VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌研究進展

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(1.四川大學(xué)華西醫(yī)院超聲科，2.臨床超聲影像藥物研究室，四川 成都 610041)

目前,我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度居全球首位，已成為城市女性最常發(fā)生的惡性腫瘤之一。超聲分子顯像(ultrasound molecular imaging, USMI)通過靶向超聲造影劑識別病變血管內(nèi)皮細胞特異性表達靶點[1]，實現(xiàn)在分子水平診斷疾病。靶向超聲造影劑的靶點主要為炎癥病灶、血栓、新生血管等部位的特定生物標(biāo)記物[2-3]。新生血管在惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中有重要角色，而血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)/血管內(nèi)皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)通路是腫瘤新生血管的重要調(diào)控通路。VEGFR2是VEGF/VEGFR通路的重要因子，參與調(diào)節(jié)乳腺癌新生血管微循環(huán)滲透性及內(nèi)皮細胞增殖、遷移和侵襲等[4]。本研究對VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌的研究進展進行綜述。

1 靶向超聲造影的作用原理

超聲造影由微泡振蕩產(chǎn)生非線性聲增強超聲信號，通過特定脈沖序列包括諧波濾波器、脈沖反向、波幅調(diào)制等區(qū)分微泡信號與周圍組織及血流信號。超聲造影劑是由脂質(zhì)、白蛋白或多聚物等包裹惰性氣體形成的微泡[5]，直徑小于10 μm，可自由通過毛細血管，且不會滲出血管，從而將不同疾病的靶向生物標(biāo)記物連接于微泡表面[6]。在診斷疾病過程中，靶向超聲造影劑可與血管內(nèi)皮靶點特異結(jié)合，以超聲信號強度的變化反映靶點分子表達水平[7-8]，進而反映局部組織微血管循環(huán)。

靶向超聲造影需在超聲造影產(chǎn)生增強超聲信號的基礎(chǔ)上進一步區(qū)分結(jié)合微泡與非結(jié)合微泡產(chǎn)生的聲信號。目前主要通過超聲靶向微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)延長聲信號采集時間，以區(qū)分結(jié)合微泡與非結(jié)合微泡產(chǎn)生的聲信號，即隨著采集時間延長，自由流動的非結(jié)合微泡被從目標(biāo)區(qū)域清除；隨后采用高機械指數(shù)破壞聲場區(qū)的結(jié)合微泡，計算破壞前后靶向聲信號差(differential targeted enhancement, dTE)，以dTE值表示結(jié)合微泡產(chǎn)生的聲信號強度[9]。

2 VEGFR2靶向超聲造影用于乳腺癌診斷的原理

在乳腺纖維腺瘤、導(dǎo)管內(nèi)原位癌及浸潤性乳腺癌等組織中均存在VEGFR2表達。VEGFR2表達水平變化與腫瘤病理分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等密切相關(guān)[10]。既往研究[11]表明，檢測腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞VEGFR2表達水平可用于區(qū)分乳腺纖維腺瘤與惡性腫瘤，且診斷準(zhǔn)確率高于αVβ3整合素及局部血管密度計數(shù)。局部血管密度計數(shù)只納入CD31陽性血管，計數(shù)的血管數(shù)量接近具有灌注功能的血管數(shù)，即常規(guī)超聲造影產(chǎn)生聲信號的血管數(shù)，提示常規(guī)超聲造影對區(qū)分浸潤性乳腺癌與乳腺纖維腺瘤及導(dǎo)管內(nèi)原位癌的應(yīng)用價值較低[12]。VEGFR2靶向超聲造影劑可與病灶血管內(nèi)皮細胞VEGF特異結(jié)合，并滯留于血管內(nèi)皮細胞，增強靶區(qū)超聲回波信號。VEGF2靶向超聲造影以非侵入性方法定量分析新生血管分子標(biāo)記物VEGFR2表達，可從分子水平反映腫瘤新生血管增生情況[13]。

3 VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌的實驗研究及臨床研究

3.1 細胞實驗 細胞實驗可直觀反映VEGFR2靶向超聲造影劑與單一細胞間的結(jié)合情況及特異性識別靶點能力。在VEGFR2靶向超聲造影細胞實驗中，主要選擇人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVEC)、小鼠SVR血管肉瘤細胞等VEGFR2高表達細胞，同時選取小鼠乳腺癌4T1細胞等不表達VEGFR2的細胞作為對照，以檢測靶向微泡對VEGFR2的識別能力。VEGFR2靶向超聲造影劑與其高表達細胞具有良好的結(jié)合力，且結(jié)合力與VEGFR2表達水平相關(guān)[14]。Pochon等[15]發(fā)現(xiàn)VEGFR2靶向超聲造影劑可與HUVEC結(jié)合，采用足量VEGFR2單克隆抗體對HUVEC進行預(yù)飽和，再加入VEGFR2靶向超聲造影劑，結(jié)果顯示造影劑與HUVEC未結(jié)合，表明VEGFR2靶向超聲造影劑具有特異性識別VEGFR2的能力。Willmann等[16]采用VEGFR2及αVβ3整合素雙靶點靶向超聲造影劑對小鼠SVR細胞和4T1細胞進行研究，證實雙靶點靶向超聲造影劑可與SVR細胞特異性結(jié)合，且結(jié)合力顯著高于4T1細胞；同時雙靶點靶向超聲造影劑與SVR細胞的結(jié)合力顯著高于單靶點造影劑，提示存在VEGFR2及其他靶點的靶向超聲造影劑與靶向微泡的結(jié)合力增加。

