張 慧,朱 薇*,韓 騰,王慶軍
(1棗莊市特色果品工程推廣站,山東棗莊 277000;2棗莊市石榴研究中心)
石榴(Punica granatum L.)屬被子植物門,雙子葉植物綱,原始花亞綱,為千屈菜科(Lythraceae)石榴屬(Punica L.)落葉灌木或小喬木。石榴在中文版《中國植物志》中歸屬于石榴科石榴屬植物,而新版《Flora of China》將石榴屬歸并到千屈菜科[1]。石榴又稱安石榴、涂林、丹若、海榴等,原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等地,向東傳播到東亞等國,向西傳播到地中海地區(qū)及美洲各適生地[2,3]。在長期栽培中,因基因突變、天然雜交、人工選擇形成了豐富的種質(zhì)資源,在全世界范圍內(nèi)有1000多個(gè)石榴品種及野生型品種[4]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是石榴分子資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究的有力工具,能夠直接從DNA分子水平上反映各材料間的遺傳差別。本文系統(tǒng)地介紹了國內(nèi)外ISSR分子標(biāo)記在石榴分子資源遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展,以期為石榴種質(zhì)資源的收集、保存、遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定等研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。
ISSR(簡單重復(fù)序列)分子標(biāo)記技術(shù),是由Zietkiewicz等[5],在1994年以DNA重復(fù)序列為重點(diǎn),基于一種SSR微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù),被人工合成的16~18個(gè)SSR序列,在其3′端或5′端加錨1~4個(gè)嘧啶堿基或嘌呤,使用引物對反向排列SSR的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對其電泳、染色,通過譜帶的相對位置和有無,來研究不同試材間的多態(tài)性,ISSR分子標(biāo)記技術(shù)采用重復(fù)序列技術(shù)組合和PCR技術(shù)建立起來的一種廣泛用于于石榴中微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)[6]。ISSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)如下∶ISSR分子標(biāo)記技術(shù)克服了RAPD、AFLP、RFLP和SSR的技術(shù)性缺點(diǎn),具有經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、易操作、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性高、無需測序和克隆等優(yōu)勢。
遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分,一個(gè)物種的遺傳多樣性越豐富,適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)[7]。
王慶軍等[8]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對山東和美國等地的35個(gè)觀賞石榴品種的遺傳關(guān)系及分類分析。通過篩選出8條多態(tài)性高的ISSR引物對35個(gè)觀賞石榴品種進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增出168個(gè)基因位點(diǎn),其中158個(gè)為多態(tài)性基因位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)比高達(dá)94.05%。平均有效等位基因數(shù)1.6785、平均觀察等位基因數(shù)1.9405、平均Shannon信息指數(shù)0.5530、平均Nei's基因多樣性指數(shù)0.3799。35個(gè)觀賞石榴品種間遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.4167~0.9226,說明其品種間具有豐富的遺傳多樣性。馬麗等[9]以65個(gè)果用石榴品種為材料,采用ISSR分子標(biāo)記研究了果用石榴類群品種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。結(jié)果表明∶通過篩選出10條多態(tài)性高的ISSR引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增出186個(gè)DNA位點(diǎn),其中161個(gè)為多態(tài)性DNA位點(diǎn),多態(tài)性位點(diǎn)比高達(dá)86.56%,等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon 信息指數(shù)分別為∶1.8656、1.3119、0.2092、0.3389。65個(gè)果用石榴品種間遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.478~0.995,說明其品種間具有豐富的遺傳多樣性。Narzary等[10]通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對49個(gè)印度野生石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,通過篩選出17條多態(tài)性高的ISSR引物對49個(gè)印度野生石榴品種進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增出308個(gè)基因位點(diǎn),其中268個(gè)為多態(tài)性基因位點(diǎn),多態(tài)性率高達(dá)87.01%,多態(tài)性介于71.43~100.00之間,平均觀察等位基因數(shù)1.3375、平均有效等位基因數(shù)1.2250、平均Nei's基因多樣性指數(shù)0.1250、平均Shannon信息指數(shù)0.1888,遺傳距離分布范圍為0.05~0.45,平均是0.25,表明野生石榴遺傳多樣性較高。趙麗華[11]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析中國石榴居群遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR。