家蠶抗性基因細(xì)胞色素P450的研究進(jìn)展

●高瑞娜（朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 山西 朔州 030006）

家蠶是一種產(chǎn)絲昆蟲，由于其具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、詳盡的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究背景，現(xiàn)已成為重要的模式生物[1]。但是，隨著工業(yè)、城市以及農(nóng)業(yè)環(huán)境的污染加劇，如氟化物、工業(yè)粉塵、殺蟲劑及飼料添加劑的濫用等，嚴(yán)重影響了家蠶的正常生長(zhǎng)發(fā)育，使絲綢行業(yè)遭到了巨大的威脅。在長(zhǎng)期的人工馴化過程中，家蠶的抗逆能力逐漸下降，對(duì)外界刺激物的耐受力減弱，因此，提高家蠶的抗逆性和抗病性成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。

細(xì)胞色素P450加單氧酶是重要的代謝酶系，不僅涉及一系列的內(nèi)源代謝復(fù)合物如激素、脂肪酸、幽類化合物和維生素等的代謝，也涉及對(duì)外源復(fù)合物如藥物、環(huán)境污染物、化學(xué)制品、殺蟲劑以及植物毒素等多種化合物的代謝[2，3]，是昆蟲體內(nèi)三大解毒酶家族之一[4]，對(duì)昆蟲抗性起著十分重要的作用，同時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育有著非常關(guān)鍵的功能。在基因進(jìn)化過程中，與代謝抗性相關(guān)的基因趨向于和昆蟲特殊的生長(zhǎng)環(huán)境及取食習(xí)性相適應(yīng)，而與昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因功能則相對(duì)保守穩(wěn)定[5]。本文以期通過對(duì)家蠶在各種外界刺激下的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行綜述，為加強(qiáng)P450基因參與昆蟲反防御機(jī)制的研究、推動(dòng)害蟲治理向分子水平的技術(shù)進(jìn)步提供更科學(xué)合理的理論指導(dǎo)。

1 對(duì)植物次生物質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

家蠶主要以桑葉為食料，而桑葉中含有較高的槲皮素、蘆丁、蕓香苷和生物堿等次生物質(zhì)，用來驅(qū)避植食性昆蟲而保全自己，干擾昆蟲的正常生長(zhǎng)[6]。Zhang[7]用含0.5%和1%的槲皮素飼料喂食家蠶，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到中腸組織中CYP6AB5、CYP6B29基因表達(dá)量分別是對(duì)照組的10.9倍和6.2倍；同時(shí)用槲皮素和蘆丁分別處理整蠶后細(xì)胞色素P450酶活性也顯著上升。本人前期用蕓香苷誘導(dǎo)家蠶，用雙熒光定量PCR也檢測(cè)到在中腸和脂肪體中CYP4M5和CYP4M9基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。這些結(jié)果說明細(xì)胞色素P450基因與植物次生物質(zhì)的代謝具有一定的相關(guān)性。

2 對(duì)氟化物的誘導(dǎo)表達(dá)

隨著我國工業(yè)化的發(fā)展，大量氟化物被釋放到環(huán)境中，隨桑葉進(jìn)入蠶體累積，與組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制組織細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，使蠶體出現(xiàn)氟中毒現(xiàn)象，甚至死亡[8，9]。氟化物污染對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成的危害和相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失已引起蠶業(yè)界廣泛關(guān)注。Zhou等[10]用熒光差異顯示技術(shù)對(duì)家蠶抗性品系與敏感品系的中腸組織進(jìn)行比較對(duì)照分析，結(jié)果在只存在于抗性品系中的一條特異性電泳條帶克隆獲得一個(gè)家蠶P450基因CYP306A1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析表明該基因在抗性品系中具有較高轉(zhuǎn)錄活性。對(duì)該基因的表達(dá)特異性用半定量PCR分析，結(jié)果只在中腸和卵巢兩個(gè)組織中表達(dá)。米智等[11]發(fā)現(xiàn)在氟化物誘導(dǎo)后家蠶抗性品系T6中腸組織中的細(xì)胞色素P450含量比對(duì)照組高3～7倍，而敏感品系734的變化則不明顯。該酶系中細(xì)胞色素b5含量的變化與其基因表達(dá)具有較高的一致性，表明P450酶的活性也與之相關(guān)。米智[12]還發(fā)現(xiàn)在NaF作用下耐氟抗性品系T6中腸的NADPH一細(xì)胞色素P450還原酶CPR活性變化范圍與對(duì)照組相差不大，而敏感品系734的活性變化范圍比對(duì)照組顯著上升，由此推測(cè)CPR與家蠶對(duì)氟化物代謝也具有一定的關(guān)系。本研究室Sisi Zhao[13]在NaF誘導(dǎo)后用雙熒光載體檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到CYP9A19和CYP9A22基因啟動(dòng)子活性有明顯的劑量效應(yīng)。

3 對(duì)殺蟲劑的誘導(dǎo)表達(dá)

