米諾環(huán)素對脊髓損傷治療機(jī)制的研究進(jìn)展

晏榮保，祁全，劉楊，趙鵬，李成勇，尹遜屹

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，黑龍江哈爾濱市 150001

脊髓損傷導(dǎo)致?lián)p傷平面以下運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)功能障礙。脊髓損傷的病理過程分為兩個(gè)階段：原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷發(fā)生迅速且不可逆。繼發(fā)性損傷的機(jī)制包括血脊髓屏障破壞、缺血再灌注損傷、細(xì)胞功能障礙、興奮性毒性、氧化應(yīng)激、自由基形成、免疫損傷以及炎癥改變，其加劇細(xì)胞死亡并顯著擴(kuò)大損傷范圍，是大多數(shù)藥理學(xué)干預(yù)的主要靶點(diǎn)[1?3]。

1998年，Yrj?nheikki 等[4]首先在動(dòng)物腦缺血模型中證實(shí)米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)作用。此后許多研究者不斷深入研究米諾環(huán)素在脊髓損傷動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)物中的作用及機(jī)制，揭示米諾環(huán)素可能成為治療脊髓損傷的有效藥物[5?6]。本文對米諾環(huán)素治療脊髓損傷的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 米諾環(huán)素概述

米諾環(huán)素是第二代半合成四環(huán)素類抗生素，主要通過與核糖體30S 亞基結(jié)合、阻止肽鏈延長、抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成等發(fā)揮抗炎作用。目前臨床上主要用于治療痤瘡等皮膚病、性傳播疾病以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，長期使用時(shí)安全性良好。常見的副作用包括惡心、眩暈和輕微頭痛，主要發(fā)生在治療早期，停藥后癥狀即可消失。

與第一代四環(huán)素相比，米諾環(huán)素具有更好的藥物動(dòng)力學(xué)特性，半衰期更長，組織滲透性更好，生物利用度更高。由于其分子量小，親脂性高，可有效透過血腦屏障而到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

除了抗菌作用外，米諾環(huán)素還在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停X卒中、創(chuàng)傷性腦損傷、神經(jīng)性疼痛、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥和脊髓損傷等，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[7?10]。米諾環(huán)素相關(guān)的臨床試驗(yàn)也取得豐碩的研究成果。

2 米諾環(huán)素治療脊髓損傷的作用機(jī)制

2.1 抗氧化效應(yīng)

脊髓損傷后細(xì)胞暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)等自由基時(shí)，發(fā)生氧化損傷。高反應(yīng)性ROS 和RNS 使細(xì)胞膜不穩(wěn)定，損傷細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和核酸，并通過凋亡或壞死途徑而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。脊髓損傷后ROS 和RNS 的產(chǎn)生顯著增加，導(dǎo)致存活的細(xì)胞和周圍組織廣泛損害，被認(rèn)為是繼發(fā)性損傷級聯(lián)中的關(guān)鍵事件之一[11?12]。

Aras等[13]在大鼠脊髓損傷后給予米諾環(huán)素，發(fā)現(xiàn)血液和組織樣本中丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平降低，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glu?tathione peroxidase,GSH?Px)水平降低，組織總抗氧化狀態(tài)和總氧化狀態(tài)(total antioxidant and oxidant status,TAS?TOS)水平顯著增高。這證實(shí)脊髓損傷增加氧化應(yīng)激和米諾環(huán)素劑量依賴性的抗氧化活性，米諾環(huán)素可能在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的組織損傷中具有治療潛力。Sonmez 等[14]也證實(shí)脊髓損傷后使用米諾環(huán)素可顯著降低丙二醛和谷胱甘肽的水平，表明米諾環(huán)素顯著減少脂質(zhì)過氧化。總之，抗氧化活性是米諾環(huán)素減少繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制。

2.2 抗凋亡作用

脊髓損傷后的細(xì)胞損傷是由血管痙攣、局部缺血、氧化應(yīng)激和再灌注損傷等引起，凋亡是細(xì)胞死亡的重要途徑。半胱天冬酶?3(Caspase?3)是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，它是多種凋亡途徑的下游效應(yīng)部分，可引起一系列凋亡活動(dòng)[15?16]。

Sonmez 等[14]在大鼠脊髓損傷后給予米諾環(huán)素，使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸?生物素缺口末端標(biāo)記(TdT?mediated dUTP Nick?End Labeling,TUNEL)染色和凋亡指數(shù)值進(jìn)行評估。短期評估顯示，脊髓損傷組、對照組、米諾環(huán)素靜脈輸注組和腹腔注射組凋亡指數(shù)分別為73.33%、1.33%、10%和16.66%。長期評估也顯示類似的結(jié)果(分別為70%、1%、3%和3.66%)。結(jié)果證實(shí)米諾環(huán)素能顯著減少脊髓損傷后第1 天和第28 天TUNEL 染色陽性細(xì)胞的數(shù)量，這表明米諾環(huán)素的治療在短期評估和長期評估中均能減少細(xì)胞凋亡，并且這種抗凋亡效果在長期評估中更為顯著。