結(jié)果表明∶7個(gè)石榴種群遺傳多樣性從小到大依次為∶新疆種群、四川種群、安徽種群、河南種群、云南種群、陜西種群、山東種群;7個(gè)石榴種群間的基因分化系數(shù)是0.1911,表明種群間的遺傳變異占總遺傳變異比率為19.11%,種群內(nèi)的遺傳變異占總遺傳變異比率高達(dá)81.89%,種群間表現(xiàn)較低遺傳分化;7個(gè)石榴群間基因流的估測值是2.1169,遺傳相似性分布范圍為0.9218~0.9759,表明石榴種群間具有很高的遺傳相似性及強(qiáng)大的基因流,因此石榴品種間的遺傳多樣性才能夠得以維持。王慶軍等[12]還篩選8條ISSR引物對24個(gè)山東石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。擴(kuò)增出178個(gè)基因位點(diǎn),平均每條引物擴(kuò)增出22.25個(gè)基因位點(diǎn),其中多態(tài)性基因位點(diǎn)122個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)比率是68.54%。平均有效等位基因數(shù)1.3790、平均觀察等位基因數(shù)1.6854、平均Shannon信息指數(shù)0.3453、Nei’s基因多樣性指數(shù) 0.2282;24 個(gè)山東石榴品種的遺傳相似系數(shù)介于0.6742~0.9101,說明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可有效用于山東石榴品種的遺傳多樣性分析。
石榴在長期栽培和傳播過程中,因基因突變、天然雜交、人工選擇形成了豐富的種質(zhì)資源,所以具有比較復(fù)雜的遺傳背景,傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記等在對石榴進(jìn)行分類研究時(shí),均存在一定的缺陷,不具備很強(qiáng)的說服力,而從DNA層面進(jìn)行研究的ISSR標(biāo)記技術(shù)可以很好地解決這一問題。
Ghobadi等[13]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出6條引物對24個(gè)伊朗石榴品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析,多態(tài)性條帶是64條,在65%相似性水平下,24個(gè)伊朗石榴品種被分為5個(gè)類群,分析結(jié)果表明,ISSR分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不完全一致。沈進(jìn)[14]采用ISSR技術(shù)篩選出17條引物對中國45份石榴種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析,擴(kuò)增出條帶數(shù)有187,其中多態(tài)性條帶有157條,平均每個(gè)引物11條,多態(tài)性比率高達(dá)83.96%。利用聚類分析,以遺傳距離閥值為19時(shí),45份石榴種質(zhì)被聚為4類,結(jié)果表明ISSR分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不一致,同時(shí)也贊同了Ghobadi等的結(jié)論。趙麗華等[15]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對47個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳關(guān)系分析,47個(gè)石榴品種通過篩選出6條引物進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增出120條基因條帶,其中多態(tài)性條帶有109條,多態(tài)性比率高達(dá)90.83%,平均Nei’s基因多樣度0.1897、平均有效等位基因數(shù)1.2945、平均Shannon信息指數(shù)0.3091、遺傳距離為 0.0750~0.4000,表明 47個(gè)石榴品種間具有比較豐富的遺傳多樣性,利用UPGMA法構(gòu)建分子樹狀圖,以遺傳相似性系數(shù)0.7767為閾值,將47個(gè)石榴品種分為5個(gè)類群,分類結(jié)果與地理和形態(tài)分布無關(guān)。Ajal等[16]篩選出8條引物,利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對摩洛哥27個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,擴(kuò)增出70條條帶,其中61條為多態(tài)性條帶,多態(tài)性率高達(dá)87.14%,多態(tài)性范圍42.86~100.00,遺傳距離介于0.12~1.00,平均為0.67,總基因多樣性參數(shù)為0.35及群體內(nèi)基因多樣性參數(shù)為0.32,且種群間基因流較大為5.8,ISSR聚類結(jié)果表明與品種的地理來源無關(guān),同時(shí)也贊同了趙麗華等[15]的結(jié)論。
隨著對石榴種質(zhì)資源重要性的認(rèn)識不斷加強(qiáng),石榴種質(zhì)資源的收集、保存、合理評價(jià)及有效利用等問題越來越受到石榴種質(zhì)資源相關(guān)部門和工作者的重視。分子生物學(xué)尤其是分子標(biāo)記的發(fā)展為石榴資源提供了更為清晰的遺傳背景,ISSR分子標(biāo)記作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù),在石榴分子資源遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究等方面已取得了較大進(jìn)展與廣泛的應(yīng)用。但與其它果樹相比,ISSR應(yīng)用于石榴研究起步晚,基礎(chǔ)差,仍然存在不足,比如ISSR大部分為顯性標(biāo)記,不能區(qū)分純合體與雜合體,因此在進(jìn)行兩倍體或多倍體物種的種群多樣性研究時(shí),目前還未找到一種合適的數(shù)學(xué)模型來對其數(shù)據(jù)分析[17]。當(dāng)今,由于石榴集經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)、生態(tài)、觀賞等價(jià)值于一體,所以越來越受到消費(fèi)市場的青睞,國內(nèi)外石榴產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展[18]。相信隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn),ISSR分子標(biāo)記技術(shù)憑借其經(jīng)濟(jì)、簡便、快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、節(jié)省時(shí)間、財(cái)力和物力等優(yōu)點(diǎn)必將使其在石榴領(lǐng)域越來越得到廣泛應(yīng)用,特別是應(yīng)用于大批量材料的研究,對石榴種質(zhì)資源研究發(fā)揮更大的作用。