3.2 動物實驗 Lee等[17]對67NR乳腺癌細胞小鼠移植瘤模型的研究表明，VEGFR2靶向超聲造影劑在腫瘤內(nèi)的滯留時間顯著高于非靶向微泡；定量分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細胞VEGFR2靶向超聲造影劑滯留產(chǎn)生的聲信號強度與VEGFR2表達水平具有相關(guān)性，非靶向微泡滯留產(chǎn)生的聲信號強度低且與VEGFR2表達水平無關(guān)。Pochon等[15]在大鼠乳腺脂肪墊下種植13762 MAT B Ⅲ CRL-1666大鼠乳腺癌細胞8天后，VEGFR2靶向超聲造影檢查發(fā)現(xiàn)直徑約5～8 mm的乳腺腫塊。Bzyl等[18]對MCF-7人源性乳腺癌小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR2靶向超聲造影產(chǎn)生的聲信號dTE值可鑒別直徑約2 mm的乳腺癌與正常乳腺腺體；隨著腫瘤體積的增加，VEGFR2靶向超聲造影產(chǎn)生的聲信號強度下降，但仍較非靶向微泡聲信號強度高；VEGFR2免疫組織化學(xué)結(jié)果證實隨著腫瘤體積增大，VEGFR2表達水平下降，考慮可能與腫瘤成熟血管增多相關(guān)。Warram等[19]對人乳腺癌MDA-MB-231細胞小鼠移植瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，三靶點靶向超聲造影劑產(chǎn)生的聲信號強度高于雙靶點及單靶點造影劑；提示聯(lián)合使用多種針對腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞的特異性靶向標(biāo)記物，能夠增加靶向超聲造影劑在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的聲信號強度，進一步提高診斷準(zhǔn)確性。

抗血管生成是治療乳腺癌的重要手段，但其療效存在較大個體差異。VEGFR2靶向超聲造影作為一種早期監(jiān)測VEGFR2表達水平的無創(chuàng)方法，可通過觀察血管生成情況反映抗血管生成治療效果，亦可通過評估VEGFR2表達程度評價不同抗血管生成藥物對VEGFR2靶點的作用效果，有助于為乳腺癌制定個體化臨床治療方案。Zafarnia等[20]對小鼠MCF-7乳腺癌模型的研究表明，癌細胞對尼羅替尼(抑制血管成熟)治療可出現(xiàn)短暫應(yīng)答，但隨后腫瘤體積增大、dTE值增加，VEGFR2表達水平升高，導(dǎo)致疾病進展；提示VEGFR2靶向超聲造影可用于評估尼羅替尼抗血管治療效果，可能為闡明尼羅替尼耐藥機制提供依據(jù)。

4 VEGFR2靶向超聲造影診斷乳腺癌的臨床研究

生物素-親和素連接法是制備靶向超聲造影劑最具代表性的方法，但人體易對親和素產(chǎn)生嚴重的免疫反應(yīng)。BR55是獲批應(yīng)用于臨床的磷脂類VEGFR2靶向超聲造影劑，其使用多聚短肽作為連接體，避免了親和素導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。目前已完成的BR55Ⅱ期臨床試驗[21]結(jié)果顯示，93%乳腺癌患者VEGFR2表達水平與dTE值具有一致性，乳腺癌區(qū)域超聲滯留聲信號強度為周圍正常乳腺組織的8倍，且患者均未出現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)。

5 問題與展望

研究靶向超聲造影有利于無創(chuàng)分子診斷技術(shù)的發(fā)展，并能提高乳腺腫瘤超聲診斷準(zhǔn)確率。雖然VEGFR2靶向超聲造影對于乳腺癌診斷及預(yù)后評估的研究已取得初步進展，但該技術(shù)仍需改進和完善：①規(guī)范定量分析標(biāo)準(zhǔn)，比較不同研究結(jié)果之間的一致性；②提高VEGFR2靶向微泡在體內(nèi)循環(huán)的時間及穩(wěn)定性，增加微泡延遲成像信號強度；③增加微泡與目標(biāo)靶點的結(jié)合力，微泡與腫瘤的多靶點結(jié)合以增加靶向微泡的特異性；④探索其對乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值。

VEGFR2靶向超聲造影時，需對超聲造影圖像進行定量分析，以區(qū)分表達VEGFR2的良性和惡性腫瘤，包括計算各種灌注參數(shù)和閾值等。VEGFR2靶向超聲造影用于診斷乳腺癌或療效評估時，可考慮將其與3D成像、超聲探頭自動掃描成像及計算機輔助檢測等技術(shù)相結(jié)合，以減少對操作者的依賴性，提高診斷準(zhǔn)確性和臨床可操作性。此外，保證VEGFR2靶向超聲造影圖像與免疫組化分析方面的一致性，也是推動其走向臨床的關(guān)鍵。