，且對宿主產(chǎn)生的抗體更具抗性[6]。Chen等[7]證實EV71病毒表面的殼蛋白VP1蛋白可與宿主受體SCARB2結(jié)合，能使病毒粒子的構(gòu)象發(fā)生改變，這種變化在宿主內(nèi)吞病毒的過程中顯著增加而使病毒衣殼變形肢解，最終導(dǎo)致病毒基因組RNA釋放到宿主細胞而完成感染。

有研究者發(fā)現(xiàn)，EV71病毒分布與SCARB2具有組織相關(guān)性，含病毒抗原的細胞幾乎都有SCARB2的表達分布，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)可能是EV71侵染的重要部位[8]。姚莎等[9]證明了SCARB2在重癥手足口病患者、正常兒童以及成人的肺組織的支氣管上皮、細支氣管上皮、肺泡上皮細胞及炎癥細胞中表達無統(tǒng)計學(xué)差異，提示SCARB2可能在重癥肺水腫HFMD的感染過程中具有一定的作用。目前，未有其它文獻報道SCARB2與手足口病病情嚴重程度有關(guān)。

綜上，SCARB2與EV71結(jié)合，在EV71的侵染、復(fù)制、釋放等感染過程中起重要作用。 SCARB2受體與HFMD病情嚴重程度的關(guān)系仍不是十分明確，有待于進一步深入研究。

1.1.2 P選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)基因

PSGL-1是具有同源二聚體結(jié)構(gòu)的一種黏附分子，并且是表達于幾乎所有白細胞表面的一種跨膜糖蛋白。PSGL-1是選擇素P的配體，其通常與選擇素P和趨化因子相互作用在炎癥的早期階段起作用。PSGL-1已被證明為EV71的功能性受體，EV71的衣殼蛋白VP1與硫酸化的PSGL-1特異性相互作用以促進病毒入侵[10]。SCARB2和PSGL-1兩種受體的功能上有很大的差異，研究人員構(gòu)建了轉(zhuǎn)入人hSCARB2基因的L-SCARB2細胞和轉(zhuǎn)入人hPSGL-1基因的L-PSGL-1細胞，再用EV71病毒株分別感染兩種細胞，比較兩種細胞感染EV71效率及結(jié)合EV71能力的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-PSGL-1細胞比L-SCARB2細胞能結(jié)合更多的EV71。然而，L-SCARB2的感染率卻顯著高于L-PSGL-1細胞，表明EV71的感染效率不由病毒與受體的結(jié)合能力決定[11]。

在重癥HFMD患者肺組織中受體表達的研究中，與SCARB2相比，PSGL-1只分布于成人肺組織支氣管上皮、細支氣管上皮、肺泡上皮細胞及炎癥細胞，在重癥肺水腫HFMD患者和正常兒童中不表達[9]。由此推測，PSGL-1可能不參與重癥HFMD的感染過程。

EV71受體的相關(guān)研究中，除SCARB2與PSGL-1是兩種相對明確的受體，也報道了其它相關(guān)受體。例如，O2型聚糖通過與唾液酸化的葡聚糖如唾液酸連接(SA-linked O-glycan)可作為EV71受體介導(dǎo)EV71感染DLD-1腸細胞[12]。總之，很可能存在更多未知的EV71受體，有待于更近一步的研究。

1.2 宿主免疫反應(yīng)類

1.2.1 人類白細胞介素4(Interleukin-4，IL-4)基因

IL-4主要由活化的T細胞產(chǎn)生，是Th2細胞的特征性細胞因子，當宿主遭到感染后介導(dǎo)機體體液免疫反應(yīng)。EV71研究中發(fā)現(xiàn)重組VP1蛋白能夠誘導(dǎo)高水平的Th2細胞反應(yīng)[13]。Hoebee等[14]的研究發(fā)現(xiàn)普通組及重癥組手足口病患兒IL-4水平均高于對照組，且重癥組明顯高于普通組。由此可見，IL-4可能是EV71患兒病情加重的一項重要指標。此外，基因測序分析發(fā)現(xiàn)IL-4基因中存在多個單核苷酸多態(tài)性基因座(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)，如存在于啟動子區(qū)域的IL-4-589CT基因SNP。該SNP的功能主要與IL-4的產(chǎn)生、活性及功能有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)與EV71患者重癥程度也有相關(guān)性。在EV71重癥患兒當中，IL-4-589CC基因型和C型等位基因顯著高于健康兒童[15]。另外基因型為IL-4-589CC和IL-4-589CT的患兒的血漿中的IL-4水平明顯比基因型為IL-4-589TT的患兒要高，但是IFN-γ和IFN-γ/IL-4的比率要比TT基因型要低。