Chen 等[17]的研究證實(shí)，米諾環(huán)素能夠抑制Caspase?3 的活化，下調(diào)p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen?activated pro?tein kinase,p38MAPK)的表達(dá)而發(fā)揮抗凋亡作用。米諾環(huán)素發(fā)揮抗凋亡作用的機(jī)制可能包括降低線粒體通透性轉(zhuǎn)換率，減少應(yīng)激條件下Ca2+的攝取，減少反應(yīng)性活性物質(zhì)的形成和抑制p38MAPK通路等[18?19]。因此，米諾環(huán)素發(fā)揮抗凋亡作用而減輕繼發(fā)性脊髓損傷，需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)米諾環(huán)素對凋亡通路和關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用。

2.3 抗炎作用

炎癥是脊髓損傷后繼發(fā)性損傷過程的關(guān)鍵事件。過去，經(jīng)常認(rèn)為神經(jīng)炎癥對神經(jīng)功能有害，然而近年來對小膠質(zhì)細(xì)胞表型的研究強(qiáng)調(diào)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的復(fù)雜性[20]。

小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵炎性細(xì)胞，在受損脊髓中其表型和功能是動(dòng)態(tài)的，并且可以根據(jù)脊髓損傷后的微環(huán)境而改變。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子?α(tumor necrosis factor?α,TNF?α)、白細(xì)胞介素(inter?leukin,IL)?1β、干擾素?γ (interferon?γ,IFN?γ)、一氧化氮(nitric oxide,NO)以及細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD68，促進(jìn)繼發(fā)性損傷。M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)不同的分子，如IL?4、IL?10、精氨酸酶1 (arignase1,Arg?1)、類幾丁質(zhì)酶樣分子3 (chitinase?like 3,Ym1)和CD206，并顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。脊髓損傷的微環(huán)境有利于M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，而M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞僅在脊髓損傷后的早期短暫出現(xiàn)[21?23]。

Kobayashi等[24]在SOD1小鼠模型中證實(shí)米諾環(huán)素在體內(nèi)和體外抑制M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)以及炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而不影響體內(nèi)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。這是第一個(gè)證明米諾環(huán)素在小膠質(zhì)細(xì)胞亞群中選擇性的研究。這項(xiàng)研究表明，米諾環(huán)素選擇性抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化成促炎狀態(tài)，這為理解許多伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞活化疾病的病理變化提供基礎(chǔ)。

Papa等[25]在體內(nèi)和體外測試和評估一種新型的納米載體藥物遞送工具，即米諾環(huán)素?聚合納米顆粒(polymeric nanoparti?cles,NPs)。結(jié)果表明，米諾環(huán)素?NPs 能減少損傷部位周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖，并有利于減少小膠質(zhì)細(xì)胞M1 表型，增加M2 表型。這種新型的納米載體藥物遞送工具能夠增強(qiáng)藥物靶向性，增加藥理活性并減少潛在的藥物相關(guān)副作用，顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。通過進(jìn)一步研究，Papa等[26]證明米諾環(huán)素?NPs能夠有效調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞，從而降低促炎反應(yīng)，維持促再生周圍環(huán)境，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能持續(xù)改善，這說明特制的生物材料選擇性遞送藥物是一種有前途的創(chuàng)新方法。

以上研究表明，脊髓損傷后給予米諾環(huán)素可抑制繼發(fā)性損傷的進(jìn)展，有利于減輕組織損傷和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。米諾環(huán)素的治療機(jī)制與抗氧化活性、減少細(xì)胞凋亡、抗炎作用和選擇性調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)等相關(guān)。

3 臨床研究

脊髓損傷動(dòng)物模型中的臨床前期研究結(jié)果支持米諾環(huán)素潛在的治療作用。Casha 等[27]為了優(yōu)化劑量，評估安全性和確定治療可行性，開展米諾環(huán)素治療脊髓損傷的單中心Ⅱ期隨機(jī)對照試驗(yàn)。有52 例患者隨機(jī)分為米諾環(huán)素治療組和對照組，受試者12 h 內(nèi)靜脈輸注負(fù)荷劑量800 mg，接著每12 小時(shí)依次遞減100 mg，直至達(dá)到400 mg，隨后維持該劑量，共7 d。從損傷當(dāng)天到傷后12 個(gè)月評估神經(jīng)學(xué)功能。結(jié)果顯示，接受米諾環(huán)素治療的患者比接受安慰劑患者的運(yùn)動(dòng)評分高6 分。在頸髓損傷患者中，觀察到接受米諾環(huán)素的患者運(yùn)動(dòng)評分增加14 分，不完全性頸髓損傷患者運(yùn)動(dòng)評分最大改善22 分。胸髓損傷患者沒有觀察到恢復(fù)差異。感覺恢復(fù)遵循與運(yùn)動(dòng)恢復(fù)相似的時(shí)間過程和模式。僅有1 例患者出現(xiàn)肝酶升高，但無癥狀，在停藥后迅速恢復(fù)正常。雖然這項(xiàng)研究并未確定米諾環(huán)素治療脊髓損傷的療效，但他們達(dá)到試驗(yàn)的目標(biāo)。在這項(xiàng)研究中證明該治療方案是安全可行的，并且與多種結(jié)局指標(biāo)的改善傾向相關(guān)。