人們對(duì)昆蟲殺蟲劑抗性研究一般是為了降低昆蟲的抗性，但對(duì)家蠶而言則主要是為了提高對(duì)殺蟲劑的抵抗力。

Yamamoto等[14]利用二嗪農(nóng)、吡蟲啉、芐氯菊酯等不同種類農(nóng)藥分別對(duì)家蠶進(jìn)行添食，微陣列結(jié)果表明二嗪農(nóng)與CYP4M5、CYP4G22(CYP4G25)和CYP333A2(BGIBMGA005356)、吡蟲啉與CYP9A20，CYP4G22和CYP333A2，芐氯菊酯與CYP4G22和CYP333A2之間呈現(xiàn)出誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的關(guān)系，其中CYP4G22可在吡蟲啉、芐氯菊酯誘導(dǎo)下分別上調(diào)表達(dá)8.3倍和8.9倍。李濤[15]用溴蟲腈藥液浸泡桑葉喂食家蠶，發(fā)現(xiàn)同一齡期耐受品系的細(xì)胞色素P450含量高于敏感品系，而且耐受品系的幼蟲隨著發(fā)育齡期對(duì)溴蟲腈的耐受性也增加。顧芝亞[16]用辛硫磷添食家蠶，用芯片技術(shù)和熒光定量PCR方法都檢測(cè)到CYP4G25和CYP9A21基因在轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。Fanchi Li等[17]在辛硫磷誘導(dǎo)家蠶后用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450基因4家族、6家族、9家族基因在脂肪體中表達(dá)都上調(diào)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)到CYP49A1、CYP6AB4、CYP9A19、CYP9A22基因在誘導(dǎo)后持續(xù)高水平表達(dá)。趙國棟等[18]用微量氰戊菊酯添食家蠶，用熒光定量PCR方法檢測(cè)到敏感性品系脂肪體組織中CYP9A19和CYP9A20基因的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比顯著下調(diào)，在中腸組織中兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯；而耐受品系的中腸組織中這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比顯著增加，在脂肪體組織中CYP9A20基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明家蠶細(xì)胞色素P450基因家族在殺蟲劑代謝解毒中起一定的作用。

4 對(duì)納米二氧化鈦的誘導(dǎo)表達(dá)

納米二氧化鈦的粒徑＜100nm，由于具有抗菌、自潔凈、抗老化及較高的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、超親水性、非遷移性、表面吸附性和光催化活性等特性，被廣泛應(yīng)用于漂白、食品添加劑、遮光劑和化妝品等領(lǐng)域。低濃度的納米二氧化鈦對(duì)核酸的合成不會(huì)造成影響，但高濃度的納米二氧化鈦對(duì)生物則具有一定的毒性作用[19，20]。由于納米二氧化鈦具有一定的生物活性，已被農(nóng)業(yè)部列入飼料添加劑品種目錄[21]。占鵬飛等人[22]用低濃度納米二氧化鈦浸泡桑葉后喂食5齡起蠶，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450氧化酶活性顯著上升，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到BmCYP6ae22基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平有差異，在脂肪體中最多，是對(duì)照組的3.438倍，中腸次之，是對(duì)照組的2.24倍，與其酶活性的變化趨勢(shì)一致。說明低濃度納米二氧化鈦可以誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞色素P450基因表達(dá)上調(diào)，解毒酶活性上升，提高對(duì)進(jìn)入體內(nèi)有毒物質(zhì)的降解能力。

5 總結(jié)與展望

昆蟲在與植物的協(xié)同進(jìn)化中，可以改變其取食策略或調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育節(jié)律對(duì)植物的防御進(jìn)行抵抗，同時(shí)又能降低靶標(biāo)物對(duì)有毒物質(zhì)的敏感性，增加解毒酶活性來主動(dòng)降解植物產(chǎn)生的有毒物質(zhì)進(jìn)行反防御[23]。昆蟲P450基因不僅能直接參與植物次生有毒物質(zhì)的代謝降解，而且已有研究表明還可以通過竊聽植物的分子信號(hào)來活化自身解毒酶活性[24]。唐濤等[25]通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AhR信號(hào)通路可能參與P450解毒酶基因的表達(dá)調(diào)控，而且通過遺傳分析，棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄因子AhR和ARNT基因與家蠶同源性最高，為進(jìn)一步調(diào)控機(jī)制研究奠定分子基礎(chǔ)。

鱗翅目有多種昆蟲，是昆蟲綱中第二大目，又是主要的農(nóng)業(yè)與森林害蟲，而家蠶作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是第一個(gè)完成了全基因組測(cè)序的鱗翅目昆蟲，其基因組中P450基因已經(jīng)得到序列分析與功能的初步預(yù)測(cè)。而且研究發(fā)現(xiàn)家蠶84個(gè)P450基因中主要與代謝抗性相關(guān)的基因產(chǎn)生大量的串聯(lián)復(fù)制，數(shù)量眾多，且相互之間存在一定的底物相似性、重疊性，在功能上表現(xiàn)出一定程度的冗余，使其在應(yīng)對(duì)外界抗性時(shí)具有較強(qiáng)的彈性[26]，因此，利用微陣列、熒光定量PCR、基因芯片及RNA干擾技術(shù)等基因組學(xué)研究技術(shù)對(duì)P450基因家族進(jìn)行功能驗(yàn)證、參與反防御機(jī)制的深入研究，可以為害蟲治理提供可靠的靶標(biāo)位點(diǎn)，推動(dòng)害蟲治理向分子水平進(jìn)步。