研究還發(fā)現(xiàn)基因型IL-4-589CC和IL-4-589C的等位基因在EV71腦炎患兒中的頻率更高[16]。這些研究說明IL-4作為重要的細胞因子介導(dǎo)EV71病毒感染的整個過程，而IL-4基因多態(tài)性又與患兒病癥的嚴重程度密切相關(guān)。因此，早期篩查兒童IL-4基因多態(tài)性可能對預(yù)防該地區(qū)EV71爆發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。

1.2.2 γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)基因

IFN-γ是水溶性二聚體細胞因子，是II型干擾素的唯一成員，是Th1細胞的特征性細胞因子，主要由CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞產(chǎn)生。IFN-γ在抗病毒免疫過程中可以抑制病毒的復(fù)制，還可以調(diào)節(jié)其它免疫細胞的活動，誘導(dǎo)抗病毒蛋白在其他免疫細胞中的表達，在抗病毒效應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著重要作用。EV71重癥患兒中IFN-γ可以降低內(nèi)皮屏障并增加血管通透性。此外，重癥手足口病肺水腫患兒腦脊液中IFN-γ水平明顯高于其他組織，提示IFN-γ可能與EV71感染造成的神經(jīng)性病理損害有關(guān)。動物實驗表明，感染EV71的小鼠經(jīng)IFN-γ干預(yù)會發(fā)生肺水腫，說明IFN-γ在EV71感染患兒的病理過程中起重要作用，其水平高低可能與病情的嚴重程度有關(guān)[17]。另有研究表明，在HFMD患兒恢復(fù)期，IFN-γ水平下降，再次證明IFN-γ對HFMD病情進展的影響[14]。因此，在臨床診斷和治療過程中，IFN-γ水平具有非常重要的參考價值。

1.2.3 α腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)基因

TNF-α是能直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生。研究表明，隨著手足口病患兒病情的加重，TNF-α水平明顯升高，與病情嚴重程度呈正相關(guān)。劉松等[18]發(fā)現(xiàn)在EV71感染腦干腦炎和肺水腫患兒的外周血和腦脊液中TNF-α等炎癥因子明顯升高，隨著病情加重，TNF-α持續(xù)升高，再次表明TNF-α的水平與病情的嚴重程度有關(guān)。劉培培等[19]發(fā)現(xiàn)TNF-α基因啟動子區(qū)域308位點基因多態(tài)性與EV71中樞感染有相關(guān)性，TNF-α-308GG基因型可能為EV71的抵抗基因，保護兒童不受EV71的感染。當TNF-α基因的啟動子區(qū)-308位點發(fā)生單核苷酸突變，G被A代替，閱讀框內(nèi)密碼子發(fā)生改變，進而被限制性內(nèi)切酶NeoI識別，阻斷了TNF-α的表達，則有該類突變的兒童對EV71相對易感。綜上，TNF-α在臨床上可以作為評價患兒病情嚴重程度和預(yù)后的重要指標。

1.2.4 人類白細胞介素8(Interleukin-8，IL-8)基因

IL-8是人體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的重要趨化因子，當感染EV71時，體內(nèi)的巨噬細胞分泌IL-8，這可使趨化性T細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞等到達炎癥部位。并且它在啟動天然免疫和獲得性免疫介導(dǎo)的抗感染、抗腫瘤等方面起重要作用[20]。研究人員發(fā)現(xiàn)，手足口病患兒血清IL-8水平與疾病嚴重程度呈正相關(guān)，提示血清IL-8水平是EV71感染的關(guān)鍵因素之一，提示IL-8可作為臨床上EV71感染嚴重程度的輔助診斷指標。Wang等[21-22]的研究進一步發(fā)現(xiàn)，雖然輕度EV71感染患兒與對照組之間的IL-8-251位點基因型分布以及等位基因頻率無顯著性差異，然而EV71腦炎重癥組A等位基因頻率明顯高于輕度癥狀組。因此，攜帶有IL-8-251A等位基因的感染患者發(fā)展成為重癥患者的概率明顯高于T等位基因攜帶者[23]。然而，IL-8-251基因多態(tài)性與EV71腦炎患者易感性和病情嚴重程度之間的關(guān)系目前并不十分確切，需要進一步研究。