進(jìn)一步的分析表明，首先，頸髓損傷，特別是不完全性損傷，可能從米諾環(huán)素治療中獲得最大的益處。必須考慮到人類脊髓損傷的異質(zhì)性，以檢測潛在的重要臨床差異；其次，在這些研究中使用最敏感的結(jié)果檢測是至關(guān)重要的。對于胸髓損傷的患者，美國脊髓損傷協(xié)會(huì)(American Spinal Cord Injury Asso?ciation,ASIA)的運(yùn)動(dòng)評分沒有差異。然而，ASIA 運(yùn)動(dòng)評分對胸髓損傷的臨床部分恢復(fù)并不特別敏感，這表明在研究這一亞群時(shí)應(yīng)使用其他替代的檢測措施[28]。最后，這項(xiàng)研究應(yīng)該作為一個(gè)大型的多中心試驗(yàn)的基礎(chǔ)，可以充分揭示米諾環(huán)素潛在的臨床療效。目前，正在進(jìn)行米諾環(huán)素治療急性頸髓損傷的Ⅲ期臨床試驗(yàn)[29]。

盡管米諾環(huán)素靶向作用于多種繼發(fā)性損傷機(jī)制而具有神經(jīng)保護(hù)的潛力。然而，無法將用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高劑量轉(zhuǎn)化為人類患者的可耐受劑量，這限制其臨床功效。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量為90～135 mg/(kg·d)，1～5 d，遠(yuǎn)高于最近Ⅱ期臨床試驗(yàn)中所使用的米諾環(huán)素劑量12～22.5 mg/(kg·d)，7 d 和標(biāo)準(zhǔn)的人體劑量3 mg/(kg·d)。

此外，米諾環(huán)素治療的持續(xù)時(shí)間有限。已證明長期全身給予高劑量米諾環(huán)素會(huì)引起肝毒性[27]。局部釋放米諾環(huán)素可使受損的脊髓組織暴露于高濃度的藥物，同時(shí)延長治療的持續(xù)時(shí)間，可避免長期全身用藥可能出現(xiàn)的副作用。Wang 等[30]在大鼠脊髓損傷模型中，開發(fā)一種水凝膠形式的藥物控制性釋放系統(tǒng)，可注射到鞘內(nèi)空間，以適當(dāng)?shù)膭┝亢统掷m(xù)時(shí)間局部釋放米諾環(huán)素而不會(huì)引起額外的組織損傷。與靜脈輸注和腹腔注射相比，該藥物釋放系統(tǒng)在減少繼發(fā)性損傷和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)方面更有優(yōu)勢，顯示出對脊髓損傷的巨大治療潛力，也為米諾環(huán)素的臨床應(yīng)用提供新的途徑。

4 小結(jié)與展望

目前米諾環(huán)素的動(dòng)物模型大多數(shù)是不完全性胸髓損傷，而臨床中胸髓損傷患者大多是完全癱瘓的[31]。特別是，大多數(shù)臨床病例是頸髓損傷，而只有一小部分的臨床前期研究是基于頸髓水平。頸髓與胸髓解剖、生理學(xué)和免疫反應(yīng)之間的差異可能會(huì)影響脊髓損傷的病理生理學(xué)差異[32]。因此，為了驗(yàn)證米諾化環(huán)素在臨床試驗(yàn)中的有效性，在基礎(chǔ)研究時(shí)使用臨床相關(guān)的動(dòng)物模型是必要措施。同時(shí)，與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型相比，人類脊髓損傷患者具有更大的異質(zhì)性，并且由米諾環(huán)素治療導(dǎo)致的恢復(fù)不能與自發(fā)性恢復(fù)相區(qū)分。通過神經(jīng)影像學(xué)或生物標(biāo)志物來追蹤人類脊髓中的組織學(xué)和神經(jīng)功能變化是重要的措施，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)之一[33?35]。

對脊髓損傷患者采用適當(dāng)?shù)慕Y(jié)果測量尤為重要。未來人類脊髓損傷研究需要關(guān)注最有可能顯示臨床益處的亞群，以防止掩蓋有效的治療。最后，生物材料學(xué)的迅猛發(fā)展催生一大批新型的藥物載體工具[36?38]，能夠減少治療中使用的藥物劑量并使?jié)撛诘母弊饔米钚』?，從而?yōu)化米諾環(huán)素的臨床應(yīng)用，這已成為未來研究中的重要課題。

總之，米諾環(huán)素可以靶向作用于多種繼發(fā)性損傷機(jī)制而促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)，還需要進(jìn)一步的研究來確定米諾環(huán)素的治療窗口、最佳劑量、持續(xù)時(shí)間和給藥途徑以使米諾環(huán)素的治療功效最大化。在對米諾環(huán)素治療潛力進(jìn)行準(zhǔn)確評估之前，需要更好地了解米諾環(huán)素在人體內(nèi)作用的機(jī)制。我們相信，隨著基礎(chǔ)和臨床研究的不斷深入，米諾環(huán)素將使脊髓損傷患者受益良多。