1.2.5 人類白細胞抗原(Human lymphocyte antigen，HLA)基因

HLA是人體已知的最復(fù)雜的基因系統(tǒng)，基因多態(tài)性使得不同的個體表達不同的HLA-I類和HLA-II類等位基因。HLA多態(tài)性的主要意義在于擴大個體可以應(yīng)答的抗原范圍并防止感染在人群中傳播。一般認為HLA的多態(tài)性與傳染病流行所施加的壓力有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)手足口病與HLA基因之間存在明顯的相關(guān)性。Chang等[24]發(fā)現(xiàn)HLA-A33，HLA-DR17與EV71感染密切相關(guān)，HLA-A33基因型在亞洲人群中普遍存在，在白種人中卻很少發(fā)現(xiàn)。多變量分析發(fā)現(xiàn)，攜帶HLA-A33基因的兒童感染EV71患腦炎的幾率更高，表明HLA-A33是重要的EV71致病相關(guān)基因。而HLA-A2基因則與患兒的心肺衰竭相關(guān)。HLA-G在病理生理條件下被認為是一種重要的免疫耐受分子，并且HLA-G在母嬰免疫耐受反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[25]。Zheng等[26]研究者發(fā)現(xiàn)手足口病重癥患兒的血漿中sHLA-G水平明顯比對照組要高，并且在危重EV71感染患兒血漿中sHLA-G水平比重度EV71感染患兒中更高。由此可見，HLA-G基因的多態(tài)性與兒童對EV71的易感性緊密相關(guān)，說明在臨床診斷過程中，sHLA-G水平可以作為輔助指標用于重癥EV71感染患兒的診斷。

1.3 宿主病理損傷類

1.3.1 細胞自噬(Autophagy)

細胞自噬廣泛存在于真核細胞內(nèi)，是一種溶酶體依賴性降解途徑，是細胞程序性死亡的方式之一，涉及細胞內(nèi)成分及外源病原微生物的吞噬、降解，是機體內(nèi)重要的保護和防御機制。近年來，研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬在病毒感染中起著復(fù)雜作用。一方面，自噬可以通過識別、呈遞病毒抗原，激活免疫應(yīng)答和降解病毒，從而達到清除病毒的目的[27]；另一方面，病毒也可以利用某些機制逃避自噬，特別是RNA病毒，能夠快速進化以應(yīng)對宿主細胞自噬[28]。研究者發(fā)現(xiàn)EV71感染與自噬相互促進，隨著感染時間和感染劑量的增加，自噬水平逐漸增強，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素又可增強EV71復(fù)制。張曉延等[29]發(fā)現(xiàn)EV71感染可促進LC3的型別轉(zhuǎn)換和P62的降解，并誘導(dǎo)細胞自噬；當用3-MA 抑制細胞自噬時，細胞產(chǎn)生的感染性病毒顆粒數(shù)量減少。進一步研究發(fā)現(xiàn)，EV71非結(jié)構(gòu)蛋白2BC可觸發(fā)自噬溶酶體形成，利于病毒復(fù)制，用自噬抑制劑氯喹阻斷自噬溶酶體產(chǎn)生后，EV71的病毒滴度、病毒拷貝和病毒蛋白均降低[30]。自噬和EV71病毒的研究才剛開始，因此需要進一步研究細胞自噬與手足口病之間的關(guān)系。

1.3.2 細胞凋亡(Apoptosis)

細胞凋亡是指基因控制的細胞自主有序死亡，可及時清除機體內(nèi)的多余細胞和受損細胞，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。EV71對人血管內(nèi)皮細胞，T淋巴細胞和神經(jīng)細胞的感染可引發(fā)感染細胞的凋亡并引起相關(guān)疾病的癥狀[31]。EV71觸發(fā)細胞凋亡具有多樣性，觸發(fā)途徑因感染的細胞種類不同而異。EV71感染T淋巴細胞，引起FasL表達，導(dǎo)致其凋亡。EV71感染神經(jīng)細胞，可激活A(yù)bl-Cdk5信號，并導(dǎo)致其凋亡[32]。EV71感染人血管內(nèi)皮細胞，可引起多種細胞因子升高，參與集體炎癥反應(yīng)，同時也可激活神經(jīng)酰胺等凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[31]。EV71觸發(fā)細胞凋亡具有偶聯(lián)性，凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與細胞增殖和分化過程中某些環(huán)節(jié)有著交叉、偶聯(lián)。如在EV71感染的早期階段(6 h內(nèi))，PI3K/Akt 和MAPK/ERK 的磷酸化導(dǎo)致GSK-3 活化的抑制，隨后的BAD、Caspase-9和FKHR無法完成磷酸化，阻止宿主細胞的凋亡。Akt催化多種底物，其中包括GSK-3，其通過磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子和翻譯起始因子，參與細胞代謝，增殖，分化過程[33]。EV71觸發(fā)細胞凋亡具有多途性，EV71感染可經(jīng)過多種信號途徑觸發(fā)凋亡，其中并沒有起關(guān)鍵樞紐作用的關(guān)鍵點。

細胞凋亡可能是EV71感染引起嚴重疾病的發(fā)病機制之一，在目前缺乏特異性、高效的抗病毒藥物的情況下，通過切斷凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抑制EV71感染引起的細胞凋亡為治療提供了新的思路和方向。但是目前相關(guān)的研究較少，很多結(jié)論仍舊停留在猜想階段，EV71引起細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有待于進一步研究。

2 手足口病致病相關(guān)基因研究新工具的應(yīng)用展望

遺傳多樣性小鼠(Genetic diversity mice)是通過對現(xiàn)有的小鼠近交品系進行遺傳分析，最終選出來5個實驗室動物品系和3個野生動物品系，進行雜交傳代而獲得[34]。遺傳多樣性小鼠具有豐富的性狀和豐富的遺傳多態(tài)性，可以模擬人基因多樣性，是研究人類復(fù)雜性狀的新型工具。能夠最大程度地體現(xiàn)不同人群對病因敏感的差異性，可應(yīng)用于精準醫(yī)療、基因功能發(fā)現(xiàn)、疾病模型建立和人類復(fù)雜性狀疾病的研究[35]。

遺傳多樣性小鼠作為一種新的動物資源在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多，研究者成功利用遺傳多樣性小鼠建立了埃博拉病毒的感染模型，讓遺傳多樣性小鼠成功應(yīng)用于傳染病模型的建立[36]。然而尚未有利用遺傳多樣性小鼠進行手足口病致病相關(guān)基因的研究。相比單一遺傳背景的小鼠，遺傳多樣性小鼠在手足口病致病相關(guān)基因的篩選中效率大增。借助200多個遺傳多樣性小鼠品系，利用標準化的方法感染EV71病毒，通過GeneMiner(http://192.168.1.9/Geniad2/)分析得到的相關(guān)數(shù)據(jù)，從而獲得手足口病易感和抵抗相關(guān)的基因簇，再通過其他數(shù)據(jù)庫對獲得的基因簇進行分析篩選。之后對選取的候選易感和抵抗相關(guān)基因進行基因敲除，利用基因敲除小鼠進行進一步的驗證實驗。

3 結(jié)語

綜上所述，手足口病致病相關(guān)基因的報道主要可以分為三大類，病毒特異性受體類、宿主免疫反應(yīng)類和宿主病理損傷類。本文認為，病毒特異性受體除SCARB2和PSGL-1較為明確以外，其它受體的相關(guān)研究較少，應(yīng)加大探索研究力度，尋找更多特異性受體。同樣，細胞凋亡和細胞自噬與手足口病致病機制的相關(guān)研究處于初期階段，需要進一步的深入研究。遺傳多樣性小鼠豐富的性狀差異和豐富的遺傳多態(tài)性優(yōu)勢，是研究手足口病非常好的動物資源，它可以高效地篩選手足口病相關(guān)致病基因，對于揭示手足口病的致病機理、新藥物干預(yù)靶點的研究、指導(dǎo)臨床診斷、治療和預(yù)后以及手足口病的預(yù)防和應(yīng)對都有著非常重要的作用和意義。